Summary
Metastasierendes blutestes Nierenzellkarzinom ist eine Krankheit ohne umfassendes Tiermodell für eine gründliche präklinische Untersuchung. Dieses Protokoll veranschaulicht zwei neuartige Tiermodelle für die Krankheit: das orthototisch implantierte Mausmodell und das Hähnchen-Chorioallanto-Membranmodell, die beide Lungenmetastasen zeigen, die klinischen Fällen ähneln.
Abstract
Metastasierendes klarzellrenales Zellkarzinom (ccRCC) ist der häufigste Subtyp von Nierenkrebs. Lokalisiertes ccRCC hat ein günstiges chirurgisches Ergebnis. Ein Drittel der ccRCC-Patienten wird jedoch Metastasen zur Lunge entwickeln, was mit einem sehr schlechten Ergebnis für die Patienten zusammenhängt. Leider gibt es für dieses tödliche Stadium keine Therapie, da der molekulare Mechanismus der Metastasierung unbekannt bleibt. Seit 25 Jahren ist bekannt, dass der Funktionsverlust des von Hippel-Lindau (VHL) Tumorsuppressorgens pathognomisch von ccRCC ist. Es wurde jedoch kein klinisch relevantes transgenes Mausmodell von ccRCC erzeugt. Ziel dieses Protokolls ist es, zwei neu eingerichtete Tiermodelle für metastasierende ccRCC einzuführen und zu vergleichen. Die erste ist die Nierenimplantation im Mausmodell. In unserem Labor wurde das CRISPR-Gen-Editing-System verwendet, um das VHL-Gen in mehreren RCC-Zelllinien auszuschalten. Orthotopische Implantation heterogener ccRCC-Populationen in die Nierenkapsel schuf neuartige ccRCC-Modelle, die robuste Lungenmetastasen bei immunkompetenten Mäusen entwickeln. Das zweite Modell ist das Chicken Chorioallantoic Membrane (CAM) System. Im Vergleich zum Mausmodell ist dieses Modell zeit-, arbeits- und kosteneffizienter. Dieses Modell unterstützte auch eine robuste Tumorbildung und Intravasation. Aufgrund der kurzen 10-tägigen Phase des Tumorwachstums in CAM wurde durch die Immunhistochemie (IHC) in den gesammelten Embryogeweben keine unverhakten Metastasen beobachtet. Als jedoch das Tumorwachstum beim geschlüpften Huhn um zwei Wochen verlängert wurde, wurden mikrometastatische ccRCC-Läsionen von IHC in der Lunge beobachtet. Diese beiden neuartigen präklinischen Modelle werden nützlich sein, um den molekularen Mechanismus hinter Metastasen weiter zu untersuchen und neue, patientenabgeleitete Xenografts (PDXs) zur Entwicklung neuartiger Behandlungen für metastasierendes ccRCC zu etablieren.
Introduction
Nierenzellkarzinom (RCC) ist die7. häufigste Krebsart in den Vereinigten Staaten. Jährlich werden schätzungsweise 74.000 Amerikaner neu diagnostiziert, was mehr als 14.000 Todesfällen entspricht (der histologische Untertyp clear-cell, kurz ccRCC, ist der häufigste Subtyp, der etwa 80% der RCC-Fälle ausmacht. Patienten mit lokalisierter Malignität werden mit Nephrektomie behandelt und haben eine günstige 5-Jahres-Überlebensrate von 73%1. Jedoch, 25%-30% der Patienten entwickeln entfernte Metastasen zu lebenswichtigen Organen wie der Lunge, was zu einem schlechten mittleren Überleben von 13 Monaten und 5-Jahres-Überlebensrate von nur 11%1,2,3. Ein besseres Verständnis des metastasierenden Mechanismus ist erforderlich, um das tödliche Ergebnis für metastasierende ccRCC zu verbessern.
Der Verlust des VHL-Tumorsuppressorgens ist ein Kennzeichen genetischer Läsion, das in der Mehrzahl der menschlichen ccRCC-Fälle4,5,6,7beobachtet wird. Der genaue onkogene Mechanismus des VHL-Verlustes in ccRCC ist jedoch unbekannt. Außerdem ist der VHL-Ausdrucksstatus nicht vorhersagbar für das Ergebnis in ccRCC8. Bemerkenswert ist, dass es den Wissenschaftlern trotz zahlreicher Versuche von renal-epithelialen VHL-Knockout nicht gelungen ist, Nierenanomalien jenseits der präneoplastischen zystischen Läsionen zu erzeugen, die bei Mäusen9beobachtet wurden, selbst wenn sie mit der Deletion anderer Tumorsuppressoren wie PTEN und p5310kombiniert werden. Diese Ergebnisse stützen die Vorstellung, dass VHL-Verlust allein für die Tumorgenese oder die anschließende spontane Metastasierung nicht ausreicht.
Kürzlich hat unser Labor eine neue VHL-Knockout-Zelle (VHL-KO) mit CRISPR/Cas9-vermittelter Deletion des VHL-Gens in der murinen VHL+ ccRCC-Zelllinie (RENCA, oder VHL-WT)11,12erstellt. Wir zeigten, dass VHL-KO nicht nur mesenchymal ist, sondern auch epitheliale zu mesenchymalen Übergängen (EMT) von VHL-WT-Zellen12fördert. EMT spielt bekanntlich eine wichtige Rolle im metastasierenden Prozess13. Unsere Arbeit zeigte weiter, dass entfernte Lungenmetastasen nur mit der Koimplantation von VHL-KO- und VHL-WT-Zellen in der Niere auftreten und einen kooperativen Mechanismus der Metastasierung unterstützen. Wichtig ist, dass unser orthotopisch implantiertes VHL-KO- und VHL-WT-Modell zu robusten Lungenmetastasen führt, die die klinischen ccRCC-Fälle rekapitulieren. Dieses spontane metastasierende ccRCC-Modell kompensiert das Fehlen eines transgenen metastasierenden Mausmodells, insbesondere bei der Entwicklung neuartiger Antimetastasen-Medikamente. Dieses Protokoll zeigt die renale Kapselimplantation der heterogenen Zellpopulationen genetisch entwickelter RENCA-Zellen.
Hühner-CAM-Modelle haben eine lange Geschichte in der Forschung für Angiogenese und Tumorbiologie aufgrund ihrer zahlreichen Vorteile, wie in Tabelle 114,15,16,17,18zusammengefasst. Kurz gesagt, das Zeitfenster für DAS CAM-Tumorwachstum ist kurz, so dass maximal 11 Tage, bis das CAM beim Schlüpfen des Huhns zerstört wird16. Trotz der kurzen Wachstumszeit ermöglichen die reichhaltige Nahrungsversorgung und der immundefiziierende Zustand des Hühnerembryons eine sehr effiziente Tumortransplantation16,19,20,21. Schließlich betragen die Kosten für jedes befruchtete Ei 1 USD, verglichen mit über 100 USD für eine SCID-Maus. Zusammen kann das CAM-Modell als wertvolles alternatives Tiermodell bei der Etablierung neuer PDXs zu einer großen Zeit- und Kostenersparnis im Vergleich zur Maus dienen. In diesem Protokoll haben wir untersucht, ob das Modell in der Lage war, die Biologie des metastasierenden ccRCC zu rekapitulieren, die im orthotopischen Mausmodell beobachtet wurde.
| (SCID) Maus | Cam | Hinweis | |
| Kosten | > 100 € pro Stück | 1 $ pro Stück | Lebensfähigkeit von 50-75% |
| Bedarf an Barrieregehäuse | Ja | Nein | Weitere Kosten reduziert und vereinfacht die serielle Überwachung der Tumore |
| Tumor direkt sichtbar | Nein | Ja | Abbildung 3A |
| Zeit zur ersten Engraftment (RENCA) | 2 Wochen | 2-4 Tage | Ref 14, 15 |
| Endpunkt des Wachstums (RENCA) | 3-6 Wochen | 10 Tage | Ref 14, 15 |
| Metastasen (RENCA) beobachtet | Ja | Ja in Küken | Abbildung 3D |
| Serielle Passagen | Ja | Ja | Ref 16-18 |
| Durchgang zu Mäusen (RENCA) | Ja | Ja | Hu, J., et al. im Rückblick (2019) |
| Erhaltung der Tumorheterogenität | Ja | Ja | Hu, J., et al. im Rückblick (2019) |
Tabelle 1: Vorteile und Einschränkungen der Maus- und CAM-Modelle. Diese Tabelle vergleicht die beiden Modelle hinsichtlich ihrer Vorteile und Einschränkungen in Bezug auf benötigte Zeit, Kosten, Arbeit sowie die Biologie. Das CAM-Modell hat Vorteile in der Effizienz, hat aber auch seine eigenen einzigartigen Grenzen aufgrund der unterschiedlichen Morphologie zwischen Vögeln und Säugetieren. Daher ist es wichtig zu bestätigen, dass das Modell die Biologie der Xenografts beibehalten kann.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt, das als UCLA Chancellor es Animal Research Committee (ARC) (ARC 2002-049-53 und ARC 2017-102-01A) bezeichnet wurde. Das Protokoll 2002-049-53 ist für die Implantation von ccRCC-Tumorzellen in die Nierenkapsel von Nude- oder BALB/c-Mäusen optimiert. Tumorimplantationsexperimente in befruchteten Hühnereiern vor dem Schlüpfen bedürfen keiner IACUC-Zulassung. Um die Zeit für die Etablierung der Lungenmetastasierung zu verlängern, dürfen die Embryonen mit CAM-Tumor schlüpfen und zu Hühnern heranwachsen. Das Protokoll 2017-102-01A deckt diese Tierversuche ab.
1. Orthotopische Tumorstudien an Mäusen
HINWEIS: Die Zeitachse für dieses Experiment ist in Abbildung 1Adargestellt. Diese Verfahren wurden aus früheren Veröffentlichungen11,12angepasst.
- Vorbereitung der einzelzelligen Suspension für die Pfropfung
- Lösen Sie die RENCA VHL-WT- und VHL-KO-Zellen mit Trypsin/EDTA von den Kulturgerichten.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und setzen Sie sie in einer vorgekühlten 1:1-Mischung aus PBS und extrazellulärer Matrixlösung in einer Konzentration von 1 x 105 Zellen/L wieder auf.
HINWEIS: Verwenden Sie ein Verhältnis von 1:4 von VHL-WT:VHL-KO-Zellen für heterogene Implantate und VHL-WT allein für homogene Implantate. - Übertragen Sie die resuspendierten Zellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und halten Sie bis zur Implantation auf Eis.
- Implantation in die Nierenkapsel
- Anästhesie: Ein warmes Pad auf 37 °C vorheizen und mit einem Stück dicken sterilen Vorhangs bedecken. Anästhetisieren Sie die Maus entweder durch Isofluran-Inhalation über eine Induktionskammer oder intraperitoneale (IP) Injektion von 1% Pentobarbital-Natrium in der Dosierung von 10 ml/kg.
- Rasieren Sie die Haare von der chirurgischen Stelle. Dieser Schritt kann für nackte Mäuse übersprungen werden.
- Desinfektion und chirurgische Drapieren: Desinfizieren Sie die Rückseite der Maus vollständig mit Povidon-Jod 3x gefolgt von 70% Ethanol 1x und wischen Sie es mit sterilen Wattestäbchen trocken. Dann tragen Sie drei sterile medizinische Verbände nacheinander, die den ganzen Rücken abdecken, um ein chirurgisches Feld zu schaffen sowie die Maus zu immobilisieren.
- Inzisions- und Nierenexerzitien: Vor der Operation die Finger des Bedieners mit Povidon-Jod desinfizieren oder ein Paar sterile Handschuhe verwenden. Platzieren Sie die Maus in der anfälligen Position und verwenden Sie die Finger, um die linke Niere rechts unter der linken Flanke zu lokalisieren. Verwenden Sie ein Paar stumpfe Zangen und Scheren, um die Haut und die Muskelschicht unter der angegebenen Position zu schneiden. Verwenden Sie sterile Wattestäbchen und Zangen, um die linke Niere teilweise aus dem Bauch herauszudrängen.
- Tumorzellimplantation: Laden Sie die in Schritt 1.1 hergestellte Zellsuspension entweder in Insulinspritzen oder kundenspezifische Hamilton-Spritzen (siehe Materialtabelle für Spezifikationen). Injizieren Sie 20 l resuspendierte Zellen unter die Nierenkapsel.
HINWEIS: Eine erfolgreiche Injektion wird durch die Bildung einer transluzenten Wölbung auf der Nierenoberfläche bestimmt. Die versehentliche Injektion in das Nierenparenchym führt zu Blutungen und einer postoperativen Sterblichkeitsrate von bis zu 90 % aufgrund einer tödlichen Blutung an der Injektionsstelle. - Ziehen Sie die Nadel langsam heraus, damit die extrazelluläre Matrixlösung verfestigt und Blutungen oder Tumorzellaustritte verhindert. Dann, mit einem sterilen Wattestäbchen, drücken Sie die Niere zurück in den Bauch.
- Wundnähte: Verwenden Sie eine 5-0 beschichtete VICTRYL Naht, um die Muskelschicht zu nähen. Desinfizieren Sie die Haut einmal mit Povidon-Jod und schließen Sie die Haut mit gewickelten Autoclips.
- Wiederherstellung: Legen Sie die Maus auf das warme Pad, bis es aufwacht. Wenn die Maus durch Einatmen beästhestisiert wurde, ziehen Sie das Isofluran zurück und halten Sie die Maus auf dem warmen Pad, bis sie wach ist.
- Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) und Gewebesammlung
- Sechs Wochen nach der Tumorimplantation nehmen Sie BLI-Bilder auf Galle-Luziferase-Basis. Dann einschläfern Mäuse mit Isofluran-Inhalation gefolgt von zervikalen Dislokation.
- Sammeln Sie Blut für zirkulierende Tumorzelle (CTC) Detektion durch Durchflusszytometrie.
- Ernte Tumor und Organe von Interesse (Nieren, Lunge, Leber, Darm, und Milz) mit einem sterilen Gewebe Erntetechnik22. Fixieren Sie sie in 4% Paraformaldehyd über Nacht für Paraffin-Wachs-Einbettung.
2. CAM Tumor Xenograft Modell
HINWEIS: Diese Verfahren wurden an die zuvor veröffentlichten Protokolle23,24angepasst und geändert. Der Zeitplan für dieses Verfahren ist in Abbildung 1Bdargestellt. In diesem Artikel wird nur das optimierte Protokoll dargestellt. Ausführliche Protokolle finden Sie in einem weiteren JoVE-Artikel, der von unserer Gruppe25veröffentlicht wurde.
- Vorinkubation: Frisch gelegte, befruchtete Hühnereier in einem rotierenden Eierbrutschrank bei 37 °C und 55-65% Luftfeuchtigkeit 7 Tage lang inkubieren.
- Löschen Sie das CAM und öffnen Sie das Fenster (Entwicklungstag 7):
- Suchen und markieren Sie den Luftsack und die Venen.
HINWEIS: Normalerweise werden 10-15% der Eier entfernt, weil sie entweder unbefruchtet sind oder innerhalb von 7 Tagen nach der Befruchtung sterben. - Erstellen Sie einen neuen Luftsack auf einer markierten Vene.
- Den neuen Luftsack ableiten, Verpackungsband auftragen und die Eier wieder auf den Inkubator legen.
HINWEIS: Das Verfahren kann hier angehalten werden. Es wird empfohlen, die Verfahren innerhalb des gleichen Tages wieder aufzunehmen, da sich der Luftsack bewegen kann. - Öffnen Sie ein Fenster: Schneiden Sie mit einer gekrümmten Mikrosemitsezerse und einer Nadelzange ein 1,5 x 1,5 cm großes rundes Fenster in die Schale.
HINWEIS: Die Störung des CAM wird durch das Blut und ein Stück CAM angezeigt, das auf dem geschnittenen Schalenstück vorhanden ist. - Versiegeln Sie das Loch mit transparentem medizinischen Verband und legen Sie die Eier in einen stationären Inkubator bei 37 °C und 55%-65% Luftfeuchtigkeit.
HINWEIS: Verwenden Sie denselben Eierinkubator wie in Schritt 2.1. Schalten Sie den Rotator aus, um ihn stehen zu lassen.
- Suchen und markieren Sie den Luftsack und die Venen.
- Gesundheitscheck (Entwicklungstag 9): Entfernen Sie tote Eier und gruppieren Sie dann nach dem Zufallsprinzip den Rest der Eier für die Tumorzellimplantation.
HINWEIS: Idealerweise beträgt die Überlebensrate zu diesem Zeitpunkt etwa 80% des Entwicklungstages 0. - Transplantation der Tumorzellen auf das neu exponierte CAM (Entwicklungstag 10)
- Verdünnen Sie die extrazelluläre Matrixlösung in doppeltso viel Volumen des vorgekühlten RPMI 1640 (mit L-Glutamin). Lösen Sie die RENCA-Zellen und setzen Sie sich in der obigen Lösung wieder auf, um eine Konzentration von 2 x 104 Zellen/L zu erreichen.
HINWEIS: Verwenden Sie ein Verhältnis von 1:1 von VHL-WT:VHL-KO-Zellen für heterogene Implantate und VHL-WT allein für homogene Implantation. - Um die Zellsuspension vorzufestigen, füllen Sie 100 l jeder Zellmischung in 200 L Pipettenspitzen und legen Sie sie 15 Min. in einen Zellinkubator.
- Implantieren Sie 100 l Zellsuspension für jedes Ei auf der CAM-Oberfläche durch das Fenster.
HINWEIS: Einige Protokolle erfordern kratzen das CAM vor der Implantation23. Dies ist für RENCA-Zellen nicht notwendig, da sie sehr schnell wachsen.
- Verdünnen Sie die extrazelluläre Matrixlösung in doppeltso viel Volumen des vorgekühlten RPMI 1640 (mit L-Glutamin). Lösen Sie die RENCA-Zellen und setzen Sie sich in der obigen Lösung wieder auf, um eine Konzentration von 2 x 104 Zellen/L zu erreichen.
- Wachsen Sie Zellen auf dem CAM für 10 Tage und fotografieren alle 2 Tage.
- Euthanisieren und ernten Sie den Tumor, Blut und Organe.
- Am Entwicklungstag 20 (Tumortag 10) Blut über die chorioallantoische Vene mit einer heparinisierten 10 ml Spritze sammeln.
- Euthanisieren Sie die Embryonen, indem Sie sie 15 min auf Eis legen.
- Tumoren ernten und wiegen. Sezieren Sie Lungen und Lebern mit einer sterilen Gewebeerntetechnik ähnlich der für Mäuse22.
HINWEIS: Hühnerleber haben zwei Lappen, die die ersten Organe in der Bauchhöhle gesehen sind. Verwechseln Sie diese nicht mit der Lunge. Die Hühnerlungen befinden sich unter dem Herzen und Septum26. Die erfolgreiche Erfassung der Lunge kann durch exponierte Rippen bestätigt werden. - Fixieren Sie die Tumore und die sezierten Organe in 4% Paraformaldehyd über Nacht für Paraffin-Wachs-Einbettung.
- Schlüpfen Sie die Hühner.
- Um eine längere Periode des Tumorwachstums zu ermöglichen, setzen Sie die Inkubation bis zum 21. Tag fort und lassen Sie die Hühner bei 37 °C und mindestens 60% Luftfeuchtigkeit schlüpfen.
HINWEIS: Hühner schlüpfen natürlich nach Tag 21 über einen Zeitraum von 24 h, haben aber gelegentlich Probleme, selbst zu schlüpfen. In diesem Fall hilft das Knacken der Eierschalen. Es ist wichtig für Hühner, den Schraffurprozess innerhalb von 24 h abzuschließen, da sie danach an Nährstoffmangel sterben. - Wachsen Sie die Hühner in einer Tieranlage (2017-102-01A) für 2 Wochen.
- Am Entwicklungstag 34 (Tumortag 24) werden die Küken mit Isofluran-Inhalation, gefolgt von Zervixdislokation, eingeschläfert.
- Sezieren Sie die Lunge mit einer sterilen Gewebeerntetechnik ähnlich denen für Mäuse22. Dann fixieren Sie sie in 4% Paraformaldehyd über Nacht für Paraffin-Wachs-Einbettung.
- Um eine längere Periode des Tumorwachstums zu ermöglichen, setzen Sie die Inkubation bis zum 21. Tag fort und lassen Sie die Hühner bei 37 °C und mindestens 60% Luftfeuchtigkeit schlüpfen.
3. Immunhistochemie
HINWEIS: Alle Gewebeschnitte und H&E-Färbungen wurden vom Translational Pathology Core Laboratory (TPCL) an der University of California, Los Angeles durchgeführt.
- Dias bei 65 °C 20 min backen und 3x mit Xylol deparaffinisieren und seriell von 100% Ethanol zu Wasser rehydrieren.
- Holen Sie die Antigene in einem Citratpuffer, der in einem Gemüsedampfer gekocht wird, für 25 min.
- Wenden Sie 1% BSA für die Blockierung an. Wenden Sie dann die primären Antikörper (Anti-VHL, Anti-HA, Anti-Flag) bei einem Verdünnungsverhältnis von 1:200 in PBS an. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Nach dem Waschen 3x mit TBST (je 7 min), Dias mit dem sekundären Antikörper bei 1:200 Verdünnung inkubieren. 3x mit TBST (je 7 min) waschen und DAB-Reagenzien auftragen, gefolgt von Hämatoxylin-Gegenfärbung.
4. Durchflusszytometrie
- Verarbeiten Sie die Maus oder Hühnerblut mit roten Blutkörperchen (RBC) Lysepuffer nach dem Herstellerprotokoll.
HINWEIS: Eine ausreichende RBC-Lyse ist besonders wichtig bei der Analyse von CAM-Blut, da Hähnchen-RBCs nukleiert sind und in der Durchflusszytometrie mit der Vorwärts- und Seitenstreuung nicht leicht zu unterscheiden sind. - Führen Sie die Durchflusszytometrie auf dem Blutlysat aus und analysieren Sie die Daten für die mStrawberry- und EGFP-Expression.
- Legen Sie die primären Tore basierend auf der Vorwärts- und Seitenstreuung ohne Schutt, abgestorbene Zellen und nicht lysierte RBCs fest.
- Stellen Sie die Fluoreszenztore auf der Grundlage der ungefärbten Proben und einzelnen gebeizten Kontrollen ein. Verwenden Sie Blutlysat, das mit VHL-WT, VHL-KO oder unbeschrifteten RENCA-Zellen grundiert ist, als einzelne gebeizte Und nicht befleckte Kontrollen.
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Representative Results
Jedes Experiment wurde mindestens 3x durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt, Standardabweichung (SD). Die Signifikanz wurde durch einen paired, Student es T-Test bestimmt, wenn es zwei Gruppen gab, oder durch eine einseitige ANOVA, wenn es drei oder mehr Gruppen gab. Zur Ermittlung der Bedeutung wurde ein p-Wert-Cutoff von 0,05 verwendet.
Orthotopisch implantierte RENCA-Zellen wuchsen erfolgreich an den Mäusenieren, wie durch BLI- und H&E-Färbung bestätigt wurde (Abbildung 2A-B). Obwohl es keinen Unterschied im primären Wachstum gab, hatte nur der heterogene, metastasierende Tumor eine robuste Metastasierung der Lunge, wie das sehr starke BLI-Signal und die metastasierenden Knötchen in der H&E-Färbung zeigen. Auf der anderen Seite metastasieren homogene, nichtmetastatische Tumoren nicht zu entfernten Organen. Die CTC-Zahlen waren bei Mäusen mit metastasierenden Tumoren höher als bei Mäusen mit nichtmetastasierenden Tumoren (Abbildung 2C-D).
In Übereinstimmung mit dem Mausmodell konnte das CAM-System das Wachstum und das metastasierende Verhalten der RENCA-Tumoren erfolgreich beibehalten. Während es keinen Wachstumsunterschied zwischen metastasierenden und nichtmetastasierenden Tumoren gab, waren die CTC-Zahlen bei den Eiern mit metastasierenden Tumoren signifikant höher als bei Eiern mit nichtmetastasierenden Gegenstücken (Abbildung 3A-C). Das Schlüpfen der Eier mit CAM-Tumoren und das Wachstum der Küken um weitere zwei Wochen verlängerte den Zeitraum für metastasierende Krebszellen, um histologisch nachweisbare Metastasen in der Lunge von Küken zu etablieren, wie in den H&E- und HA-Färbungen von Hühnerlungengewebeabschnitten gezeigt (Abbildung 3D). Ein Großteil der metastasierenden Knötchen bestand aus HA-markierten VHL-WT-Zellen, während Flaggen-markierte VHL-KO selten gesehen wurden, wie wir bei Mäusen beobachtet haben.
Abbildung 1: Überblick über die beiden Tiermodelle für metastasierende ccRCC-Xenografts. (A) Schematische Darstellung des orthotopischen Mausmodells. 3- oder 4-wochen-alte Mäuse werden orthotopisch mit nichtmetastasierenden oder metastasierenden Tumoren implantiert. Sechs Wochen nach der Implantation wurden Tumorwachstum und Metastasen mit BLI visualisiert. Anschließend wurden Tumor, Blut und Organe für nachgelagerte Analysen gesammelt. (B) Schematische Darstellung des CAM-Modells mit den folgenden Schritten: Vorinkubation, Fensteröffnung, Zellimplantation und Euthanasie vor oder nach dem Schlüpfen. Für die gesammelten Proben werden die gleichen Analysen wie das Mausmodell durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Tumorwachstum und Metastasierung bei orthotopisch implantierten Mäusen. (A) BLI von Mäusen und extrahierten Organen (Niere, Lunge, Leber, Darm und Milz) 6 Wochen nach orthotopischer Implantation von RENCA-Zellen. Links: nichtmetastatisch (nicht met), rechts: metastasierend. (B) Bruttoansicht und zunehmende Vergrößerung der H&E-Färbung für Niere und Lunge (20x und 100x). Links: nichtmetastatisch (nicht met), rechts: metastasierend. (C) Repräsentative Strömungsanalyse zum Nachweis von mStraw+- und EGFP+-Zellen, die im Blut zirkulieren. (D) Prozentuales Bevölkerungsdiagramm der zirkulierenden mStraw+- und EGFP+-Zellen. Nicht erfüllt: nichtmetastatisch. Panel A wurde von Hu et al.27adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Tumorwachstum und Metastasierung im CAM-Modell. (A) RENCA-Tumoren, die in CAM angebaut werden. Es gab 7 Wiederholungen für jede Gruppe. Nicht erfüllt: nichtmetastatisch. (B) Repräsentative Strömungsanalyse zum Nachweis von mStraw+- und EGFP+-Zellen, die im Blut zirkulieren. (C) Prozentuales Bevölkerungsdiagramm der zirkulierenden mStraw+- und EGFP+-Zellen. **p < 0,01. (D) IHC-Färbung der Lunge von einem 2 Wochen alten Küken, das während seines embryonalen Stadiums einen metastasierenden Tumor trägt. Von links zeigen die Abschnitte H&E, HA und Flaggenfärbung. Nr.: Hühner-Lungenarterie; Pfeilspitze: metastasierende Knötchen. Diese Figur wurde von Hu J et al.27adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Für viele Patienten mit epithelialen Malignitäten ist Metastasierung zu lebenswichtigen Organen die Hauptursache für die Sterblichkeit. Daher ist es wichtig, den zugrunde liegenden Mechanismus und einen neuen Therapieweg für metastasierende Erkrankungen zu finden. Leider fehlt es an relevanten metastasierenden ccRCC-Tiermodellen. Die Herausforderung ist zu einem großen Teil auf die Unfähigkeit zurückzuführen, ccRCC bei Mäusen trotz der Erzeugung zahlreicher transgener Nierenepithel-gezielten VHL-Knockout-Mausmodelle9,10nachzubilden. Hier zeigen wir die Methoden zur Etablierung eines implantierbaren metastasierbaren ccRCC-Tumors in zwei Tiersystemen, der Maus und dem Hühner-CAM. Diese Ergebnisse validierten das metastasierende Verhalten der Tumoren in zwei unterschiedlichen Umgebungen und bieten somit einzigartige Möglichkeiten, den molekularen Mechanismus der Metastasierung weiter zu untersuchen. Im ersten Modell wurde die heterogene RENCA-Population immunkompetenten Mäusen orthotopisch in ihre Nierenkapsel implantiert. Nach 6 Wochen zeigten diese Mäuse eine grassierende Lungenmetastasierung. In Übereinstimmung mit dem Mausmodell wuchs die Implantation heterogener RENCA-Zellen auf dem CAM erfolgreich und intravasierte sich in das Blut der Kükenembryonen. Durch die Verlängerung der Tumorwachstumsphase auf 2 Wochen nach dem Schlüpfen wurden Bei den Küken Lungenmetastasen beobachtet, die denen der Maus ähneln.
Für beide Modelle ist eine sorgfältige Aufmerksamkeit auf die technischen Details jedes Schritts und jeder Praxis zur Verbesserung der technischen Fähigkeiten unerlässlich, um das Überleben von Tieren und die erfolgreiche Tumorengraftierung und Metastasierung zu erhöhen. Für das Mausmodell maximiert eine sorgfältige Auswahl der Ausrüstung und eine genaue Injektion der Tumorzellen in die Nierenkapsel die Erfolgsrate, indem sie die postoperative Sterblichkeit verringert und die Wahrscheinlichkeit für den Tumor erhöht, eine ausreichende Blutversorgung zu erhalten, um zu wachsen und metastasize. Das CAM-Modell erfordert mehr Optimierung in der Einrichtung und der Technik. In unseren Studien lag die Lebensfähigkeit des Embryos zu Beginn unter 30 %. Es ist wichtig, sowohl die Temperatur als auch die Luftfeuchtigkeit jederzeit auf dem gewünschten Niveau zu halten, indem Sie über eine gute Ausrüstung, häufige Überwachung und einen schnelleren Abschluss der Verfahren verfügen. Auch nach der Optimierung reicht die Überlebensfähigkeit je nach Experimentator und der einzelnen Eiercharge n.H. zwischen 50 und 75%. Es wird empfohlen, immer zusätzliche Eier für backup zu bestellen. Nach unserer Erfahrung erfordert die Beherrschung der CAM-Techniken über 1 Jahr. Das Ablegen der CAM-Membran und das Öffnen des Fensters ist der entscheidende Schritt, bei dem versehentliche, tödliche Schäden am Embryo am häufigsten auftreten. Die Lebensfähigkeit des Kükenembryons kann verbessert werden, indem Schäden am CAM verhindert werden.
Das CAM-Tumormodell hat mehrere Einschränkungen. Erstens ist die Anwendbarkeit des Modells auf alle Tumorzelltypen. Wir hatten eine 100%ige Erfolgsrate, die verschiedene etablierte Tumorzelllinien auf CAM eindfropfte, einschließlich Nieren-, Blasen- und Prostatatumorzelllinien (RENCA, ACHN, T24, HT1376, CWR22Rv1, C4-2, Myc-CaP) und Eierstockkrebszelllinien (ID8 und SKOV3). Zwei weitere Studien unserer Gruppe geben weitere Informationen zu diesen CAM-Tumoren25,27. Jedoch, das Wachstum einiger Eierstockkrebszellen auf CAM wird durch die Supplementierung von Wachstumsfaktor oder Tumor-assoziierten Zellen25verbessert. Die Optimierung der Zellzahl oder des wesentlichen Wachstumsfaktors(n) für jede Zelllinie oder jeden Typ ist wichtig. Wir integrieren auch Reporter- oder Markergene, wie Luziferase, Protein-Tags (z. B. HA oder Flagge) oder Fluoreszenz-Tags (z. B. mStrawberry oder EGFP), um die Überwachung des Wachstums und der Metastasierung des Tumors bei den Tieren zu erleichtern25,27. Basierend auf unserer Erfahrung kann eine große Mehrheit der sich ausbreitenden Krebszelllinien auf CAM etabliert werden. Eine wichtige Einschränkung für die Engraftment könnte das kurze 10-Tage-Fenster für Tumorwachstum erlaubt sein, die besonders schwierig für eine langsam wachsende Zelllinie sein könnte, um ausreichende Masse in einem so kurzen Zeitrahmen zu etablieren.
Ein weiteres Manko des CAM-Modells ist der Unterschied in der Physiologie zwischen dem Vogel-Embryo und den Säugetieren. Metastasen vom CAM-Tumor zu wichtigen Organen wie leber- oder lungen des Embryos wurden überwiegend durch empfindliche PCR-Techniken nachgewiesen28. Die kurze Wachstumsperiode des CAM würde nicht ausreichen, um große metastasierende Läsionen zu etablieren, die durch histologische Analysen überprüft werden können. Darüber hinaus ist die reduzierte vaskuläre Perfusion der nicht aufgeblasenen Embryolunge nicht günstig für die Etablierung oder Unterstützung des Wachstums von Lungenmetastasen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde eine Genehmigung unseres institutionellen Tierschutzausschusses (IACUC) eingeholt, um Hühner aus dem CAM-Tumor zu schlüpfen, die Embryonen tragen, und sie weitere 2 Wochen nach dem Schlüpfen unterzubringen. Die Verlängerung der Zeit des Tumorwachstums auf diese Weise ermöglichte es uns, entfernte Lungenmetastasen durch IHC zu erkennen. Obwohl die Schraffurhühnerstudien die zusätzliche IACUC-Zulassung erfordern, die CAM-Tumorstudien nicht haben, bietet dieser Ansatz eine wertvolle Gelegenheit, die metastasierende Kaskade bei Hühnern zu untersuchen, wie dies zuvor bei Mäusen der Fall war. Das Hühnerimmunsystem entwickelt sich berichten datert, ab Tag 12 nach der Befruchtung20. Angesichts der hohen Effizienz der Verdimrung von murin abgeleiteten RENCA-Tumoren, die hier berichtet wurden, und vieler anderer menschlicher Krebszelllinien und PDXs im CAM am Tag 10 nach der Befruchtung24,25,27konnten wir daraus schließen, dass das Immunsystem im Embryo zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollständig entwickelt ist. Das Zusammenspiel des Immunsystems des Huhns und des CAM-Tumors rechtfertigt eindeutig eine weitere Untersuchung.
Unsere Arbeit liefert starke unterstützende Beweise dafür, dass das CAM-Tumormodell ein einfaches Initial-In-vivo-Modell sein könnte, um Krebsbiologie, einschließlich Metastasen, zu studieren. Aufgrund der oben genannten Einschränkungen sollte das CAM-Modell das Mausmodell nicht ersetzen, sondern ergänzen. Unsere laufenden Forschungsergebnisse legen nahe, dass Signal-Crosstalk zwischen heterogenen Zellpopulationen in ccRCC entscheidend für die Steuerung der metastasierenden Progression11,12ist. Die Verwendung sowohl der CAM- als auch der Mausmodelle kann ein wertvolles Mittel sein, um den metastasierenden Crosstalk im ccRCC zu validieren. Wir glauben, dass die zahlreichen Vorteile des hier vorgestellten CAM-Modells das Tempo der Entdeckung neuartiger metastasierender Mechanismen und wirksamer Behandlungen beschleunigen könnten, um dieses tödliche Stadium von Krebs zu beheben.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das UCLA JCCC Seed Grant, UCLA 3R Grant, UCLA CTSI und UC TRDRP (LW) finanziert. Wir danken der Preclinical Imaging Facility des Crump Institute, der TPCL und der UCLA Department of Laboratory Animal Medicine (DLAM) für ihre Hilfe bei experimentellen Methoden. Die Flow-Zytometrie wurde im UCLA Johnson Comprehensive Cancer Center (JCCC) und im Center for AIDS Research Flow Cytometry Core Facility durchgeführt, die von den National Institutes of Health Awards P30 CA016042 und 5P30 AI028697 sowie vom JCCC, dem UCLA AIDS Institute, der David Geffen School of Medicine an der UCLA, dem UCLA Chancellor es Office und dem UCLA Vizekanzler unterstützt wird. Die Statistikberatung und Datenanalyse wurde vom UCLA CTSI Biostatistics, Epidemiology, and Research Design (BERD) Programm bereitgestellt, das vom NIH/National Center for Advancing Translational Science UCLA CTSI Grant Number UL1TR001881 unterstützt wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
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