Summary
Метастатическая ясная клеточная карцинома является заболеванием без комплексной модели животных для тщательного доклинического исследования. Этот протокол иллюстрирует две новые модели животных для болезни: ортотопически имплантированной мыши модели и курица хориоаллантоической мембранной модели, оба из которых демонстрируют метастазирование легких, напоминающие клинические случаи.
Abstract
Метастатическая ясная клеточная карцинома (ccRCC) является наиболее распространенным подтипом рака почек. Локализованный ccRCC имеет благоприятный хирургический исход. Тем не менее, одна треть пациентов CCRCC будет развиваться метастаза в легких, что связано с очень плохим исходом для пациентов. К сожалению, для этой смертельной стадии не предусмотрена терапия, так как молекулярный механизм метастазиса остается неизвестным. Уже 25 лет известно, что потеря функции гена супрессора опухоли фон Гиппель-Линдау (VHL) является патогномонической ccRCC. Однако не было создано клинически релевантных трансгенных мышей модели ccRCC. Цель юга этого протокола состоит в том, чтобы внедрить и сравнить две вновь созданные модели животных для метастатического ccRCC. Во-первых, почечная имплантация в модели мыши. В нашей лаборатории система редактирования генов CRISPR была использована для выбивания гена VHL в нескольких линиях клеток RCC. Ортотопическая имплантация неоднородных популяций ccRCC в почечную капсулу создала новые модели ccRCC, которые развивают надежные метастазы легких у иммунокомпетентных мышей. Вторая модель - система куриной хориоаллантоической мембраны (CAM). По сравнению с моделью мыши, эта модель больше времени, труда и экономически эффективным. Эта модель также поддерживала надежное образование опухоли и интравазацию. Из-за короткого 10-дневного периода роста опухоли в CAM, никаких явных метастаз не наблюдалось иммуногистохимией (IHC) в собранных тканях эмбриона. Однако, когда рост опухоли был продлен на две недели в вылупившихся курица, микрометатические поражения ccRCC наблюдались IHC в легких. Эти две новые доклинические модели будут полезны для дальнейшего изучения молекулярного механизма метастазов, а также для создания новых, полученных пациентом ксенотрансплантатов (PDXs) к разработке новых методов лечения метастатического ccRCC.
Introduction
Карцинома почечных клеток (RCC) является7-м наиболее распространенным раком в Соединенных Штатах. Ежегодно, 74000 американцев, по оценкам, вновь диагностируется, что составляет более 14000 смертей (Ясно-клеточный гистологический подтип, или ccRCC, является наиболее распространенным подтипом, на долю которого приходится около 80% случаев RCC. Пациенты с локализованной злокачественностью лечатся нефрэктомией и имеют благоприятную 5-летнюю выживаемость 73%1. Тем не менее, 25%-30% пациентов развиваются отдаленные метастаза в жизненно важные органы, такие как легкие, в результате чего плохое среднее выживание 13 месяцев и 5-летняя выживаемость только 11%1,2,3. Дальнейшее понимание метастатического механизма необходимо для улучшения смертельного исхода для метастатического ccRCC.
Потеря гена супрессора опухоли VHL является отличительной чертой генетического поражения наблюдается в большинстве случаев ccRCC человека4,5,6,7. Однако точный онкогенный механизм потери ВХЛ в ccRCC неизвестен. Кроме того, статус выражения VHL не является предсказуемым исхода в ccRCC8. Примечательно, что, несмотря на многочисленные попытки почечно-эпителиальной целевой VHL нокаут, ученые не смогли создать почечной аномалии за пределами неопластических кистозных поражений наблюдается у мышей9, даже в сочетании с удалением других супрессоров опухоли, такие как PTEN и p5310. Эти выводы подтверждают идею о том, что потери ВХЛ сами по себе недостаточно для опухоли или последующего спонтанного метастаза.
Недавно наша лаборатория создала новую линию клеток VHL knockout (VHL-KO) с использованием CRISPR/Cas9 опосредованного удаления гена VHL в линии клеток MURINE VHL ' ccRCC (RENCA, или VHL-WT)11,12. Мы показали, что VHL-KO является не только мезенхимальным, но и способствует эпителии к мезенхимального перехода (EMT) вВХЛ-WT клеток12. ИЗВЕСТНО, что EMT играет важную роль в метастатическом процессе13. Наша работа также показала, что отдаленные метастазирование легких происходит только при совместном имплантации в почках вВХЛ-КО и ВХЛ-ВТ, поддерживая кооперативный механизм метастазирования. Важно отметить, что наша ортотопически имплантированная модель VHL-KO и VHL-WT приводит к устойчивым метастазам легких, повторяя клинические случаи ccRCC. Эта спонтанная метастатическая модель ccRCC компенсирует отсутствие трансгенной метастатической мышиной модели, особенно при разработке новых противметастатов. Этот протокол демонстрирует имплантацию почечной капсулы неоднородных клеточных популяций генетически модифицированных клеток RENCA.
Куриные модели CAM имеют долгую историю в исследованиях ангиогенеза и биологии опухоли из-за их многочисленных преимуществ, как обобщено в таблице 114,15,16,17,18. Короче говоря, временное окно для роста опухоли CAM является коротким, что позволяет максимум 11 дней, пока CAM разрушается при вылуплении курицы16. Несмотря на короткое время роста, богатое питание и иммунодефицитное состояние куриного эмбриона позволяют очень эффективно привить опухоль16,19,20,21. Наконец, стоимость каждой оплодотворенной яйцеклетки составляет 1 евро по сравнению с более чем 100 долларами за мышь SCID. Вместе модель CAM может служить ценной альтернативной моделью для животных в создании новых PDX при большой экономии времени и затрат по сравнению с мышью. В этом протоколе мы оценивали, удалось ли модели резюмировать биологию метастатического ccRCC, наблюдаемого в ортотопической модели мыши.
| (SCID) Мыши | Камера | Примечание | |
| Стоимость | 100 долларов США каждый | 1$1 каждый | Выживаемость от 50-75% |
| Потребность в барьерном жилье | Да | Нет | Дальнейшее снижение затрат и упрощение последовательного мониторинга опухолей |
| Опухоль непосредственно видна | Нет | Да | Рисунок 3A |
| Время для первого прививоки (RENCA) | 2 недели | 2-4 дня | реф 14, 15 |
| Конечная точка роста (RENCA) | 3-6 недель | 10 дней | реф 14, 15 |
| Метастаз (RENCA) наблюдается | Да | Да у цыплят | Рисунок 3D |
| Серийные проходы | Да | Да | рефери 16-18 |
| Проход к мышам (RENCA) | Да | Да | Hu, J., et al. в стадии рассмотрения (2019) |
| Поддержание неоднородности опухоли | Да | Да | Hu, J., et al. в стадии рассмотрения (2019) |
Таблица 1: Преимущества и ограничения моделей мыши и CAM. В этой таблице сравниваются две модели по их преимуществам и ограничениям с точки зрения требуемого времени, затрат, труда, а также биологии. Модель CAM имеет преимущества в эффективности, но она также имеет свои собственные уникальные ограничения из-за различных морфологии между птицами и млекопитающими. Поэтому важно подтвердить, что модель может сохранить биологию ксенотрансвантов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC), назначенным как Комитет по исследованиям животных канцлера UCLA (ARC) (ARC 2002-049-53 и ARC 2017-102-01A). Протокол 2002-049-53 оптимизирован для имплантации опухолевых клеток ccRCC в почечную капсулу мышей Nude или BALB/c. Эксперименты по имплантации опухоли в оплодотворенных куриных яйцах до вылупления не требуют одобрения IACUC. Чтобы продлить время для установления метастазиз легких, эмбрионы с опухолью CAM могут вылупляться и расти в кур. Протокол 2017-102-01A охватывает эти эксперименты на животных.
1. Ортотопические исследования опухоли у мышей
ПРИМЕЧАНИЕ: Хронология этого эксперимента показана на рисунке 1A. Эти процедуры были адаптированы из предыдущихпубликаций 11,12.
- Подготовка одноклеточной подвески для прививки
- Отсоедините клетки RENCA VHL-WT и VHL-KO от культурных блюд с помощью трипсина/EDTA.
- Подсчитайте клетки гемоцитометром и повторно приготовьте в предварительно охлажденный 1:1 смесь PBS и внеклеточного матричного раствора в концентрации 1 х 105 клеток/ Л.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соотношение 1:4 клеток VHL-WT:VHL-KO для неоднородных имплантатов и только VHL-WT для однородных имплантатов. - Перенесите переплетемые клетки в микроцентрифугную трубку мощностью 1,5 мл и держите на льду до имплантации.
- Имплантация в почечную капсулу
- Анестезия: Разогреть теплую подушечку до 37 градусов по Цельсию и покрыть его куском толстой стерильной драпировки. Анестезия мыши либо изофлуран ингаляции через индукционную камеру или интраперитонеальной (IP) инъекции 1% пентобарбитального натрия в дозировке 10 мл/кг.
- Бритье волос из хирургического участка. Этот шаг можно пропустить для обнаженных мышей.
- Дезинфекция и хирургическая драпировка: Дезинфекция задней части мыши полностью с повид-йод 3x следуют 70% этанола 1x и протрите его сухим с стерильными ватными тампонами. Затем нанесите три стерильные медицинские повязки последовательно, покрывая всю спину, чтобы создать хирургическое поле, а также обездвижить мышь.
- Разрез и экстерьер из почек: Перед операцией продезинфицировать пальцы оператора поидон-йодом или использовать пару стерильных перчаток. Поместите мышь в положение лежа и использовать пальцы, чтобы найти левую почку прямо под левым флангом. Используйте пару тупых щипцы и ножницы, чтобы разрезать кожу открытой и мышечный слой под указанным местом. Используйте стерильные ватные тампоны и щипцы, чтобы частично экстерьеризировать левую почку из живота.
- Имплантация опухолевых клеток: Загрузите клеточную подвеску, подготовленную в шаге 1.1 в инсулиновых шприцах или настраиваемых шприцах Гамильтона (см. Таблицу Материалов для спецификаций). Вводят 20 л из подвесных клеток под капсулу почки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Успешная инъекция определяется образованием полупрозрачного выпуклости на поверхности почки. Случайная инъекция в почечную паренхиму приводит к кровотечению и послеоперационной смертности выше 90% из-за смертельного кровоизлияния в месте инъекции. - Медленно вытащите иглу, чтобы внеклеточный матричного раствора затвердеть и предотвратить кровоизлияние или утечку опухолевых клеток. Затем, используя стерильный ватный тампон, нажмите почки обратно в живот.
- Рана сшивание: Используйте 5-0 покрытием VICTRYL шов, чтобы сшить мышечный слой. Дезинфицировать кожу с помощью повид-йода один раз и закрыть кожу с раной автоклипов.
- Восстановление: Поместите мышь на теплую площадку, пока она не проснется. Если мышь была обезглавлена путем вдыхания, снять изофлуран и держать мышь на теплой площадке, пока он не проснулся.
- Биолюминесценция (BLI) и сбор тканей
- Через шесть недель после имплантации опухоли, принимать светлячковых основе BLI изображений. Затем эвтаназии мышей с изофлуранинга ингаляции с последующим вывихом шейки матки.
- Сбор крови для циркулирующих опухолевых клеток (CTC) обнаружения потока цитометрии.
- Урожай опухоли и органов, представляющих интерес (почки, легкие, печень, кишечник и селезенку) с использованием стерильной ткани уборки техники22. Исправить их в 4% параформальдегида на ночь для парафина воска встраивания.
2. CAM опухоли ксенотрансвтат модель
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти процедуры были адаптированы и изменены из ранее опубликованных протоколов23,24. Хронология этой процедуры показана на рисунке 1B. В этой статье представлен только обтекаемый протокол. Для получения подробных протоколов, пожалуйста, обратитесь к другой статье JoVE, опубликованной нашей группой25.
- Преинкубация: Инкубировать свежеотложенные, оплодотворенные куриные яйца в вращающемся яичном инкубаторе при 37 градусах Цельсия и влажности 55-65% в течение 7 дней.
- Бросьте CAM и открытое окно (день развития 7):
- Найдите и пометьте воздушный мешок и вены.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно 10-15% яйцеклеток удаляются, потому что они либо не оплодотворены, либо умирают в течение 7 дней после оплодотворения. - Создайте новый воздушный мешок поверх отмеченной вены.
- Разграничить новый воздушный мешок, нанесите упаковочная ленту и положите яйца обратно в инкубатор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура может быть приостановлена здесь. Рекомендуется возобновить процедуры в течение того же дня, потому что воздушный мешок может двигаться. - Откройте окно: Используя пару изогнутых микрорассечения ножницы и пару иглонононононов щипцы, вырезать 1,5 х 1,5 см круглое окно в оболочке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нарушение CAM указывается кровью и кусок CAM настоящее время на разрезе оболочки кусок. - Запечатать отверстие прозрачной медицинской заправкой и поместить яйца в стационарный инкубатор при 37 градусах Цельсия и влажности 55%-65%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте тот же инкубатор яйца, что и в шаге 2.1. Выключите ротатор, чтобы сделать его неподвижным.
- Найдите и пометьте воздушный мешок и вены.
- Проверка здоровья (день развития 9): Удалить мертвые яйца, а затем случайно группировать остальные яйца для имплантации опухолевых клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале, выживаемость на данный момент составляет около 80% от развития день 0. - Прививка опухолевых клеток на недавно открытый CAM (день развития 10)
- Разбавить внеклеточный матричного раствора в два раза больше объема предварительно охлажденных RPMI 1640 (с L-глютамина). Отсоедините клетки RENCA и повторно приостановите в вышеуказанном растворе, чтобы достичь концентрации 2 х 104 ячеек/Зл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соотношение 1:1 клеток VHL-WT:VHL-KO для неоднородных имплантатов и только VHL-WT для однородной имплантации. - Чтобы предукрепить суспензию клеток, заполните 100 кЛ каждой клеточной смеси в 200 наконечниках пипетки и поместите их в клеточный инкубатор в течение 15 минут.
- Имплантировать 100 зл клеточной подвески для каждого яйца на поверхности CAM через окно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые протоколы требуют царапин CAM до имплантации23. Это не обязательно для клеток RENCA, потому что они растут очень быстро.
- Разбавить внеклеточный матричного раствора в два раза больше объема предварительно охлажденных RPMI 1640 (с L-глютамина). Отсоедините клетки RENCA и повторно приостановите в вышеуказанном растворе, чтобы достичь концентрации 2 х 104 ячеек/Зл.
- Выращивайте клетки на CAM в течение 10 дней и фотографируйте каждые 2 дня.
- Эвтанизировать и собирать опухоль, кровь и органы.
- В день развития 20 (опухолевый день 10), собирать кровь через хориоаллантоической вены с гепарина 10 мл шприца.
- Эвтанизировать эмбрионы, поставив их на лед в течение 15 минут.
- Урожай и взвешивание опухолей. Вскрыть легкие и печень с помощью стерильной ткани уборки техники, аналогичной той, которая используется для мышей22.
ПРИМЕЧАНИЕ: Куры печени имеют две доли, которые являются первыми органами видели в брюшной полости. Не путайте их с легкими. Куриные легкие расположены под сердцем и перегородкой26. Успешная коллекция легких может быть подтверждена открытыми ребрами. - Исправить опухоли и вскрытые органы в 4% параформальдегида ночь для парафина воска встраивания.
- Выщелачить цыплят.
- Чтобы обеспечить длительный период роста опухоли, продолжайте инкубацию в течение 21 дня и позвольте цыплятам вылупиться при 37 градусах Цельсия и не менее 60% влажности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Куры естественно люк после 21-го дня в течение 24 ч период времени, но иногда возникают проблемы штриховки сами по себе. В этом случае, растрескивание яичной скорлупы некоторые помогает. Важно для цыплят, чтобы завершить процесс вылупления в течение 24 ч, потому что они умрут от недостатка питательных веществ после этого. - Выращивайте кур на животноводческой ферме (2017-102-01A) в течение 2 недель.
- На развитие 34 (опухоль день 24), эвтаназии птенцов с изофлуранинга с последующим вывихом шейки матки.
- Вскрыть легкие с помощью стерильной ткани уборки техники, аналогичной тем, которые используются для мышей22. Затем, исправить их в 4% параформальдегида на ночь для парафина воска встраивания.
- Чтобы обеспечить длительный период роста опухоли, продолжайте инкубацию в течение 21 дня и позвольте цыплятам вылупиться при 37 градусах Цельсия и не менее 60% влажности.
3. Иммуногистохимия
ПРИМЕЧАНИЕ: Все ткани секции и Н И E окрашивания было сделано в лаборатории translational патологии Core (TPCL) в Университете Калифорнии, Лос-Анджелес.
- Выпекать слайды при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 20 минут и депарафинизировать 3x с помощью ксилена и регидратировать последовательно от 100% этанола до воды.
- Извлекайте антигены в цитратном буфере, варящемся в овощном пароходе в течение 25 мин.
- Применить 1% BSA для блокировки. Затем нанесите первичные антитела (анти-VHL, anti-HA, anti-flag) подготовленные на коэффициенте разбавления 1:200 в PBS. Инкубировать на ночь при 4 градусах Цельсия.
- После мытья 3x с TBST (7 мин каждый), инкубировать слайды со вторичным антителом в 1:200 разбавления. Вымойте 3x с TBST (7 мин каждый) и применять DAB реагентов следуют гематоксилин контрпотирования.
4. Цитометрия потока
- Обработайте мышь или куриную кровь с помощью буфера лиза из красных кровяных телец (РБК) в соответствии с протоколом производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Достаточно елизирбкя РБК особенно важно при анализе крови CAM, потому что куриные РБК нуклеитные и не могут быть легко различимы в цитометрии потока с помощью переднего и бокового рассеяния. - Запустите цитометрию потока на лицей крови и проанализируйте данные для выражения mStrawberry и EGFP.
- Установите основные ворота на основе переднего и бокового рассеяния, исключая мусор, мертвые клетки и неизлёзовые РБК.
- Установите флуоресценцию ворота на основе неокрашенных образцов и одного окрашенных элементов управления. Используйте анализ крови, загрунтованный с VHL-WT, VHL-KO, или немаркированные клетки RENCA в качестве одного окрашенных элементов управления и неокрашенных элементов управления, соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Каждый эксперимент был выполнен по крайней мере в 3 x, если не указано иное. Данные представлены в виде среднего стандартного отклонения (SD). Значение определялось парным, Студенческим Т-тестом, когда было две группы или односторонней ANOVA, когда было три или более групп. Для установления значимости использовалось отсечку p-значения 0,05.
Ортотопически имплантированные клетки RENCA успешно росли на мышах почек, что подтверждается BLI и H и E окрашивания(Рисунок 2A-B). Хотя не было никакой разницы в первичном росте, только неоднородная метастатическая опухоль имела надежные метастазирование в легких, о чем свидетельствует очень сильный сигнал BLI и метастатические узлы в окрашивании Н и Е. С другой стороны, однородные, неметастатические опухоли не метастазируют в отдаленные органы. Количество CTC было выше у мышей, несущих метастатические опухоли, чем у несущих неметастатические опухоли(рисунок 2C-D).
В соответствии с моделью мыши, система CAM успешно сохранила рост и метастатическое поведение опухолей RENCA. Хотя не было никакой разницы в росте между метастатическими и неметастатические опухоли, КТК рассчитывает были значительно выше в яйцах с метастатическими опухолями, чем те, с неметастатическими аналогами (Рисунок 3A-C). Hatching яйца с опухолями CAM и позволяет птенцам расти дополнительные две недели продлил период для метастатических раковых клеток, чтобы установить гистологически обнаруживаемых метастазов в легких птенцов, как показано в Н И Е и HA пятно куриных секций легочной ткани (Рисунок 3D). Большинство метастатических узлов состояли из HA-тегами ВХЛ-ВТ, в то время как помеченные флагом ВХЛ-КО редко видели, как мы наблюдали у мышей.
Рисунок 1: Обзор двух моделей животных для метастатических ксенотрансплантатов ccRCC. (A) Схематическое представление модели ортотопической мыши. 3- или 4-недельные мыши ортотопически имплантируются либо с неметастатической или метастатической опухоли. Через шесть недель после имплантации, рост опухоли и метастазбыли были визуализированы с помощью BLI. Затем, опухоль, кровь и органы были собраны для анализа ниже по течению. (B) Схематическое представление модели CAM, показывающее следующие шаги: Преинкубация, открытие окна, имплантация клеток и эвтаназия до или после вылупления. Для собранных образцов проводятся те же анализы, что и модель мыши. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Рост опухоли и метастазы у ортотопически имплантированных мышей. (A) BLI мышей и извлеченных органов (почки, легкие, печень, кишечник и селезенку) 6 недель после ортотопической имплантации клеток RENCA. Слева: неметатический (не-встретился), справа: метастатический. (B) Валовой вид и увеличение Н И E окрашивания для почек и легких (20x и 100x). Слева: неметатический (не-встретился), справа: метастатический. (C) Представитель ный анализ потока для обнаружения mStraw и EGFP, циркулирующих в крови. (D) Процент популяции график циркулирующих mStraw и EGFP - клетки. Невстреча: неметастатическая. Панель А была адаптирована из Hu et al.27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Рост опухоли и метастазы в модели CAM. (A) RENCA опухолей, выращенных в CAM. Было 7 повторов для каждой группы. Невстреча: неметастатическая. (B) Представитель ный анализ потока для обнаружения mStraw и EGFP, циркулирующих в крови. (C) Процент популяции график циркулирующих mStraw и EGFP - клетки. Злт; 0,01. (D) IHC окрашивание легких от 2-недельного цыпленка подшипник метастатической опухоли во время эмбриональной стадии. Слева направо, разделы показывают Н И Е, HA, и флаг окрашивания. Вопрос: куриная легочная артерия; наконечник стрелы: метастатические узлы. Эта цифра была адаптирована из Hu J и др.27. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для многих пациентов с эпителиальными злокачественными новообразованиями метастазы в жизненно важные органы являются основной причиной смертности. Поэтому необходимо найти основной механизм и новый путь терапии метастатических заболеваний. К сожалению, не хватает соответствующих метастатических моделей животных ccRCC. Задача в значительной степени связано с невозможностью воссоздать ccRCC у мышей, несмотря на поколение многочисленных трансгенных почек эпителия-ориентированных Моделей выкидок вымыv VHLмыши 9,10. Здесь мы демонстрируем методы создания имплантируемой метастатической опухоли ccRCC в двух системах животных, мыши и куриного CAM. Эти выводы подтвердили метастатическое поведение опухолей в двух разрозненных средах и тем самым предоставляют уникальные возможности для дальнейшего изучения молекулярного механизма метастазирований. В первой модели неоднородная популяция RENCA была имплантирована иммунокомпетентным мышам, ортотопически в их почечную капсулу. После 6 недель, эти мыши показали безудержной метастазы легких. В соответствии с моделью мыши имплантация неоднородных клеток RENCA на CAM успешно росла и впитывалась в кровь эмбрионов цыпленка. Путем расширять период роста тумора до 2 неделей после вылупления, метастаза легкя походные те увиденные в мышке были увидены в цыплятах.
Для обеих моделей, пристальное внимание к техническим деталям каждого шага и практики для улучшения технических навыков имеют важное значение для повышения выживаемости животных и успешного прививок опухоли и метастазировать. Для мышиной модели тщательный выбор оборудования и точная инъекция опухолевых клеток в почечную капсулу максимизирует показатель успеха за счет снижения послеоперационной смертности и увеличения вероятности для опухоли, чтобы получить адекватное кровоснабжение расти и метастазировать. Модель CAM требует дополнительной оптимизации в настройке и технике. В наших исследованиях жизнеспособность эмбриона в начале была ниже 30%. Важно всегда поддерживать температуру и влажность на нужном уровне, имея хорошее оборудование, частый мониторинг и более быстрое завершение процедур. Даже после оптимизации, выживаемость колеблется от 50-75% в зависимости от экспериментатора и индивидуальной партии яиц. Рекомендуется всегда заказывать дополнительные яйца для резервного копирования. По нашему опыту, освоение методов CAM требует более 1 года. Удаление мембраны CAM и открытие окна является критическим шагом, где чаще всего происходит случайный, смертельный ущерб эмбриону. Жизнеспособность эмбриона цыпленка может быть улучшена путем предотвращения повреждения CAM.
Существует несколько ограничений для модели опухоли CAM. Во-первых, применимость модели ко всем типам опухолевых клеток. У нас был 100% успех прививая различные установленные линии опухолевых клеток на CAM, в том числе почек, мочевого пузыря и линий опухолевых клеток простаты (RENCA, ACHN, T24, HT1376, CWR22Rv1, C4-2, Myc-CaP) и линии раковых клеток яичников (ID8 и SKOV3). Два дополнительных исследования от нашей группы предоставить дополнительную информацию об этих опухолей CAM25,27. Тем не менее, рост некоторых клеток рака яичников на CAM усиливается за счет добавок фактора роста или опухолевых клеток25. Важное значение имеет оптимизация числа клеток или существенного фактора роста (ы) для каждой клеточной линии или типа. Мы также включаем репортирующие или маркерные гены, такие как люцифераза, белковые метки (например, HA или флаг), или флуоресценции теги (например, mStrawberry или EGFP), чтобы облегчить мониторинг роста и метастазов опухоли у животных25,27. Основываясь на нашем опыте, подавляющее большинство пролиферирующих раковых клеток линий могут быть установлены на CAM. Ключевым ограничением для прививок может быть короткое 10-дневное окно, допустимое для роста опухоли, что может быть особенно сложным для медленно растущей клеточной линии, чтобы установить достаточную массу в такой короткий промежуток времени.
Другим недостатком модели CAM является разница в физиологии между птичьим эмбрионом и млекопитающими. Метастаз от опухоли CAM к основным органам, таким как печень или легкие эмбриона был обнаружен преимущественно чувствительных методов ПЦР28. Короткий период роста CAM будет недостаточным для установления крупных метастатических поражений, которые могут быть проверены гистологическим анализом. Кроме того, снижение сосудистой перфузии невыдутого эмбриона легких не является благоприятным для установления или поддержки роста метастаз легких. Чтобы преодолеть эти ограничения, было получено одобрение от нашего институционального комитета по использованию животных (IACUC), чтобы вылупить кур из опухоли CAM, несущей эмбрионы, и разместить их еще через 2 недели после вылупления. Продление времени роста опухоли таким образом позволило нам обнаружить отдаленные метастаза легких IHC. Хотя вылупившихся исследований курицы требуют дополнительного одобрения IACUC, что ИССЛЕДОВАНИЯ опухоли CAM нет, этот подход предоставляет ценную возможность для изучения метастатического каскада у кур, как это было ранее сделано у мышей. Куриная иммунная система, как сообщается, развиваться, начиная с 12 день после оплодотворения20. Учитывая высокую эффективность прививки мурин производных RENCA опухолей сообщили здесь и многие другие человеческие раковые клетки линий и PDXs в CAM на день 10 после оплодотворения24,25,27, мы могли бы сделать вывод, что иммунная система в эмбрионе не полностью разработаны на данный момент. Взаимодействие иммунной системы курицы и опухоли CAM явно требует дальнейшего исследования.
Наша работа предоставляет убедительные подтверждающие доказательства того, что модель опухоли CAM может быть простой начальной моделью in vivo для изучения биологии рака, включая метастазы. Из-за ограничений, отмеченных выше, модель CAM не должна заменить модель мыши, но дополнять ее. Наши текущие исследования показывают, что сигнал перекрестный разговор между разнородными популяциями клеток в ccRCC играет важную роль в управлении метастатическимпрогрессированием 11,12. Использование моделей CAM и мыши может быть ценным средством проверки метастатического перекрестного разговора в игре в ccRCC. Мы считаем, что многочисленные преимущества модели CAM, представленной здесь, могли бы ускорить темпы открытия новых метастатических механизмов и эффективных методов лечения для исправления этой смертельной стадии рака.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была профинансирована за счет гранта UCLA JCCC семян, UCLA 3R грант, UCLA CTSI, и UC TRDRP (LW). Мы благодарим Доклинический Центр визуализации Института Крамп, TPCL и отдел лабораторной медицины для животных Калифорнийского университета (DLAM) за помощь в экспериментальных методах. Поток цитометрии была выполнена в UCLA Джонсон Всеобъемлющий онкологический центр (JCCC) и Центр по исследованию СПИДа поток цитометрии Основной фонд, который поддерживается Национальными институтами здравоохранения награды P30 CA016042 и 5P30 AI028697, а также JCCC, UCLA Институт СПИДа, Дэвид Геффен школы медицины в Калифорнийском университете, UCLA канцлера. Статистические консультации и услуги анализа данных были предоставлены UCLA CTSI биостатистика, эпидемиология, и научно-исследовательский дизайн (BERD) Программа, которая поддерживается NIH / Национальный центр по продвижению трансляционной науки UCLA CTSI Грант номер UL1TR001881.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
- Cohen, H. T., McGovern, F. J.
- Bianchi, M., et al. Distribution of metastatic sites in renal cell carcinoma: a population-based analysis. Annals of Oncology. 23 (4), 973-980 (2012).
- Hsieh, J. J., et al.
- Foster, K., et al. Somatic mutations of the von Hippel-Lindau disease tumour suppressor gene in non-familial clear cell renal carcinoma. Human Molecular Genetics. 3, (1994).
- Young, A. C., et al. Analysis of VHL Gene Alterations and their Relationship to Clinical Parameters in Sporadic Conventional Renal Cell Carcinoma. Clinical Cancer Research. 15 (24), 7582-7592 (2009).
- Gossage, L., Eisen, T., Maher, E. R. VHL, the story of a tumour suppressor gene. Nature Reviews Cancer. 15 (1), 55-64 (2015).
- Sato, Y., et al. Integrated molecular analysis of clear-cell renal cell carcinoma. Nature Genetics. 45 (8), 860-867 (2013).
- Choueiri, T. K., et al. The role of aberrant VHL/HIF pathway elements in predicting clinical outcome to pazopanib therapy in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma. Clinical Cancer Research. 19 (18), 5218-5226 (2013).
- Hsu, T. Complex cellular functions of the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene: insights from model organisms. Oncogene. 31 (18), 2247-2257 (2012).
- Albers, J., et al. Combined mutation of Vhl and Trp53 causes renal cysts and tumours in mice. EMBO Molecular Medicine. 5 (6), 949-964 (2013).
- Schokrpur, S., et al. CRISPR-Mediated VHL Knockout Generates an Improved Model for Metastatic Renal Cell Carcinoma. Scientific Reports. 6, 29032 (2016).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
- Heerboth, S., et al.
- DeBord, L. C., et al. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as a versatile patient-derived xenograft (PDX) platform for precision medicine and preclinical research. American Journal of Cancer Research. 8 (8), 1642-1660 (2018).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Ismail, M. S., et al. Photodynamic Therapy of Malignant Ovarian Tumours Cultivated on CAM. Lasers in Medical Science. 14 (2), 91-96 (1999).
- Kaufman, N., Kinney, T. D., Mason, E. J., Prieto, L. C. Maintenance of human neoplasm on the chick chorioallantoic membrane. The American Journal of Pathology. 32 (2), 271-285 (1956).
- Janse, E. M., Jeurissen, S. H. Ontogeny and function of two non-lymphoid cell populations in the chicken embryo. Immunobiology. 182 (5), 472-481 (1991).
- Leene, W., Duyzings, M. J., van Steeg, C. Lymphoid stem cell identification in the developing thymus and bursa of Fabricius of the chick. Zeitschrift fur Zellforschung und Mikroskopische Anatomie. 136 (4), 521-533 (1973).
- Solomon, J. B. Foetal and neonatal immunology (Frontiers of biology). 20, North-Holland Pub. Co. (1971).
- JoVE Science Education Database.
- Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of Visualized Experiments. (51), e2815 (2011).
- Fergelot, P., et al. The experimental renal cell carcinoma model in the chick embryo. Angiogenesis. 16 (1), 181-194 (2013).
- Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. Journal of Visualized Experiments. , In Press (2019).
- Lőw, P., Molnár, K., Kriska, G. Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 265-324 (2016).
- Hu, J., Ishihara, M., Chin, A. I., Wu, L. Establishment of xenografts of urological cancers on chicken chorioallantoic membrane (CAM) to study metastasis. Precision Clinical Medicine. 2 (3), 140-151 (2019).
- Casar, B., et al. In vivo cleaved CDCP1 promotes early tumor dissemination via complexing with activated beta1 integrin and induction of FAK/PI3K/Akt motility signaling. Oncogene. 33 (2), 255-268 (2014).
