Summary
سرطان الخلايا الكلوية النقيلي ة الخلايا هو مرض دون نموذج الحيوان شاملة للتحقيق الشامل قبل السريرية. يوضح هذا البروتوكول نموذجين جديدين للحيوانات لهذا المرض: نموذج الماوس المزروع تقويمًا للموضع ونموذج غشاء الدجاج chorioallantoic ، وكلاهما يوضح انبثاث الرئة يشبه الحالات السريرية.
Abstract
سرطان الخلايا الكلوية النقيلية (ccRCC) هو النوع الفرعي الأكثر شيوعًا لسرطان الكلى. ccRCC المترجمة لديها نتيجة جراحية مواتية. ومع ذلك ، فإن ثلث مرضى CCRCC تطوير الانبثاث إلى الرئة ، والتي ترتبط نتيجة سيئة للغاية للمرضى. لسوء الحظ ، لا يتوفر علاج لهذه المرحلة القاتلة ، لأن الآلية الجزيئية للانبثاث لا تزال غير معروفة. ومن المعروف منذ 25 عاما أن فقدان وظيفة فون هيبل لينداو (VHL) ورم الجين مثبط هو pathognomonic ccRCC. ومع ذلك، لم يتم إنشاء أي نموذج الماوس المعدلة وراثيا ذات الصلة سريريا من CCRCC. والغرض من هذا البروتوكول هو إدخال ومقارنة نموذجين للحيوانات المنشأة حديثا لCCRCC النقيلي. الأول هو زرع الكلى في نموذج الماوس. في مختبرنا، تم استخدام نظام تحرير الجينات CRISPR لضرب جين VHL في العديد من خطوط الخلايا RCC. زرع تقويم العظام من مجموعات ccRCC غير متجانسة إلى كبسولة الكلى خلق نماذج CCRCC الرواية التي تطور نقائل الرئة قوية في الفئران الكفؤة المناعية. النموذج الثاني هو نظام غشاء الدجاج chorioallantoic (CAM). بالمقارنة مع نموذج الماوس ، وهذا النموذج هو المزيد من الوقت ، والعمل ، وفعالة من حيث التكلفة. كما دعم هذا النموذج تكوين الورم القوي والتلقيح. نظرًا لفترة الـ 10 أيام القصيرة لنمو الورم في CAM ، لم يلاحظ أي انبثاث ًا منحيث المناعة (IHC) في أنسجة الأجنة التي تم جمعها. ومع ذلك ، عندما تم تمديد نمو الورم لمدة أسبوعين في الدجاج المفقس ، لوحظت آفات ccRCC micrometastatic من قبل IHC في الرئتين. هذان النموذجان قبل السريريان الجديدان سيكونان مفيدين لمزيد من الدراسة للآلية الجزيئية وراء الانبثاث ، وكذلك لإنشاء xenografts الجديدة المشتقة من المريض (PDXs) نحو تطوير علاجات جديدة لCCRCC النقيلي.
Introduction
سرطان الخلايا الكلوية (RCC) هو السرطان 7الأكثر شيوعا في الولايات المتحدة. سنويا، يقدر أن يتم تشخيص 74،000 الأميركيين حديثا، وهو ما يمثل أكثر من 14،000 حالة وفاة (مسح الخلية النسيجية الفرعية، أو CCRCC، هو النوع الفرعي الأكثر شيوعا، وهو ما يمثل ما يقرب من 80٪ من حالات RCC. يتم علاج المرضى الذين يعانون من خبيثة موضعية مع استئصال الكلية ولديهم معدل بقاء مناسب لمدة 5 سنوات من 73٪1. ومع ذلك ، فإن 25٪ -30٪ من المرضى يصابون بثًا بعيدًا بالأعضاء الحيوية مثل الرئتين ، مما يؤدي إلى ضعف متوسط البقاء على قيد الحياة لمدة 13 شهرًا ومعدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات فقط 11٪1،2،3. هناك حاجة إلى مزيد من الفهم للآلية النقيلية لتحسين النتيجة القاتلة لCCRCC النقيلي.
فقدان الجين مثبط الورم VHL هو آفة وراثية مميزة لوحظت في غالبية الحالات CCRCC الإنسان4،5،6،7. ومع ذلك ، فإن آلية oncogenic الدقيقة لفقدان VHL في CCRCC غير معروفة. أيضا، حالة التعبير VHL ليست تنبؤية من النتيجة في ccRCC8. وتجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من المحاولات العديدة في الكلى الظهارية المستهدفة VHL بالضربة القاضية ، فشل العلماء في توليد شذوذ كلوي يتجاوز الآفات الكيسية preneoplastic التي لوحظت في الفئران9، حتى عندما يقترن حذف مثبطات الورم الأخرى مثل PTEN و P5310. تدعم هذه النتائج فكرة أن فقدان VHL وحده غير كافٍ لتكوين الورم أو الانبثاث التلقائي اللاحق.
في الآونة الأخيرة ، أنشأ مختبرنا خط ًا خلية VHL خروجًا المغلوب جديدًا (VHL-KO) باستخدام CRISPR/Cas9 بوساطة حذف جين VHL في خط خلية Min VHL + ccRCC (RENCA ، أو VHL-WT)11،12. أظهرنا أن VHL-KO ليس فقط mesenchymal ، ولكن أيضا يعزز الانتقال الظهاري إلى mesenchymal (EMT) من خلايا VHL -WT12. ومن المعروف EMT للعب دور مهم في عملية النقيلي13. كما أظهر عملنا أن انبثاث الرئة البعيدة لا يحدث إلا مع الزرع المشترك لخلايا VHL-KO وVHL-WT في الكلى ، مما يدعم آلية تعاونية للانبثاث. الأهم من ذلك، لدينا زرع تقويم العظام VHL-KO وVHL-WT نموذج يؤدي إلى نقائل الرئة قوية، تلخيص الحالات ccCcCC السريرية. هذا النموذج التلقائي ccRCC النقيلي يعوض عن عدم وجود نموذج الماوس النقيلي المعدلة وراثيا، وخاصة في تطوير الأدوية الجديدة المضادة للانبثاث. يوضح هذا البروتوكول زرع الكبسولة الكلوية لتجمعات الخلايا غير المتجانسة لخلايا RENCA المعدلة وراثياً.
نماذج كام الدجاج لها تاريخ طويل في مجال البحث عن تولد الأوعية وبيولوجيا الورم بسبب مزاياها العديدة ، كما هو ملخص في الجدول 111،15،16،17،18. باختصار ، فإن النافذة الزمنية لنمو الورم CAM قصيرة ، مما يسمح بحد أقصى 11 يومًا حتى يتم تدمير CAM عند تفقيس الدجاج16. على الرغم من وقت النمو القصير ، فإن إمدادات التغذية الغنية وحالة نقص المناعة لجنين الدجاج تمكن من تطعيم الورم بشكل فعال للغاية16،19،20،21. وأخيرا ، فإن تكلفة كل البويضة المخصبة هو ~ 1 دولار ، مقارنة مع أكثر من 100 دولار لفأر SCID. معا ، يمكن لنموذج كام بمثابة نموذج الحيوان البديلة القيمة في إنشاء PDXs جديدة في توفير كبير في الوقت والتكلفة بالمقارنة مع الماوس. في هذا البروتوكول، قمنا بتقييم ما إذا كان النموذج قادرًا على تلخيص بيولوجيا CCRCC النقيلية التي لوحظت في نموذج تقويم العظام للفأرة.
| (SCID) الماوس | كام | ملاحظه | |
| تكلفه | > 100 دولار لكل منهما | ~ 1 دولار لكل منهما | قابلية البقاء تتراوح بين 50-75٪ |
| الحاجة إلى السكن الحاجز | نعم | لا | يقلل من التكلفة ويبسط المراقبة التسلسلية للأورام |
| الورم مرئية مباشرة | لا | نعم | الشكل 3أ |
| الوقت لتطعيم أول (RENCA) | أسبوعان | 2-4 أيام | المرجع 14، 15 |
| نقطة نهاية النمو (RENCA) | 3-6 أسابيع | 10 أيام | المرجع 14، 15 |
| الانبثاث (RENCA) لوحظ | نعم | نعم في الكتاكيت | الشكل 3D |
| مقاطع متسلسلة | نعم | نعم | المرجع 16-18 |
| المرور إلى الفئران (RENCA) | نعم | نعم | هو، ج.، وآخرون قيد المراجعة (2019) |
| الحفاظ على تغايرية الورم | نعم | نعم | هو، ج.، وآخرون قيد المراجعة (2019) |
الجدول 1: مزايا وقيود نماذج الماوس وCAM. يقارن هذا الجدول بين النموذجين لمزاياها وقيودها من حيث الوقت المطلوب والتكلفة والعمالة ، فضلا عن علم الأحياء. نموذج CAM له مزايا في الكفاءة، ولكن لديه أيضا قيود فريدة خاصة به بسبب مورفولوجيا مختلفة بين الطيور والثدييات. لذلك ، من المهم التأكيد على أن النموذج يمكن أن يحتفظ ببيولوجيا xenografts.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الأساليب الموصوفة هنا من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها (IACUC) ، التي تم تعيينها كلجنة أبحاث الحيوانات التابعة لمستشار جامعة كاليفورنيا (ARC) (ARC 2002-049-53 و ARC 2017-102-01A). تم تحسين بروتوكول 2002-049-53 لزرع خلايا الورم CCRCC في كبسولة الكلى من الفئران عارية أو BALB / ج. لا تتطلب تجارب زرع الورم في بيض الدجاج المخصب قبل الفقس موافقة IACUC. لتمديد الوقت لإنشاء الانبثاث الرئة، ويسمح للأجنة مع ورم كام يفقس وتنمو لتصبح الدجاج. يغطي بروتوكول 2017-102-01A هذه التجارب على الحيوانات.
1. دراسات ورم تقويم العظام في الفئران
ملاحظة: يظهر الجدول الزمني لهذه التجربة في الشكل 1A. وقد تم تكييف هذه الإجراءات من المنشورات السابقة11،12.
- إعداد تعليق خلية واحدة للتطعيم
- فصل خلايا RENCA VHL-WT و VHL-KO من أطباق الثقافة باستخدام التربسين / EDTA.
- عد الخلايا مع مقياس الهيوسيد وإعادة تعليق في خليط مسبق التبريد 1:1 من PBS ومصفوفة خارج الخلية الحل بتركيز 1 × 105 خلايا / ميكرولتر.
ملاحظة: استخدم نسبة 1:4 من خلايا VHL-WT:VHL-KO للغرسات غير المتجانسة وVHL-WT وحدها للغرسات المتجانسة. - نقل الخلايا التي أعيد تعليقها إلى أنبوب طرد مركزي صغير 1.5 مل والحفاظ على الجليد حتى زرع.
- زرع إلى كبسولة كلوية
- التخدير: سخني وسادة دافئة إلى 37 درجة مئوية وغطيها بقطعة من الستائر المعقمة السميكة. تحقن الفأر إما عن طريق استنشاق الايسوفلوران عن طريق غرفة التعريفي أو حقن داخل البلعاق (IP) من 1٪ pentobarbital الصوديوم في جرعة من 10 مل / كجم.
- حلاقة الشعر من موقع الجراحة. يمكن تخطي هذه الخطوة للفئران العارية.
- التطهير واللف الجراحي: تطهير الجزء الخلفي من الماوس تماما مع اليود povidone 3x تليها 70٪ الإيثانول 1x ومسحه الجافة مع مسحات القطن المعقمة. ثم تطبيق ثلاث ضمادات طبية معقمة بالتسلسل، وتغطي الظهر كله من أجل خلق حقل الجراحية، فضلا عن شل حركة الماوس.
- شق والكلى الخارجية: قبل العملية، تطهير أصابع المشغل مع اليود povidone أو استخدام زوج من القفازات المعقمة. وضع الماوس في موقف عرضة واستخدام الأصابع لتحديد موقع الكلى اليسرى الحق تحت الجناح الأيسر. استخدام زوج من ملقط حادة ومقص لقطع الجلد مفتوحة وطبقة العضلات تحت الموقع المحدد. استخدام مسحات القطن المعقم وملقط لإخراج الكلى اليسرى جزئيا من البطن.
- زرع الخلايا السرطانية: تحميل تعليق الخلية المعدة في الخطوة 1.1 في حقن الأنسولين أو المحاقن هاملتون مخصصة (انظر جدول المواد للمواصفات). حقن 20 ميكرولتر من الخلايا التي أعيد تعليقها تحت كبسولة الكلى.
ملاحظة: يتم تحديد الحقن الناجح عن طريق تشكيل انتفاخ شفاف على سطح الكلى. يؤدي الحقن العرضي في الـ parenchyma الكلوي إلى نزيف ومعدل وفيات بعد الجراحة يصل إلى 90٪ بسبب النزيف القاتل في موقع الحقن. - سحب ببطء من الإبرة من أجل السماح للمحلول مصفوفة خارج الخلية لترسيخ ومنع نزيف أو تسرب الخلايا السرطانية. ثم، باستخدام مسحة القطن المعقم، ودفع الكلى مرة أخرى إلى البطن.
- خياطة الجرح: استخدم غرزة VICTRYL المغلفة 5-0 لخياطة طبقة العضلات. تطهير الجلد مع اليود povidone مرة واحدة وإغلاق الجلد مع autoclips الجرح.
- الانتعاش : وضع الماوس على لوحة دافئة حتى يستيقظ. إذا تم تم تم ّ تأهاض الفأر عن طريق الاستنشاق، اسحب الإيزوفلوران وأبقي الفأر على الوسادة الدافئة حتى يكون مستيقظاً.
- التصوير الحيوي (BLI) وجمع الأنسجة
- بعد ستة أسابيع من زرع الورم، خذ صور BLI المستندة إلى اليفلاف. ثم قتل الفئران مع استنشاق الايفورلوران تليها خلع عنق الرحم.
- جمع الدم للكشف عن الخلايا السرطانية (CTC) المتداولة عن طريق قياس التدفق الخلوي.
- حصاد الورم والأعضاء ذات الأهمية (الكلى والرئتين والكبد والأمعاء والطحال) باستخدام تقنية حصاد الأنسجة المعقمة22. إصلاحها في 4٪ paraformaldehyde بين عشية وضحاها لتضمين البارافين الشمع.
2. CAM نموذج xenograft الورم
ملاحظة: تم تكييف هذه الإجراءات وتعديلها من البروتوكولات المنشورةسابقا23،24. يظهر الجدول الزمني لهذا الإجراء في الشكل 1B. تقدم هذه المقالة فقط البروتوكول المبسط. للحصول على بروتوكولات مفصلة، يرجى الرجوع إلى مقال آخر JoVE التي نشرتها مجموعتنا25.
- قبل الاحتضان: احتضان الطازجة، وبيض الدجاج المخصبة في حاضنة البيض الدورية في 37 درجة مئوية و الرطوبة 55-65٪ لمدة 7 أيام.
- إسقاط CAM وفتح نافذة (يوم التنمية 7):
- تحديد موقع ووضع علامة على كيس الهواء والأوردة.
ملاحظة: عادة ما تتم إزالة 10-15٪ من البويضات لأنها إما غير مخصبة أو تموت في غضون 7 أيام من الإخصاب. - إنشاء كيس الهواء الجديد على رأس الوريد ملحوظ.
- حدد كيس الهواء الجديد، وتطبيق شريط التعبئة، ووضع البيض مرة أخرى إلى الحاضنة.
ملاحظة: يمكن إيقاف الإجراء مؤقتاً هنا. من المستحسن استئناف الإجراءات في نفس اليوم لأن كيس الهواء قد يتحرك. - فتح نافذة: باستخدام زوج من مقص microتشريح المنحني وزوج من ملقط إبرة الأنف، وقطع نافذة دائرية 1.5 × 1.5 سم في قذيفة.
ملاحظة: يشار إلى تعطيل CAM من خلال الدم وقطعة من CAM موجودة على قطعة قذيفة قطع. - ختم الثقب مع خلع الملابس الطبية الشفافة ووضع البيض في حاضنة ثابتة في 37 درجة مئوية والرطوبة 55٪-65٪.
ملاحظة: استخدم نفس حاضنة البيض كما هو الحال في الخطوة 2.1. إيقاف الدوار لجعله ثابت.
- تحديد موقع ووضع علامة على كيس الهواء والأوردة.
- الفحص الصحي (يوم النمو 9): قم بإزالة البيض الميت ثم قم بتجميع بقية البويضات عشوائيًا لزرع الخلايا السرطانية.
ملاحظة: من الناحية المثالية، معدل البقاء على قيد الحياة في هذه المرحلة هو ما يقرب من 80٪ من يوم النمو 0. - تطعيم الخلايا السرطانية على CAM المكشوفة حديثًا (يوم النمو 10)
- تمييع حل المصفوفة خارج الخلية في ضعف حجم RPMI 1640 (مع L-الجلوتامين). فصل خلايا RENCA وإعادة تعليق في الحل أعلاه للوصول إلى تركيز 2 × 104 خلايا / μL.
ملاحظة: استخدم نسبة 1:1 من خلايا VHL-WT:VHL-KO للغرسات غير المتجانسة وVHL-WT وحدها للزرع المتجانس. - لترسيخ تعليق الخلية مسبقًا ، قم بملء 100 ميكرولتر من كل مزيج من الخلايا في نصائح ماصة 200 ميكرولتر ووضعها في حاضنة الخلايا لمدة 15 دقيقة.
- زرع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بيضة على سطح CAM من خلال النافذة.
ملاحظة: تتطلب بعض البروتوكولات خدش CAM قبل الزرع23. هذا ليس ضروريا لخلايا RENCA، لأنها تنمو بسرعة كبيرة.
- تمييع حل المصفوفة خارج الخلية في ضعف حجم RPMI 1640 (مع L-الجلوتامين). فصل خلايا RENCA وإعادة تعليق في الحل أعلاه للوصول إلى تركيز 2 × 104 خلايا / μL.
- تنمو الخلايا على CAM لمدة 10 يوما وصورة كل 2 أيام.
- القتل الرحيم وحصاد الورم والدم والأعضاء.
- في يوم النمو 20 (يوم الورم 10)، وجمع الدم عن طريق الوريد chorioallantoic مع حقنة 10 مل.
- القتل الرحيم الأجنة عن طريق وضعها على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- حصاد ووزن الأورام. تشريح الرئتين والكبد باستخدام تقنية حصاد الأنسجة المعقمة مماثلة لتلك المستخدمة للفئران22.
ملاحظة: كبد الدجاج اثنين من فصوص، والتي هي الأعضاء الأولى ينظر في تجويف البطن. لا تخلط بين هذه مع الرئتين. تقع رئتي الدجاج تحت القلب والحاجز26. يمكن تأكيد المجموعة الناجحة للرئتين عن طريق الأضلاع المكشوفة. - إصلاح الأورام والأعضاء تشريح في 4٪ paraformaldehyde بين عشية وضحاها لتضمين البارافين الشمع.
- يفقس الدجاج.
- للسماح لفترة طويلة من نمو الورم، ومواصلة الحضانة من خلال اليوم 21 والسماح للدجاج يفقس في 37 درجة مئوية والرطوبة على الأقل 60٪.
ملاحظة: الدجاج يفقس بشكل طبيعي بعد يوم 21 على مدى فترة زمنية 24 ح ولكن في بعض الأحيان لديهم مشكلة الفقس بأنفسهم. في هذه الحالة، تكسير قشر البيض بعض يساعد. من المهم للدجاج لإكمال عملية الفقس في غضون 24 ساعة لأنها سوف تموت من نقص المواد الغذائية بعد ذلك. - زراعة الدجاج في منشأة للحيوانات (2017-102-01A) لمدة أسبوعين.
- في يوم النمو 34 (يوم الورم 24) ، قتل الفراخ مع استنشاق الايفورلوران يليه خلع عنق الرحم.
- تشريح الرئتين باستخدام تقنية حصاد الأنسجة المعقمة مماثلة لتلك المستخدمة للفئران22. ثم، إصلاحها في 4٪ paraformaldehyde بين عشية وضحاها لتضمين البارافين الشمع.
- للسماح لفترة طويلة من نمو الورم، ومواصلة الحضانة من خلال اليوم 21 والسماح للدجاج يفقس في 37 درجة مئوية والرطوبة على الأقل 60٪.
3- الكيمياء الهيستوكيميائية المناعية
ملاحظة: تم إجراء جميع أقسام الأنسجة وتلطيخ H & E من قبل مختبر علم الأمراض الترجمي الأساسي (TPCL) في جامعة كاليفورنيا ، لوس أنجلوس.
- خبز الشرائح في 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وdeparaffinize 3x باستخدام xylene وrehydrate بشكل متسلسل من الإيثانول 100٪ إلى الماء.
- استرداد المستضدات في المخزن المؤقت التّيّستر في باخرة الخضار لمدة 25 دقيقة.
- تطبيق 1٪ BSA للحظر. ثم تطبيق الأجسام المضادة الأولية (المضادة VHL، المضادة لها، المضادة للعلم) أعدت في نسبة تخفيف 1:200 في برنامج تلفزيوني. احتضان بين عشية وضحاها في 4 °C.
- بعد غسل 3x مع TBST (7 دقيقة لكل منهما) ، يحتضن الشرائح مع الجسم المضاد الثانوي في 1:200 تخفيف. غسل 3x مع TBST (7 دقيقة لكل منهما) وتطبيق الكواشف DAB تليها هيماتوكسيلين مضادة للبقع.
4. تدفق الخلايا
- معالجة الماوس أو دم الدجاج مع خلايا الدم الحمراء (RBC) العازلة العازلة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
ملاحظة: لا يكفي تحلل RBC مهم بشكل خاص عند تحليل دم CAM لأن RBCs الدجاج هي نوياتتيد ولا يمكن تمييزها بسهولة في قياس التدفق الخلوي باستخدام مبعثر إلى الأمام والجانب. - تشغيل تدفق الخلايا على تحلل الدم وتحليل البيانات للتعبير mStrawberry وEGFP.
- تعيين البوابات الأساسية على أساس الأمام والجانب مبعثر باستثناء الحطام والخلايا الميتة ، وRBCs غير مُغسَّر.
- تعيين بوابات الفلورسينس على أساس عينات غير ملطخة وضوابط واحدة ملطخة. استخدام تحليل الدم تستعد مع VHL-WT، VHL-KO، أو خلايا RENCA غير المسمى كعناصر تحكم واحدة ملطخة والضوابط غير الملطخة، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تنفيذ كل تجربة على الأقل 3x ما لم يذكر خلاف ذلك. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (SD). تم تحديد الأهمية من خلال اختبار T للطلاب المقترنة عندما كانت هناك مجموعتين أو بواسطة ANOVA أحاديالاتجاه عندما كانت هناك ثلاث مجموعات أو أكثر. تم استخدام قطع قيمة p من 0.05 لتحديد الأهمية.
نمت خلايا RENCA المزروعة تقويم العظام بنجاح على كلى الفئران ، كما أكدت BLI وتلطيخ H & E(الشكل 2A-B). على الرغم من عدم وجود فرق في النمو الأولي، إلا أن الورم النقيلي غير المتجانس كان لديه انبثاث قوي في الرئة كما هو مبين في إشارة BLI القوية جدًا والعقيدات النقيلية في تلطيخ H & E. من ناحية أخرى ، لم تنتشر الأورام المتجانسة وغير النقيلية إلى أعضاء بعيدة. كانت أعداد CTC أعلى في الفئران التي تحمل الأورام النقيلية من تلك التي تحمل الأورام غير النقيلية(الشكل 2C-D).
في التوافق مع نموذج الماوس ، احتفظ نظام CAM بنجاح بالنمو والسلوك النقيلي لأورام RENCA. في حين لم يكن هناك فرق في النمو بين الأورام النقيلية وغير النقيلية ، كانت أعداد CTC أعلى بكثير في البيض مع الأورام النقيلية من تلك التي لها نظيرات غير النقيلية(الشكل 3A-C). فقس البيض مع أورام CAM والسماح للفراخ لتنمو أسبوعين إضافيين تمديد الفترة للخلايا السرطانية النقيلية لإنشاء الانبثاث القابلة للكشف عن الأنسجة في رئة الكتاكيت، كما هو مبين في H & E وHA وصمة عار من أقسام أنسجة الرئة الدجاج(الشكل 3D). وتتكون غالبية العقيدات النقيلية من خلايا VHL-WT الموسومة بـ HA، في حين نادراً ما شوهدت VHL-KO الموسومة بالعلم، كما لاحظنا في الفئران.
الشكل 1: نظرة عامة على النموذجين الحيوانيين لxenografts ccCc cccc النقيلي. (أ)التمثيل التخطيطي لنموذج تقويم العظام الماوس. 3- أو الفئران التي تبلغ من العمر 4 أسابيع يتم زرعها بتقويم مع أورام غير ميتاستاتيكية أو النقيلية. بعد ستة أسابيع من الزرع ، تم تصور نمو الورم والانبثاث مع BLI. ثم، تم جمع الورم والدم والأعضاء لتحليل المصب. (ب)التمثيل التخطيطي لنموذج CAM الذي يظهر الخطوات التالية: الاحتضان المسبق، وفتح النافذة، وزرع الخلايا، والقتل الرحيم قبل أو بعد الفقس. يتم إجراء نفس التحليلات كنموذج الماوس للعينات التي تم جمعها. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: نمو الورم والانبثاث في الفئران المزروعة تقويم العظام. (أ)BLI من الفئران والأعضاء المستخرجة (الكلى والرئة والكبد والأمعاء والطحال) بعد 6 أسابيع من زرع تقويم العظام من خلايا RENCA. إلى اليسار: غير ميتاستاتيكي (غير ميت)، يمين: منتشر. (ب)عرض الإجمالي وزيادة التكبير من تلطيخ H & E للكلى والرئة (20x و 100x). إلى اليسار: غير ميتاستاتيكي (غير ميت)، يمين: منتشر. (C)تحليل التدفق التمثيلي للكشف عن خلايا mStraw+ و EGFP+ المتداولة في الدم. (D)النسبة المئوية للسكان الرسم البياني للتعميم mStraw + وEGFP + الخلايا. غير التقى: nonmetastatic. تم تكييف الفريق A من Hu et al.27. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نمو الورم والانبثاث في نموذج CAM. (أ)أورام رينكا نمت في كام. كان هناك 7 تكرار لكل مجموعة. غير التقى: nonmetastatic. (ب)تحليل التدفق التمثيلي للكشف عن خلايا mStraw+ و EGFP+ المتداولة في الدم. (C)النسبة المئوية للسكان الرسم البياني للتعميم mStraw + وEGFP + الخلايا. **p < 0.01. (د)تلطيخ الرئة من فرخ عمره أسبوعان يحمل ورمًا النقيليًا خلال مرحلته الجنينية. من اليسار، تظهر الأقسام H & E و HA وتلطيخ العلم. #: الشريان الرئوي للدجاج. رأس السهم: العقيدات النقيلية. وقد تم تكييف هذا الرقم من هو ج.وآخرون 27. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بالنسبة للعديد من المرضى الذين يعانون من الأورام الخبيثة الظهارية ، فإن الانبثاث في الأعضاء الحيوية هو السبب الرئيسي للوفاة. لذلك ، من الضروري العثور على الآلية الأساسية ووسيلة جديدة للعلاج من الأمراض النقيلية. لسوء الحظ، هناك نقص في النماذج الحيوانية CCRCC النقيلية ذات الصلة. التحدي في جزء كبير منه يرجع إلى عدم القدرة على إعادة ccRCC في الفئران على الرغم من توليد العديد من الكلى المعدلة وراثيا الظهارية المستهدفة نماذج الماوس VHL خروج المغلوب9،10. هنا ، نُظهر طرق إنشاء ورم CCRCC قابل للزرع في نظامين للحيوانات ، الفأر وCAM الدجاج. هذه النتائج التحقق من صحة السلوك النقيلي للأورام في اثنين من بيئات متباينة، وبالتالي توفير فرص فريدة لمزيد من التحقيق في الآلية الجزيئية للانبثاث. في النموذج الأول ، تم زرع عدد RENCA غير المتجانس للفئران الكفؤة المناعية تقويميًا إلى كبسولة الكلى الخاصة بهم. بعد 6 أسابيع، أظهرت هذه الفئران انتشار الرئة المتفشية. في التوافق مع نموذج الماوس ، زرع خلايا الرينكا غير المتجانسة على CAM نمت بنجاح وداخل الدم في الأجنة الفرخ. من خلال تمديد فترة نمو الورم إلى 2 أسابيع بعد الفقس ، لوحظت انبثاث الرئة التي تشبه تلك التي شوهدت في الماوس في الفراخ.
بالنسبة لكلا النموذجين ، فإن الاهتمام الدقيق بالتفاصيل التقنية لكل خطوة والممارسة لتحسين المهارات التقنية ضرورية لزيادة بقاء الحيوان وتطعيم الورم الناجح والانبثاث. لنموذج الماوس، واختيار دقيق للمعدات والحقن الدقيق للخلايا السرطانية إلى كبسولة الكلى يزيد من معدل النجاح عن طريق خفض معدل الوفيات بعد الجراحة وزيادة فرصة الورم للحصول على إمدادات الدم الكافية للنمو و الانبثاث. نموذج CAM يتطلب المزيد من التحسين في الإعداد والتقنية. في دراساتنا، كانت صلاحية الجنين أقل من 30% في البداية. من المهم الحفاظ على كل من درجة الحرارة والرطوبة إلى المستوى المطلوب في جميع الأوقات من خلال وجود معدات جيدة ، والمراقبة المتكررة ، والانتهاء بشكل أسرع من الإجراءات. حتى بعد التحسين ، تتراوح نسبة البقاء من 50-75٪ اعتمادًا على المجرب والدفعة الفردية من البيض. فمن المستحسن أن تأمر دائما بيض إضافي للنسخ الاحتياطي. في تجربتنا ، اتقان تقنيات CAM يتطلب أكثر من 1 سنة. إسقاط غشاء CAM وفتح النافذة هي الخطوة الحرجة حيث يحدث ضرر عرضي وقاتل للجنين في معظم الأحيان. يمكن تحسين صلاحية جنين الفرخ عن طريق منع تلف CAM.
هناك العديد من القيود على نموذج الورم CAM. الأول هو انطباق النموذج على جميع أنواع الخلايا السرطانية. لقد كان لدينا معدل نجاح 100٪ تطعيم مختلف خطوط خلايا الورم المنشأة على CAM، بما في ذلك الكلى والمثانة، وخطوط خلايا ورم البروستاتا (RENCA، ACHN، T24، HT1376، CWR22Rv1، C4-2، Myc-CaP) وخطوط خلايا سرطان المبيض (ID8 و SKOV3). دراستين إضافيتين من مجموعتنا توفر المزيد من المعلومات حول هذه الأورام CAM25،27. ومع ذلك ، فإن نمو بعض خلايا سرطان المبيض على CAM يتعزز من خلال مكملات عامل النمو أو الخلايا المرتبطة بالورم25. من المهم تحسين رقم الخلية أو عامل النمو الأساسي لكل خط خلية أو نوع. كما نقوم بدمج جينات المراسل أو العلامة ، مثل لوسيفيراز ، علامات البروتين (على سبيل المثال ، HA أو العلم) ، أو علامات الفلورسينس (على سبيل المثال ، mStrawberry أو EGFP) ، لتسهيل مراقبة نمو ورم الورم في الحيوانات25،27. بناء على تجربتنا، يمكن إنشاء غالبية كبيرة من خطوط الخلايا السرطانية المنتشرة على CAM. قد يكون القيد الرئيسي للتطعيم هو فترة الـ 10 أيام القصيرة المسموح بها لنمو الورم ، والتي يمكن أن تكون صعبة بشكل خاص لخط الخلايا البطيء النمو لإنشاء كتلة كافية في مثل هذا الإطار الزمني القصير.
عيب آخر في نموذج CAM هو الفرق في علم وظائف الأعضاء بين جنين الطيور والثدييات. تم الكشف عن الانبثاث من ورم CAM إلى الأعضاء الرئيسية مثل الكبد أو الرئتين من الجنين في الغالب من قبل تقنيات PCR الحساسة28. فترة قصيرة من النمو في CAM لن تكون كافية لإنشاء آفات منتشر كبيرة يمكن التحقق منها من خلال التحليلات النسيجية. وعلاوة على ذلك ، فإن انخفاض تروية الأوعية الدموية في الرئة الجنينية غير المضخمة ليست مواتية لإنشاء أو دعم نمو نقائل الرئة. للتغلب على هذه القيود، تم الحصول على موافقة من لجنة استخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) لفقس الدجاج من الأجنة الحاملة للورم CAM وإيواء ها 2 أسابيع إضافية بعد الفقس. تمديد وقت نمو الورم بهذه الطريقة مكننا من الكشف عن الانبثاث الرئة البعيدة من قبل المدينة العالمية للخدمات الإنسانية. على الرغم من أن دراسات الدجاج المفقس تتطلب موافقة IACUC إضافية أن دراسات الورم CAM لا، يوفر هذا النهج فرصة قيمة لدراسة التعاقب النقيلي في الدجاج كما فعلت سابقا في الفئران. وقد تم الإبلاغ عن الجهاز المناعي الدجاج لتطوير بدءا من يوم 12 بعد الإخصاب20. ونظرا للكفاءة العالية لتطعيم الأورام المورين المستمدة RENCA ذكرت هنا والعديد من خطوط الخلايا السرطانية البشرية الأخرى وPDXs في CAM في اليوم 10 بعد الإخصاب24،25،27، يمكننا أن نستخلص أن الجهاز المناعي في الجنين لم يتطور بشكل كامل في هذه المرحلة. التفاعل بين الجهاز المناعي للدجاج والورم CAM بوضوح يبرر مزيد من التحقيق.
يوفر عملنا أدلة داعمة قوية على أن نموذج الورم CAM يمكن أن يكون نموذجًا أوليًا بسيطًا في الجسم الحي لدراسة بيولوجيا السرطان ، بما في ذلك الانبثاث. نظرًا للقيود المذكورة أعلاه ، يجب ألا يحل نموذج CAM محل نموذج الماوس ، بل يكمله. تشير أبحاثنا الجارية إلى أن تقاطع الإشارة بين مجموعات الخلايا غير المتجانسة في ccRCC مفيد في حكم التقدم النقيلي11،12. يمكن أن يكون استخدام كل من نماذج CAM والماوس وسيلة قيمة للتحقق من صحة الحديث المتبادل النقيلي في اللعب في ccRCC. ونحن نعتقد أن العديد من مزايا نموذج CAM المقدمة هنا يمكن أن تسرع وتيرة اكتشاف آليات جديدة النقيلي والعلاجات الفعالة لعلاج هذه المرحلة القاتلة من السرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من قبل منحة البذور جامعة كاليفورنيا JCCC، منحة UCLA 3R، جامعة كاليفورنيا CTSI، وجامعة كاليفورنيا TRDRP (LW). نشكر مرفق التصوير قبل السريري التابع لمعهد كرومب، وTPCL، وقسم الطب الحيواني المختبري في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (DLAM) لمساعدتهم في الطرق التجريبية. تم إجراء قياس التدفق الخلوي في مركز السرطان الشامل في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس جونسون (JCCC) ومركز أبحاث الإيدز تدفق الخلوي مرفق الأساسية التي تدعمها المعاهد الوطنية للصحة جوائز P30 CA016042 و 5P30 AI028697، وJCCC، ومعهد الإيدز في جامعة كاليفورنيا، وكلية ديفيد جيفن للطب في جامعة كاليفورنيا في لوس انجليس، ومكتب رئيس جامعة كاليفورنيا في لوس انجليس، ومكتب جامعة كاليفورنيا في لوس انجليس تم توفير خدمات الاستشارات الإحصائية وتحليل البيانات من قبل برنامج جامعة كاليفورنيا CTSI للإحصاءات الحيوية وعلم الأوبئة وتصميم الأبحاث (BERD) الذي يدعمه معهد الصحة القومي / المركز الوطني للنهوض بالعلوم المترجمة في جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس CTSI رقم UL1TR001881.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
- Cohen, H. T., McGovern, F. J. Renal-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 353 (23), 2477-2490 (2005).
- Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
- Hsieh, J. J., et al. Renal cell carcinoma. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17009 (2017).
- Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
- Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
- Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
- Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
- Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
- Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
- Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
- Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032 (2016).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
- Heerboth, S., et al. EMT and tumor metastasis. Clinical and Translational Medicine. 4, 6 (2015).
- DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
- Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
- Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
- Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
- Solomon, J. B. Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, North-Holland Pub. Co. (1971).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. (2019).
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815 (2011).
- Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
- Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , In Press (2019).
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
- Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
- Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).
