Summary
Metastatik berrak hücreli renal hücreli karsinom kapsamlı bir klinik öncesi araştırma için kapsamlı bir hayvan modeli olmayan bir hastalıktır. Bu protokol hastalık için iki yeni hayvan modelini göstermektedir: ortonik olarak implante edilmiş fare modeli ve tavuk koryoallantoik membran modeli, her ikisi de klinik olgulara benzeyen akciğer metastazı göstermektedir.
Abstract
Metastatik berrak hücreli renal hücreli karsinom (ccRCC) böbrek kanserinin en sık görülen alt tipidir. Lokalize ccRCC olumlu bir cerrahi sonuç vardır. Ancak CCRCC hastalarının üçte birinde akciğerde metastaz gelişir ve bu da hastalar için çok kötü bir sonuçla ilişkilidir. Metastazın moleküler mekanizması bilinmediği için ne yazık ki, bu ölümcül evre için hiçbir tedavi mevcut değildir. Von Hippel-Lindau (VHL) tümör baskılayıcı genin fonksiyon kaybının ccRCC'nin pathognomonic olduğu 25 yıldır bilinmektedir. Ancak ccRCC'nin klinik olarak ilgili transgenik fare modeli oluşturulmamamıştır. Bu protokolün amacı, metastatik ccRCC için yeni kurulan iki hayvan modelini tanıtmak ve karşılaştırmaktır. Bunlardan ilki fare modeline böbrek implantasyonu. Laboratuvarımızda CRISPR gen düzenleme sistemi çeşitli RCC hücre hatlarında VHL genini devre dışı bıraktı. Heterojen ccRCC popülasyonlarının renal kapsüle ortotopik implantasyonu, immünyonlu farelerde sağlam akciğer metastazları geliştiren yeni ccRCC modellerini oluşturmıştır. İkinci model tavuk koryoallantoik membran (CAM) sistemidir. Fare modeliile karşılaştırıldığında, bu model daha fazla zaman, işçilik ve maliyet-etkin. Bu model aynı zamanda sağlam tümör oluşumunu ve intravazasyonunu da destekledi. CAM'de tümörün 10 günlük kısa büyümesi nedeniyle toplanan embriyo dokularında immünohistokimya (IHC) tarafından hiçbir metastaz gözlenmedi. Ancak yumurtadan çıkan tavukta tümör büyümesi iki hafta uzadığında akciğerlerde IHC tarafından mikrometastatik ccRCC lezyonları gözlendi. Bu iki yeni preklinik model metastazın arkasındaki moleküler mekanizmayı daha fazla incelemek ve metastatik ccRCC için yeni tedavilerin geliştirilmesine yönelik yeni, hasta kaynaklı ksenogreftler (PDXs) oluşturmak için yararlı olacaktır.
Introduction
Renal hücreli karsinom (RCC) Amerika Birleşik Devletleri'nde7 en sık görülen kanser. Her yıl, 74.000 Amerikalılar yeni teşhis olduğu tahmin edilmektedir, 14.000 'den fazla ölüm ler için muhasebe (Clear-cell histolojik alt tip, veya ccRCC, en yaygın alt tip, RCC olguların yaklaşık% 80'ini oluşturan. Lokalize maligniteli hastalar nefrektomi ile tedavi edilir ve 5 yıllıksağkalım oranı %73'tür 1. Ancak hastaların %25-30'u akciğerler gibi hayati organlara uzak metastazlar gelişir ve bu da ortalama 13 ay ve 5 yıllık sağkalım oranının sadece %11 ile sonuçlanmasınanedenolur. Metastatik ccRCC için ölümcül sonucu iyileştirmek için metastatik mekanizmanın daha iyi anlaşılması gerekir.
VHL tümör baskılayıcı genin in kaybı insan ccRCC olgularının çoğunda gözlenen bir ayırt edici genetik lezyondur4,5,6,7. Ancak ccRCC'de VHL kaybının kesin onkojenik mekanizması bilinmemektedir. Ayrıca, VHL ifade durumu ccRCC8sonucu tahmin değildir. Özellikle, renal-epitel hedefli VHL nakavt sayısız girişimlere rağmen, bilim adamları farelerde gözlenen preneoplastik kistik lezyonlar ötesinde böbrek anormalliği oluşturmak için başarısız oldu9, PTEN ve p5310gibi diğer tümör baskılayıcıların silinmesi ile kombine bile . Bu bulgular, VHL kaybının tek başına tümörigenez veya sonraki spontan metastaz için yetersiz olduğu fikrini desteklemez.
Son zamanlarda, laboratuvarımız yeni bir VHL knockout (VHL-KO) hücre hattı murine VHL + ccRCC hücre hattında VHL geninin CRISPR / Cas9 aracılı silme kullanarak oluşturulan11,12. Biz VHL-KO sadece mezenkimal olduğunu gösterdi, ama aynı zamanda mezenkimal geçiş epitel teşvik (EMT) VHL-WT hücrelerinin12. EMT metastatik süreçte önemli bir rol oynadığı bilinmektedir13. Çalışmalarımız ayrıca uzak akciğer metastazının sadece böbrekteki VHL-KO ve VHL-WT hücrelerinin birlikte implantasyonu ile oluştuğunu ve metastazın ortak mekanizmasını desteklediğini göstermiştir. Daha da önemlisi, ortotokik olarak implante edilen VHL-KO ve VHL-WT modelimiz, klinik ccRCC olgularını özetleyerek sağlam akciğer metastazlarına yol açabilmiştir. Bu spontan metastatik ccRCC modeli, özellikle yeni anti-metastaz ilaçlarının geliştirilmesinde transgenik metastatik fare modelinin eksikliğini telafi eder. Bu protokol, genetik mühendisliği renca hücrelerinin heterojen hücre popülasyonlarının renal kapsül implantasyonunu göstermektedir.
Tavuk CAM modelleri, Tablo 114,15,16,17,18'deözetlendiği gibi, çok sayıda avantajı nedeniyle anjiyogenez ve tümör biyolojisi araştırmalarında uzun bir geçmişe sahiptir. Kısaca, CAM tümör büyümesi için zaman penceresi kısa, CAM tavuk16kuluçka üzerine yok olana kadar 11 gün maksimum izin . Kısa büyüme süresine rağmen, tavuk embriyosu zengin beslenme kaynağı ve immünoeksik devlet çok verimli tümör engraftment 16 ,19,20,21sağlar. Son olarak, her döllenmiş yumurta maliyeti ~ $ 1, üzerinde 100 $ bir SCID fare için karşılaştırıldığında. Birlikte, CAM modeli fare ile karşılaştırıldığında zaman ve maliyet büyük bir tasarruf yeni PDXs kurulmasında değerli bir alternatif hayvan modeli olarak hizmet verebilir. Bu protokolde, modelin fare ortotopik modelinde gözlenen metastatik ccRCC'nin biyolojisini özetleyip özetleyemeyeceğini değerlendirdik.
| (SCID) Fare | CAM | Not | |
| Maliyet | >Her biri 100$ | ~$1'er | %50-75 arasında değişen canlılık |
| Bariyer muhafazaihtiyacı | Evet | № | Daha fazla maliyet azaltır ve tümörlerin seri izleme kolaylaştırır |
| Tümör doğrudan görünür | № | Evet | Şekil 3A |
| İlk engraftment zamanı (RENCA) | 2 hafta | 2-4 gün | hakem 14, 15 |
| Büyümenin bitiş noktası (RENCA) | 3-6 hafta | 10 gün | hakem 14, 15 |
| Metastaz (RENCA) gözlendi | Evet | Evet civciv | Şekil 3D |
| Seri pasajlar | Evet | Evet | ref 16-18 |
| Farelere Geçiş (RENCA) | Evet | Evet | Hu, J., ve diğerleri gözden geçiriliyor (2019) |
| Tümör heterojenliğini koruyun | Evet | Evet | Hu, J., ve diğerleri gözden geçiriliyor (2019) |
Tablo 1: Fare ve CAM modellerinin avantajları ve sınırlamaları. Bu tablo, iki modeli, gerekli zaman, maliyet, işçilik ve biyoloji açısından avantajları ve sınırlamaları açısından karşılaştırmaktadır. CAM modeli verimlilik avantajları vardır, ama aynı zamanda kuşlar ve memeliler arasındaki farklı morfolojinedeniyle kendi benzersiz sınırlamaları vardır. Bu nedenle, modelkenogreftlerin biyolojisini koruyabileceğini doğrulamak önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler, UCLA Şansölyehayvan Araştırma Komitesi (ARC) (ARC 2002-049-53 ve ARC 2017-102-01A) olarak belirlenen Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. 2002-049-53 protokolü, ccRCC tümör hücrelerinin Nude veya BALB/c farelerin böbrek kapsülüne yerleştirilmesi için optimize edilebiyi optimize edeildi. Yumurtadan çıkmadan önce döllenmiş tavuk yumurtalarında tümör implantasyonu deneyleri IACUC onayı gerektirmez. Akciğer metastazı kurulması için süre uzatmak için, CAM tümörlü embriyolar yumurtadan ve tavuk içine büyümeye izin verilir. 2017-102-01A protokolü bu hayvan deneylerini kapsamaktadır.
1. Farelerde ortotopik tümör çalışmaları
NOT: Bu denemenin zaman çizelgesi Şekil 1A'dagösterilmiştir. Bu yordamlar önceki yayınlardan uyarlanmıştır11,12.
- Aşılama için tek hücreli süspansiyon un hazırlanması
- RENCA VHL-WT ve VHL-KO hücrelerini tripsin/EDTA kullanarak kültür yemeklerinden ayırın.
- Hücreleri hemositometre ile sayın ve önceden soğutulmuş 1:1 PBS ve hücre dışı matriks çözeltisi karışımında 1 x 105 hücre/μL konsantrasyonda yeniden askıya alın.
NOT: Heterojen implantlar için 1:4 vhl-WT:VHL-KO hücreleri ve homojen implantlar için tek başına VHL-WT kullanın. - Yeniden askıya alınan hücreleri 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın ve implantasyona kadar buzda tutun.
- Böbrek kapsülüne implantasyon
- Anestezi: Sıcak bir pedi 37 °C'ye ısıtın ve üzerini kalın steril bir perde ile kapatın. Fareyi indüksiyon odası veya intraperitoneal (IP) enjeksiyonu ile 10 mL/kg dozajında %1 pentobarbital sodyum ile anestezi edin.
- Cerrahi alandaki saçı tıraş edin. Bu adım çıplak fareler için atlanabilir.
- Dezenfeksiyon ve cerrahi draping: Povidone-iyot 3x ile tamamen farenin arka dezenfekte 70% etanol 1x takip ve steril pamuk bezleri ile kuru silin. Daha sonra bir cerrahi alan oluşturmak ve fareim immobilize etmek için tüm geri kapsayan, sırayla üç steril tıbbi pansuman uygulayın.
- Kesi ve böbrek dışlaşması: Operasyondan önce operatörün parmaklarını povison-iyot ile dezenfekte edin veya steril eldiven kullanın. Fareyi yatkın konuma getirin ve sol kanadın altında sol böbreği bulmak için parmakları kullanın. Belirtilen yerin altındaki cildi ve kas tabakasını kesmek için bir çift künt çözgü ve makas kullanın. Kısmen karın dışında sol böbrek dışlaştırmak için steril pamuk lu bezler ve forceps kullanın.
- Tümör hücre implantasyonu: Adım 1.1'de hazırlanan hücre süspansiyonunu insülin şırıngalarına veya özelleştirilmiş Hamilton şırıngalarına yükleyin (spesifikasyonlar için Malzeme Tablosu'na bakın). Böbrek kapsülünün altına 20 μL'lik resuspended hücreleri enjekte edin.
NOT: Başarılı enjeksiyon böbrek yüzeyinde yarı saydam bir şişkinlik oluşumu ile belirlenir. Böbrek parankimine kazara enjeksiyon, enjeksiyon yerinde ölümcül kanamaya bağlı olarak kanama ve ameliyat sonrası mortalite oranının %90'a varan oranda düşmesi ile sonuçlanır. - Hücre dışı matriks çözeltisinin kanama yı veya tümör hücre sızıntısını sağlamlaştırması ve önlemesi için iğneyi yavaşça çekin. Sonra, steril bir pamuklu bez kullanarak, geri karın içine böbrek itin.
- Yara dikiş: Kas tabakası dikiş için 5-0 kaplı VICTRYL sütür kullanın. Bir kez povidone-iyot ile cildi dezenfekte ve yara autoclips ile cildi kapatın.
- Kurtarma: Fareyi uyanana kadar sıcak pedin üzerine yerleştirin. Fare teneffüs ile anestezi edildiyse, isoflurane'yi geri çekin ve uyanana kadar fareyi sıcak pedüzerinde tutun.
- Biyolüminesans görüntüleme (BLI) ve doku toplama
- Tümör implantasyonundan altı hafta sonra, ateş böceği-luciferase tabanlı BLI görüntüleri alın. Sonra izofluran inhalasyonu ile fare ötenazi ve servikal çıkış takip.
- Akan sitometri ile dolaşımdaki tümör hücresi (CTC) tespiti için kan toplayın.
- Hasat tümör ve ilgi organları (böbrekler, akciğerler, karaciğer, bağırsak, ve dalak) steril doku hasat tekniği kullanılarak22. Parafin-balmumu gömme için bir gecede% 4 paraformaldehit onları düzeltin.
2. CAM tümör ksenogreft modeli
NOT: Bu yordamlar uyarlanmış ve daha önce yayımlanmış protokolleri23,24değiştirilmiştir. Bu yordamın zaman çizelgesi Şekil 1B'degösterilmiştir. Bu makalede yalnızca kolaylaştırılandırılan protokolü sunar. Ayrıntılı protokoller için, lütfen25.
- Preincubaation: 7 gün boyunca 37 °C ve%55-65 nem de dönen bir yumurta kuluçka içinde taze döşenmiş, döllenmiş tavuk yumurtası kuluçka.
- CAM ve açık pencere (gelişim gün 7) bırakın:
- Hava kesesini ve damarları bulun ve işaretleyin.
NOT: Genellikle yumurtaların %10-15'i döllenmeden sonra 7 gün içinde döllenmedikleri veya öldükleri için çıkarılır. - İşaretli bir damarın üzerine yeni bir hava kesesi oluşturun.
- Yeni hava kesesini ölçün, paketleme bandı uygulayın ve yumurtaları kuvöze geri koyun.
NOT: Yordam burada duraklatılmış olabilir. Hava kesesinin hareket edebileceğinden, aynı gün içinde işlemlere devam etmesi önerilir. - Bir pencere açın: Kavisli mikrodissecting makası ve iğne burun lu bir çift forceps kullanarak, kabuk içinde 1,5 x 1,5 cm dairesel bir pencere kesti.
NOT: CAM bozulması kan ve kesilmiş kabuk parçası üzerinde CAM mevcut bir parça ile gösterilir. - Deliği şeffaf tıbbi pansumanla kapatın ve yumurtaları 37 °C ve %55-65 nemde sabit bir kuluçka makinesine yerleştirin.
NOT: Adım 2.1'deki gibi aynı yumurta kuluçka makinesini kullanın. Sabit olması için rotator'u kapatın.
- Hava kesesini ve damarları bulun ve işaretleyin.
- Sağlık kontrolü (gelişimsel gün 9): Ölü yumurtaları çıkarın ve sonra tümör hücresi implantasyonu için yumurtaların geri kalanını rastgele gruplayın.
NOT: İdeal olarak, bu noktada sağkalım oranı gelişim sel gün 0 yaklaşık% 80'dir. - Tümör hücrelerinin yeni maruz kalan CAM'e aşılanması (gelişimsel gün 10)
- Ekstrasellüler matriks çözeltisini önceden soğutulmuş RPMI 1640 hacminin iki katı (L-glutamin ile) seyreltin. 2 x 104 hücre/l konsantrasyonuna ulaşmak için RENCA hücrelerini ayırın ve yukarıdaki çözeltide yeniden askıya alın.
NOT: Heterojen implantlar için 1:1 vhl-WT:VHL-KO hücreleri ve homojen implantasyon için tek başına VHL-WT kullanın. - Hücre süspansiyonuna üstünlük sağlamak için, her hücre karışımının 100 μL'sini 200°L pipet uçlarında doldurun ve 15 dakika boyunca bir hücre kuluçka makinesine yerleştirin.
- Cam yüzeyindeki her yumurta için pencereden 100 μL hücre süspansiyonu yerleştirin.
NOT: Bazı protokoller implantasyon dan önce CAM çizilme gerektirir23. Bu RENCA hücreleri için gerekli değildir, çünkü çok hızlı büyürler.
- Ekstrasellüler matriks çözeltisini önceden soğutulmuş RPMI 1640 hacminin iki katı (L-glutamin ile) seyreltin. 2 x 104 hücre/l konsantrasyonuna ulaşmak için RENCA hücrelerini ayırın ve yukarıdaki çözeltide yeniden askıya alın.
- CAM'deki hücreleri 10 gün boyunca büyütün ve 2 günde bir fotoğraf çekin.
- Ötenazi ve tümör, kan ve organları hasat.
- Gelişim günü 20 (tümör gün 10), bir heparinize 10 mL şırınga ile korallantotik ven yoluyla kan toplamak.
- 15 dakika buz üzerine koyarak embriyolar ötenazi.
- Tümörleri hasat edin ve tartar. Fareler için kullanılan benzer steril doku hasat tekniği kullanarak akciğer ve karaciğerleri diseksiyon22.
NOT: Tavuk karaciğerlerinde karın boşluğunda görülen ilk organlar olan iki lob vardır. Bunları akciğerlerle karıştırmayın. Tavuk akciğerlerkalp ve septum altında yer almaktadır26. Akciğerlerin başarılı toplama maruz kaburga ile teyit edilebilir. - Parafin-balmumu katıştırma için bir gecede% 4 paraformaldehit tümörler ve parçalanmış organları düzeltmek.
- Tavukları yumurtadan çıkar.
- Uzun süreli tümör büyümesi için kuluçkaya 21 gün boyunca devam edin ve tavukların 37 °C'de ve en az %60 nemde yumurtadan çıkmasını bekleyin.
NOT: Tavuklar 21. Bu durumda, yumurta kabukları çatlama bazı yardımcı olur. Tavukların kuluçka işlemini 24 saat içinde tamamlamaları önemlidir, çünkü o andan sonra besin yetersizliğinden ölürler. - Bir hayvan tesisinde (2017-102-01A) 2 hafta boyunca tavuk yetiştirin.
- Gelişim günü 34 (tümör gün 24), izofluran inhalasyonu ile civciv ötanazi servikal dislokasyon takip.
- Fareler için kullanılan benzer steril doku hasat tekniği kullanarak akciğerleri incelemek22. Sonra, parafin-balmumu gömme için bir gecede% 4 paraformaldehit onları düzeltmek.
- Uzun süreli tümör büyümesi için kuluçkaya 21 gün boyunca devam edin ve tavukların 37 °C'de ve en az %60 nemde yumurtadan çıkmasını bekleyin.
3. İmmünohistokimya
NOT: Tüm doku kesitleri ve H&E boyama, Los Angeles California Üniversitesi'ndeki Translational Patoloji Çekirdek Laboratuvarı (TPCL) tarafından yapılmıştır.
- 20 dakika boyunca 65 °C'de kızakları pişirin ve ksilen kullanarak 3x deparafinize edin ve %100 etanolten suya seri olarak rehidrat.
- 25 dakika boyunca bir sebze buharlı haşlanmış bir sitrat tampon antijenleri alın.
- Engelleme için %1 BSA uygulayın. Daha sonra PBS'de 1:200 seyreltme oranında hazırlanan birincil antikorları (anti-VHL, anti-HA, anti-flag) uygulayın. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
- TBST (her biri 7 dk) ile 3x yıkadıktan sonra, 1:200 seyreltme de ikincil antikor ile slaytlar inkübat. TBST ile 3x yıkayın (her biri 7 dk) ve hematoksilin karşı boyama ardından DAB reaktifleri uygulayın.
4. Akış Sitometri
- Fare veya tavuk kanını üreticinin protokolüne göre kırmızı kan hücresi (RBC) lisis tamponu ile işleyin.
NOT: Cam kanını analiz ederken yeterli RBC lysis özellikle önemlidir çünkü tavuk RBC'leri çekirdeklidir ve ileri ve yan dağılım kullanılarak akış sitometrisinde kolayca ayırt edilemez. - Kan dolaşımında akış sitometrisi çalıştırın ve mStrawberry ve EGFP ekspresyonuna ait verileri analiz edin.
- Birincil kapıları enkaz, ölü hücreler ve unlysed RBC'ler hariç ileri ve yan dağılıma göre ayarlayın.
- Floresan kapılarını lekesiz numunelere ve tek lekeli kontrollere göre ayarlayın. VHL-WT, VHL-KO veya etiketlenmemiş RENCA hücreleri ile astarlanmış kan lysate kullanın tek lekeli kontroller ve lekesiz kontroller sırasıyla.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aksi belirtilmedikçe her deneme en az 3x gerçekleştirildi. Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur. Önemi, iki grup varken eşleştirilmiş, Öğrencinin T-testi veya üç veya daha fazla grup varken tek yönlü bir ANOVA ile belirlenmiştir. Önemi belirlemek için 0,05 p değeri kesintisi kullanıldı.
Ortonik implante RENCA hücreleri başarıyla fare böbreklerinde büyüdü, BLI ve H & E boyama tarafından doğrulandı(Şekil 2A-B). Primer büyümede bir fark olmamasına rağmen, H&E boyamada çok güçlü BLI sinyali ve metastatik nodüller ile belirtildiği gibi akciğerde sadece heterojen, metastatik tümörde sağlam metastaz vardı. Öte yandan homojen, metastatik olmayan tümörler uzak organlara metastaz yapmadı. Metastatik tümör taşıyan farelerde CTC sayıları nonmetastatik tümörlere göre daha yüksekti(Şekil 2C-D).
CAM sistemi, fare modeli ile uyumlu olarak RENCA tümörlerinin büyüme ve metastatik davranışını başarıyla korumuştur. Metastatik ve nonmetastatik tümörler arasında büyüme farkı olmamasına neden olmakla birlikte, metastatik tümörlü yumurtalarda BTK sayıları metastatik olmayan muadillere göre anlamlı olarak yüksekti(Şekil 3A-C). CAM tümörleri ile yumurta hatching ve civciv ek bir iki hafta büyümeye izin metastatik kanser hücrelerinin civciv akciğerhistolojik olarak tespit metastaz kurmak için süre uzatıldı, Tavuk akciğer doku bölümlerinin H & E ve HA leke gösterildiği gibi(Şekil 3D). Metastatik nodüllerin çoğu HA etiketli VHL-WT hücrelerinden oluşurken, farelerde gözlemlediğimiz gibi bayrak etiketli VHL-KO nadiren görüldü.
Şekil 1: Metastatik ccRCC ksenogreftleri için iki hayvan modeline genel bakış. (A) Fare ortotopik modelin şematik gösterimi. 3 veya 4 haftalık fareler ortotoik olarak metastatik veya metastatik tümörlerle implante edilir. İmplantasyondan altı hafta sonra BLI ile tümör büyümesi ve metastaz görüntülendi. Daha sonra tümör, kan ve organlar downstream analizleri için toplandı. (B) CAM modelinin şematik gösterimi aşağıdaki adımları gösterir: Preinkübat, pencere açma, hücre implantasyonu ve kuluçkadan önce veya sonra ötanazi. Fare modeli ile aynı analizler toplanan numuneler için yapılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Ortotok implante edilmiş farelerde tümör büyümesi ve metastaz. (A) Farelerin ve çıkarılan organların (böbrek, akciğer, karaciğer, bağırsak ve dalak) RENCA hücrelerinin ortotopik implantasyonundan 6 hafta sonra BLI. Sol: metastatik olmayan (karşılanmayan), sağ: metastatik. (B) Brüt görünüm ve böbrek ve akciğer için H & E boyama artan büyütme (20x ve 100x). Sol: metastatik olmayan (karşılanmayan), sağ: metastatik. (C) Kanda dolaşan mStraw+ ve EGFP+ hücrelerinin saptanması için temsili akış analizi. (D) Dolaşan mStraw+ ve EGFP+ hücrelerinin yüzde nüfus grafiği. Karşılanmayan: metastatik olmayan. Panel A, Hu ve ark.27'denuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: CAM modelinde tümör büyümesi ve metastaz. (A) KAM'da yetişen RENCA tümörleri. Her grup için 7 tekrar vardı. Karşılanmayan: metastatik olmayan. (B) Kanda dolaşan mStraw+ ve EGFP+ hücrelerinin saptanması için temsili akış analizi. (C) Dolaşan mStraw+ ve EGFP+ hücrelerinin yüzde nüfus grafiği. **p < 0.01. (D) Embriyonik evresinde metastatik tümör taşıyan 2 haftalık bir civcivden akciğerin IHC boyanma. Soldan, bölümlerde H & E, HA ve bayrak boyama gösterir. #: tavuk pulmoner arter; ok ucu: metastatik nodüller. Bu rakam Hu J ve ark.27'denuyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Epitel maligniteleri olan birçok hastada, hayati organlara metastaz mortalitenin birincil nedenidir. Bu nedenle, altta yatan mekanizma ve metastatik hastalık için tedavi yeni bir yol bulmak esastır. Ne yazık ki, ilgili metastatik ccRCC hayvan modellerinin eksikliği vardır. Büyük ölçüde sorun çok sayıda transgenik böbrek epitel hedefli VHL nakavt faremodelleri9,10nesil rağmen farelerde ccRCC yeniden eksikliği kaynaklanmaktadır. Burada, fare ve tavuk CAM olmak üzere iki hayvan sisteminde implante edilebilir metastatik ccRCC tümörü oluşturma yöntemlerini gösteriyoruz. Bu bulgular tümörlerin birbirinden farklı iki ortamda metastatik davranışını doğrular ve böylece metastazın moleküler mekanizmasını daha fazla araştırmak için benzersiz fırsatlar sunmaktadır. İlk modelde heterojen RENCA popülasyonu, immünobetik olarak böbrek kapsülüne ortotonik olarak implante edildi. 6 hafta sonra, bu fareler yaygın akciğer metastazı gösterdi. Fare modeli ile uyum içinde, CAM heterojen RENCA hücrelerinin implantasyonu başarıyla büyüdü ve civciv embriyoların kan içine intravasated. Kuluçkadan sonra tümör büyüme süresi 2 haftaya uzatarak civcivlerde farede görülenlere benzeyen akciğer metastazları gözlendi.
Her iki model için de, hayvan sağkalımını ve başarılı tümör engreftleme ve metastazını artırmak için her adımın teknik detaylarına dikkat etmek ve teknik becerileri geliştirmek için uygulama gereklidir. Fare modeli için, dikkatli ekipman seçimi ve tümör hücrelerinin böbrek kapsülüne doğru enjeksiyonu, ameliyat sonrası mortaliteyi azaltarak ve tümörün yeterli kan akımını arttırma şansını artırarak başarı oranını en üst düzeye çıkarır ve Metastaz. CAM modeli kurulum ve teknik daha fazla optimizasyon gerektirir. Çalışmalarımızda embriyonun canlılığı başlangıçta %30'un altındaydı. İyi ekipmanlara, sık izlemeye ve prosedürlerin daha hızlı tamamlanmasına sahip olarak hem sıcaklığı hem de nemi her zaman istenilen seviyede tutmak önemlidir. Optimizasyondan sonra bile, hayatta kalma kabiliyeti deneyciye ve bireysel yumurta grubuna bağlı olarak %50-75 arasında değişmektedir. Her zaman yedekleme için ekstra yumurta sipariş önerilir. Deneyimlerimize göre, CAM teknikleri mastering 1 yılı aşkın gerektirir. CAM membranının düşmesi ve pencerenin açılması, embriyoda kazara ve ölümcül hasarın en sık meydana geldiği kritik bir adımdır. Civciv embriyocanlılığı CAM zarar önleyerek geliştirilebilir.
CAM tümör modeli için çeşitli sınırlamalar vardır. Birincisi, modelin tüm tümör hücre tiplerine uygulanabilirliğidir. Kam'ta böbrek, mesane ve prostat tümör hücre hatları (RENCA, ACHN, T24, HT1376, CWR22Rv1, C4-2, Myc-CaP) ve yumurtalık kanseri hücre hatları (ID8 ve SKOV3) dahil olmak üzere farklı tümör hücre hatlarını aşılamada %100 başarı oranı elde ettik. Grubumuzdan iki ek çalışmalar bu CAM tümörler i25,27hakkında daha fazla bilgi sağlar. Ancak, CAM bazı yumurtalık kanseri hücrelerinin büyüme büyüme faktörü veya tümör ilişkili hücrelerin takviyesi ile geliştirilmiştir25. Her hücre hattı veya türü için hücre sayısının veya temel büyüme faktörü(ler)in optimizasyonu önemlidir. Ayrıca, hayvanlarda tümörün büyüme ve metastazLarının izlenmesini kolaylaştırmak için luciferase, protein etiketleri (örn. HA veya bayrak) veya floresan etiketleri (örneğin, mStrawberry veya EGFP) gibi muhabir veya marker genlerini de dahil ediyoruz25,27. Deneyimlerimize dayanarak, çoğalan kanser hücre hatlarının büyük bir çoğunluğu CAM kurulabilir. Engraftment için önemli bir sınırlama kısa olabilir 10 gün zaman tümör büyümesi için izin, bu kadar kısa bir süre içinde yeterli kitle kurmak için yavaş büyüyen hücre hattı için özellikle zor olabilir.
CAM modelinin bir diğer eksikliği kuş embriyosu ve memeliler arasındaki fizyoloji farkıdır. CAM tümöründen embriyonun karaciğeri veya akciğerleri gibi büyük organlara metastaz ağırlıklı olarak hassas PCR teknikleri ile tespit edilmiştir28. CAM'de kısa süreli büyüme histolojik analizlerle doğrulanabilecek büyük metastatik lezyonlar ın kurulması için yetersiz olacaktır. Ayrıca, şişirilmemiş embriyo akciğer azaltılmış vasküler perfüzyon kurulması veya akciğer metastazlarının büyümesini desteklemek için olumlu değildir. Bu sınırlamaları aşmak için, kurumsal hayvan kullanım komitesimizden (IACUC) embriyo taşıyan CAM tümöründen tavukları yumurtadan çıkarmak ve yumurtadan çıktıktan 2 hafta sonra onlara ev sahipliği yapmak için onay alındı. Tümör büyüme süresinin bu şekilde uzatılması, IHC tarafından uzak akciğer metastazlarını tespit etmemizi sağladı. Yumurtadan çıkmış tavuk çalışmaları CAM tümör çalışmaları yok ek IACUC onayı gerektirmesine rağmen, bu yaklaşım daha önce farelerde yapılan tavukmetastatik kaskad çalışma için değerli bir fırsat sağlar. Tavuk bağışıklık sistemi gün 12 sonrası döllenme20başlayan geliştirmek bildirilmiştir. Engrafting murine türetilmiş RENCA tümörleri yüksek verimlilik göz önüne alındığında burada rapor ve diğer birçok insan kanser hücresi hatları ve PDXs gün 10 döllenme sonra CAM24,25,27, biz embriyo bağışıklık sisteminin tam olarak bu noktada gelişmiş olmadığını varabiliriz. Tavuğun bağışıklık sistemi ve CAM tümörü arasındaki etkileşim daha fazla araştırma yapılmasını gerektirmekte.
Çalışmamız CAM tümör modeli nin metastaz da dahil olmak üzere kanser biyolojisi üzerinde çalışmak için basit bir in vivo modeli olabileceğine dair güçlü destekleyici kanıtlar sunmaktadır. Yukarıda belirtilen sınırlamalar nedeniyle, CAM modeli fare modelini değiştirmemeli, tamamlanmalıdır. Devam eden araştırmalarımız, ccRCC'deki heterojen hücre popülasyonları arasındaki sinyal çapraz konuşmasının metastatik progresyon11,12'ninyönetilmesinde etkili olduğunu göstermektedir. Hem CAM hem de fare modellerinin kullanımı ccRCC'de metastatik çapraz konuşmayı doğrulamak için değerli bir araç olabilir. Burada sunulan CAM modelinin sayısız avantajlarının, kanserin bu ölümcül evresini düzeltmek için yeni metastatik mekanizmaların ve etkili tedavilerin keşfihızını hızlandırabileceğine inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma UCLA JCCC tohum hibe, UCLA 3R hibe, UCLA CTSI ve UC TRDRP (LW) tarafından finanse edilmiştir. Biz Crump Enstitüsü Preklinik Görüntüleme Tesisi, TPCL ve UCLA Laboratuvar Hayvan Tıbbı (DLAM) Deneysel yöntemlerile yardım için teşekkür ederiz. Akış sitometri ucla Johnson Kapsamlı Kanser Merkezi (JCCC) ve Merkezi AIDS Araştırma Akış Sitometri Çekirdek Tesisi ulusal Sağlık enstitüleri tarafından desteklenen yapıldı P30 CA016042 ve 5P30 AI028697, ve JCCC tarafından, UCLA AIDS Enstitüsü, David Geffen Tıp Fakültesi UCLA UCLA Şansölye Ofisi, ve UCLA Yardımcısı Araştırma Ofisi. İstatistik danışmanlık ve veri analizi hizmetleri UCLA CTSI Biyoistatistik, Epidemiyoloji ve Araştırma Tasarımı (BERD) Programı tarafından sağlanan NIH / Ulusal Merkezi Çeviri Bilim UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881 İlerletme için desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
- Cohen, H. T., McGovern, F. J.
- Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
- Hsieh, J. J., et al.
- Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
- Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
- Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
- Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
- Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
- Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
- Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
- Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032 (2016).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
- Heerboth, S., et al.
- DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
- Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
- Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
- Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
- Solomon, J. B. Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, North-Holland Pub. Co. (1971).
- JoVE Science Education Database.
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815 (2011).
- Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
- Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , In Press (2019).
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
- Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
- Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).
