Summary
転移性透明細胞腎細胞癌は、徹底的な前臨床調査のための包括的な動物モデルのない疾患である。このプロトコルは、この疾患の2つの新しい動物モデルを示している:異所的に移植されたマウスモデルと鶏絨毛アラント膜モデルは、いずれも臨床症例に似た肺転移を示す。
Abstract
転移性透明細胞癌(ccRCC)は、腎臓癌の最も一般的なサブタイプである。局在ccRCCは、良好な外科的結果を有する。しかし、ccRCC患者の3分の1は肺への転移を発症し、これは患者にとって非常に悪い結果に関連する。残念ながら、転移の分子機構は不明のままであるため、この致命的な段階では治療法はありません。フォンヒッペル-リンダウ(VHL)腫瘍抑制遺伝子の機能の喪失はccRCCの病態である25年間知られている。しかし、ccRCCの臨床的に関連するトランスジェニックマウスモデルは生成されていない。このプロトコルの目的は、転移性ccRCCのための2つの新しく確立された動物モデルを紹介し、比較することです。1つ目はマウスモデルにおける腎移植である。当研究室では、CRISPR遺伝子編集システムを利用して、いくつかのRCC細胞株のVHL遺伝子をノックアウトしました。腎カプセルへの異種ccRCC集団の正体移植は、免疫担当マウスにおける堅牢な肺転移を発症する新しいccRCCモデルを作成した。2つ目のモデルは、鶏絨毛多対数膜(CAM)システムです。マウスモデルと比較して、このモデルはより多くの時間、労力、コスト効率が高い。このモデルはまた、堅牢な腫瘍形成および血管内形成を支持した。CAMにおける腫瘍増殖の10日間の短い期間のために、採取した胚組織において免疫組織化学(IHC)によってあからさしい転移は認められなかった。しかし、孵化した鶏で腫瘍増殖を2週間延長したところ、肺にIHCにより微小転移性ccRCC病変が観察された。これら2つの新しい前臨床モデルは、転移の背後にある分子機構をさらに研究し、転移性ccRCCの新規治療法の開発に向けて新しい患者由来異種移植片(PDX)を確立するのに役立つだろう。
Introduction
腎細胞癌(RCC)は、米国で7番目に多い癌である。毎年74,000人のアメリカ人が新たに診断されると推定され、14,000人以上の死亡を占めています(クリアセル組織学的サブタイプ(ccRCC)は最も一般的なサブタイプであり、RCC症例の約80%を占めています。局在性悪性腫瘍患者は腎摘出術で治療され、良好な5年生存率は73%1である。しかし、患者の25%〜30%が肺などの重要な器官への遠隔転移を発症し、13ヶ月の平均生存率が低く、5年生存率はわずか11%1、2、3である。転移性ccRCCの致命的な結果を改善するためには、転移機構をさらに理解する必要がある。
VHL腫瘍抑制遺伝子の喪失は、ヒトccRCC症例の大半で認められる特徴である遺伝的病変4、5、6、7である。しかし、ccRCCにおけるVHL損失の正確な発癌機構は不明である。また、VHL式の状態は、ccRCC8における結果の予測ではありません。特に、腎上皮標的VHLノックアウトで数多くの試みにもかかわらず、科学者たちは、PTENおよびp5310のような他の腫瘍抑制剤の欠失と組み合わせても、マウス9で観察された前生性嚢胞性病変を超えて腎異常を生成することができなかった。これらの知見は、VHLの損失だけでは腫瘍形成またはその後の自発的転移には不十分であるという考えを裏付けている。
最近、我々の研究室は、マウスVHL+ ccRCC細胞株(RENCA、またはVHL-WT)11、12におけるVHL遺伝子のCRISPR/Cas9媒介性欠失を用いて新しいVHLノックアウト(VHL-KO)細胞株を作成した。我々は、VHL−KOが間葉だけでなく、VHL−WT細胞12の間葉転換(EMT)への上皮移行(EMT)を促進することを示した。EMTは、転移プロセス13において重要な役割を果たすることが知られている。我々の研究はさらに、遠くの肺転移が腎臓におけるVHL-KO細胞およびVHL-WT細胞の共移植によってのみ起こり、転移の協調メカニズムを支持することを示した。重要なことに、当社の正体移植されたVHL-KOおよびVHL-WTモデルは、堅牢な肺転移をもたらし、臨床ccRCC症例を再現する。この自然転移性ccRCCモデルは、特に新しい抗転移薬の開発において、トランスジェニック転移性マウスモデルの欠如を補う。このプロトコルは、遺伝子組み換えRENCA細胞の異種細胞集団の腎カプセル移植を実証する。
鶏CAMモデルは、表114、15、16、17、18に要約されるように、その多くの利点のために血管新生および腫瘍生物学の研究において長い歴史を有する。簡単に言えば、CAM腫瘍成長のための時間枠は短く、鶏16の孵化時にCAMが破壊されるまで最大11日間を可能にする。短い成長時間にもかかわらず、鶏胚の豊富な栄養供給および免疫不全状態は、非常に効率的な腫瘍生着16、19、20、21を可能にする。最後に、SCIDマウスの場合は100ドルを超えるのに対し、各受精卵のコストは〜$1です。CAMモデルは、マウスと比較して時間とコストを大幅に節約し、新しいPDXを確立する上で貴重な代替動物モデルとして役立ちます。このプロトコルでは、マウスの正所モデルで観察された転移性ccRCCの生物学を再現できるかどうかを評価した。
| (SCID)マウス | カム | メモ | |
| コスト | >$100 各 | ~$1 各 | 50~75%の生存率 |
| バリアハウジングの必要性 | はい | いいえ | さらにコストを削減&簡単に腫瘍の連続監視 |
| 腫瘍は直接見える | いいえ | はい | 図 3A |
| 最初の生着までの時間(RENCA) | 2週間 | 2~4日 | ref 14, 15 |
| 成長のエンドポイント(RENCA) | 3-6週間 | 10日間 | ref 14, 15 |
| 転移(RENCA)観察 | はい | はいひよこで | 図 3D |
| シリアルパッセージ | はい | はい | ref 16-18 |
| マウスへの通路(レンカ) | はい | はい | Hu, J., らレビュー中 (2019) |
| 腫瘍の不均一性を維持する | はい | はい | Hu, J., らレビュー中 (2019) |
表 1: マウスモデルと CAM モデルの利点と制限この表は、必要な時間、コスト、労力、および生物学の面で、その利点と制限の2つのモデルを比較します。CAMモデルは効率の利点があるが、それはまた鳥と哺乳類の間の異なった形態による独特の限界がある。したがって、モデルが異種移植片の生物学を保持できることを確認することが重要です。
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Protocol
ここに記載されているすべての方法は、UCLA首相動物研究委員会(ARC)(ARC 2002-049-53およびARC 2017-102-01A)として指定された機関動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されています。2002-049-53プロトコルはヌードまたはBALB/cマウスの腎臓のカプセルへのccRCC腫瘍細胞の注入のために最大限に活用される。孵化前の受精鶏卵における腫瘍移植実験は、IACUCの承認を必要としない。肺転移の確立のための時間を延長するために、CAM腫瘍を有する胚は孵化し、鶏に成長することが許される。2017-102-01Aプロトコルは、これらの動物実験をカバーしています。
1. マウスにおける正所腫瘍研究
注: この実験のタイムラインを図1Aに示します。これらの手順は、以前の出版物11、12から適応されました。
- 移植用の単一細胞懸濁液の調製
- トリプシン/EDTAを使用して培養皿からRENCA VHL-WTおよびVHL-KO細胞を切り離します。
- 細胞を溶細胞計で数え、PBSと細胞外マトリックス溶液の1:1混合物中で、1x105細胞/μLの濃度で再懸濁します。
注:異種インプラントにはVHL-WT:VHL-KO細胞の1対4の比率を使用し、均質なインプラントの場合はVHL-WT単独で使用してください。 - 再懸濁された細胞を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、注入まで氷の上に置きます。
- 腎カプセルへの移植
- 麻酔:37°Cに温かいパッドを予熱し、厚い無菌ドレープでそれをカバーします。誘導室を介したイソファフルラン吸入または10 mL/kgの投与量で1%ペントバルビタールナトリウムの腹腔内(IP)注射のいずれかによってマウスを麻酔する。
- 手術部位から髪を剃る。ヌード マウスの場合、この手順はスキップできます。
- 消毒と外科用ドレープ:マウスの背面をポリビドネヨウ素3xで完全に消毒し、続いて70%エタノール1xを続け、滅菌綿棒で乾燥させます。その後、3つの無菌医療ドレッシングを順次適用し、外科的フィールドを作成し、マウスを固定化するために背中全体を覆う。
- 切開および腎臓の外装:手術前に、オペレータの指をポビドンヨウ素で消毒するか、または一対の滅菌手袋を使用する。マウスを起こりやすい位置に置き、指を使って左の側の右下の左腎臓を見つけます。鈍い鉗子とはさみを使用して、皮膚を切り開き、筋肉層を指定した場所の下に切り取ります。無菌綿棒と鉗子を使用して、左腎臓を腹部から部分的に外装します。
- 腫瘍細胞移植:インスリン注射器またはカスタマイズされたハミルトン注射器のいずれかでステップ1.1で調製した細胞懸濁液をロードします(仕様については材料表を参照)。腎臓カプセルの下に20μLの再懸濁細胞を注入する。
注:正常な注射は、腎臓の表面に半透明の膨らみが形成されることにより決定されます。腎性内皮に偶発的に注射すると、注射部位の致命的な出血による出血と術後死亡率が90%と高くなる。 - 細胞外マトリックス溶液が固まり、出血や腫瘍細胞の漏出を防ぐためにゆっくりと針を引き出します。次に、無菌綿棒を使用して、腎臓を腹部に押し戻す。
- 巻きステッチ:筋肉層をステッチするために5-0コーティングされたVICTRYL縫合糸を使用してください。一度ポビドネヨウ素で皮膚を消毒し、創傷オートクリップで皮膚を閉じます。
- 回復:マウスが目を覚ますまで、暖かいパッドの上に置きます。マウスが吸入によって麻酔された場合、イソファフルランを引き出し、マウスが目を覚ますまで暖かいパッドの上に置いてください。
- 生物発光イメージング(BLI)と組織採取
- 腫瘍移植から6週間後、ホタルルシフェラーゼベースのBLI画像を撮る。次に、イソファフルラン吸入でマウスを安楽死させ、その後に頸部脱臼を行う。
- 循環腫瘍細胞(CTC)検出のための血液をフローサイトメトリーで採取する。
- 目的の収穫腫瘍および臓器(腎臓、肺、肝臓、腸、脾臓)を使用して、無菌組織採取技術22。パラフィンワックス埋め込みのために一晩パラホルムアルデヒドを4%で固定します。
2. CAM腫瘍異種移植片モデル
注 : これらの手順は、以前に公開されたプロトコル23、24.この手順のタイムラインを図 1Bに示します。この記事では、合理化されたプロトコルのみを紹介します。詳細なプロトコルについては、グループ25が発行する別のJoVEの記事を参照してください。
- プレインキュベーション:37°Cで回転卵インキュベーターに産卵した受精鶏卵をインキュベートし、湿度55〜65%を7日間保ちます。
- CAM をドロップして開いたウィンドウ (開発 7 日目):
- エアサックと静脈を見つけてマークします。
注:通常、卵の10〜15%は、受精していないか、受精後7日以内に死ぬため、取り除かれます。 - マークされた静脈の上に新しい空気嚢を作成します。
- 新しい空気嚢を線引きし、梱包テープを塗布し、卵をインキュベーターに戻します。
注: 手順はここで一時停止できます。空気嚢が動く可能性があるため、同じ日内に手順を再開することをお勧めします。 - 窓を開ける:湾曲した微小解剖はさみと針鼻鉗子のペアを使用して、シェルで1.5 x 1.5 cmの円形窓を切ります。
注: CAM の中断は、切断されたシェルピース上に存在する血液と CAM の一部によって示されます。 - 透明な医療ドレッシングで穴を密封し、37 °Cおよび55%-65%の湿度で静止したインキュベーターに卵を置きます。
注:ステップ2.1と同じ卵インキュベーターを使用してください。回転をオフにして静止します。
- エアサックと静脈を見つけてマークします。
- 健康診断(発生日9):死んだ卵を取り除き、腫瘍細胞移植のために残りの卵をランダムにグループ化する。
注: 理想的には、この時点での生存率は、開発の 0 日目の約 80% です。 - 新たに公開されたCAMに腫瘍細胞を移植する(発生10日目)
- 細胞外マトリックス溶液を前冷却RPMI 1640(L-グルタミン)の2倍の体積で希釈します。RENCA細胞を取り外し、上記溶液中で再懸濁し、2 x 104細胞/μLの濃度に達します。
注:異種インプラントにはVHL-WT:VHL-KO細胞の1対1の比率を使用し、均質な移植用のVHL-WT単独で使用してください。 - 細胞懸濁液を高めるには、各細胞ミックスの100μLを200 μLピペットチップに充填し、15分間細胞インキュベーターに入れる。
- 窓を通してCAM表面の各卵のための細胞の懸濁液の100のμLを注入する。
メモ:一部のプロトコルでは、移植前にCAMを傷つける必要があります23.これは、RENCA細胞にとって必要ではありません, 彼らは非常に迅速に成長するので、.
- 細胞外マトリックス溶液を前冷却RPMI 1640(L-グルタミン)の2倍の体積で希釈します。RENCA細胞を取り外し、上記溶液中で再懸濁し、2 x 104細胞/μLの濃度に達します。
- CAM上で10日間細胞を成長させ、2日ごとに撮影します。
- 安楽死し、腫瘍、血液、および臓器を収穫します。
- 発生日20日目(腫瘍10日目)に、ヘパリン10mLシリンジで絨毛アリント静脈を介して血液を採取する。
- 15分間氷の上に置くことによって胚を安楽死させる。
- 収穫と重量を量る腫瘍。マウス22に使用されるのと同様の滅菌組織収穫技術を用いて肺および肝臓を解剖する。
注:鶏の肝臓には、腹腔に見られる最初の器官である2つのローブがあります。これらを肺と混同しないでください。鶏の肺は心臓と中隔の下に位置しています26.肺の正常なコレクションは露出した肋骨によって確認することができる。 - パラフィンワックス埋め込みのために腫瘍と解剖された器官を一晩4%のパラホルムアルデヒドで固定する。
- 鶏を孵化させる。
- 腫瘍の成長の延長期間を可能にするために、21日目までインキュベーションを続け、鶏を37°Cおよび少なくとも60%の湿度で孵化させる。
注:ニワトリは24時間の期間にわたって21日目以降は自然に孵化しますが、時には自分で孵化するのが難しい場合があります。この場合、卵殻を割るいくつかの助けになります。鶏はその後栄養素の不足で死ぬので、24時間以内に孵化プロセスを完了することが重要です。 - 動物施設(2017-102-01A)で鶏を2週間育てる。
- 発達日34日目(腫瘍24日目)に、イソファフルラン吸入で雛を安楽死させ、その後に頸椎脱臼を行う。
- マウス22に使用されるものと同様の滅菌組織収穫技術を用いて肺を解剖する。次いで、パラフィンワックス埋め込みのために一晩パラホルムアルデヒドを4%で固定する。
- 腫瘍の成長の延長期間を可能にするために、21日目までインキュベーションを続け、鶏を37°Cおよび少なくとも60%の湿度で孵化させる。
3. 免疫学化学
注:すべての組織切除およびH&E染色は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校のトランスレーショナル病理学コアラボラトリー(TPCL)によって行われました。
- 65°Cで20分間スライドし、キシレンを用いて3倍に脱水し、100%エタノールから水に連続して水分補給します。
- 植物性蒸し器で25分間煮込んだクエン酸バッファーで抗原を取り出す。
- ブロッキングに 1% BSA を適用します。次いで、PBS中の1:200希釈率で調製した一次抗体(抗VHL、抗HA、抗フラグ)を適用する。4°Cで一晩インキュベートする。
- TBST(それぞれ7分)で3xを洗浄した後、1:200希釈で二次抗体を用いてスライドをインキュベートします。3xをTBST(それぞれ7分)で洗浄し、DAB試薬を塗布し、続いてヘマトキシリンカウンターステインを塗布します。
4. フローサイトメトリー
- 製造元のプロトコルに従って赤血球(RBC)のリシスバッファーでマウスまたは鶏の血液を処理します。
注:鶏のRBCは有核であり、前方および側面の散乱を使用して流れサイトメトリーで容易に区別することができないので、CAMの血液を分析するとき十分なRBCの適用は特に重要である。 - 血液ライセートのフローサイトメトリーを実行し、mストロベリーおよびEGFP発現のデータを分析します。
- デブリ、死細胞、および無水のRBCを除く前方散乱と側面散布に基づいてプライマリゲートを設定します。
- 未染色サンプルおよび単一染色制御に基づいて蛍光ゲートを設定する。VHL-WT、VHL-KO、または未標識RENCA細胞をそれぞれ単一染色制御および未染色コントロールとしてプライミングした血液ライセートを使用してください。
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Representative Results
各実験は、特に明記されていない限り、少なくとも3倍に行った。データは平均±標準偏差(SD)として提示される。有意性は、2つのグループがあった場合のペアのスチューデントT検定、または3つ以上のグループがあった場合の一方向分散分析によって決定された。0.05 の p 値カットオフを使用して、有意性を確立しました。
正体移植されたRENCA細胞は、BLIおよびH&E染色によって確認されるように、マウス腎臓上で正常に成長した(図2A-B)。原発性増殖には差はなかったが、H&E染色における非常に強いBLIシグナルおよび転移結節によって示されるように、異質な転移性腫瘍のみが肺に対して強固な転移を有していた。一方、均質な非転移性腫瘍は、遠くの器官に転移しなかった。CTCカウントは、転移性腫瘍を有するマウスにおいて、転移性腫瘍を有するものよりも高かった(図2C-D)。
マウスモデルとの一連の関係において、CAMシステムは、RENCA腫瘍の増殖および転移性挙動を正常に保持した。転移性腫瘍と非転移性腫瘍の間に生育差はなかったが、CTCカウントは、転移性腫瘍を有する卵子において、非転移性腫瘍と比べて有意に高かった(図3A-C)。CAM腫瘍で卵子を孵化させ、鶏が鶏肺組織の切片のH&EおよびHA染色に示すように、転移性癌細胞が鶏の肺に組織学的に検出可能な転移を確立するための期間をさらに2週間延長することを可能にする(図3D)。転移性結節の大部分はHAタグ付きVHL-WT細胞で構成されていましたが、マウスで観察されているように、フラグタグ付きVHL-KOはめったに見られなかった。
図1:転移性ccRCC異種移植片の2つの動物モデルの概要。(A) マウスの正投影モデルの概略図。3週齢または4週齢のマウスは、非転移性腫瘍または転移性腫瘍のいずれかで正体移植される。移植後6週間、腫瘍の増殖および転移をBLIで可視化した。次いで、腫瘍、血液、および臓器を下流の分析のために採取した。(B)以下のステップを示すCAMモデルの概略図:プリインキュベーション、窓開け、細胞移植、および孵化前後の安楽死。収集したサンプルに対して、マウス モデルと同じ分析が実行されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:異所移植マウスにおける腫瘍の増殖および転移(A) レンカ細胞の正所移植から6週間後にマウス及び抽出臓器(腎臓、肺、肝臓、腸、脾臓)のBLIを行った。左: 非メタスタティック (非満ち) (非会合) 右: メタデータ。(B) 腎臓と肺のH&E染色の総視野と拡大(20xおよび100x)左: 非メタスタティック (非満ち) (非会合) 右: メタデータ。(C) 血液中を循環するmStraw+およびEGFP+細胞を検出するための代表的な流量分析。(D) 循環mStraw+およびEGFP+細胞の母集団グラフ。非満: 非転移性。パネルAはHuら27から適応された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:CAMモデルにおける腫瘍の増殖および転移(A) CAMで増殖したレンカ腫瘍。グループごとに7つの繰り返しがありました。非満: 非転移性。(B) 血液中を循環するmStraw+およびEGFP+細胞を検出するための代表的な流量分析。(C) 循環mStraw+およびEGFP+細胞の母集団グラフ。**p < 0.01.(D) 胚期に転移性腫瘍を有する生後2週齢のひよこからの肺のIHC染色。左から、H&E、HA、およびフラグ染色を示します。#: 鶏肺動脈;矢印:転移性結節。この図はHu Jらから適応しました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
上皮性悪性腫瘍を有する多くの患者にとって、重要な器官への転移が死亡の主な原因である。したがって、転移性疾患の根本的なメカニズムと新しい治療法の道を見つけることが不可欠です。残念ながら、関連する転移性ccRCC動物モデルが不足しています。大部分の課題は、多数のトランスジェニック腎臓上皮標的VHLノックアウトマウスモデル9、10の生成にもかかわらず、マウスでccRCCを再現できないことによるものである。ここでは、マウスと鶏CAMの2つの動物系において移植可能な転移性ccRCC腫瘍を確立する方法を実証する。これらの知見は、2つの異なる環境における腫瘍の転移性挙動を検証し、転移の分子機構をさらに調査するユニークな機会を提供する。最初のモデルでは、異種RENCA集団を免疫能力マウスに対して腎臓カプセルに対して正体的に移植した。6週間後、これらのマウスは肺転移が横行する様子を示した。マウスモデルとの一体性において、CAM上の異種RENCA細胞の移植は正常に成長し、ひよこ胚の血液中に浸入した。孵化後2週間に腫瘍増殖期間を延長することにより、マウスに見られるものに似た肺転移がひなに観察された。
両方のモデルについて、各ステップの技術的な詳細に細心の注意を払い、技術的なスキルを向上させる練習は、動物の生存率と腫瘍の生着と転移を成功させるために不可欠です。マウスモデルの場合、装置の慎重な選択と腎カプセルへの腫瘍細胞の正確な注入は、術後の死亡率を減少させ、腫瘍が十分な血液供給を得る機会を増やすことによって成功率を最大化し、転移。CAM モデルでは、設定とテクニックの最適化が必要になります。我々の研究では、胚の生存率は最初は30%を下回っていた。良好な機器、頻繁な監視、および手順の迅速な完了を持つことによって、常に所望のレベルに温度と湿度の両方を維持することが重要です。最適化後も、生存率は実験者と卵の個々のバッチに応じて50〜75%の範囲です。バックアップのために常に余分な卵を注文することをお勧めします。私たちの経験では、CAM技術を習得するには1年以上必要です。CAM膜を落とし、窓を開くことは、偶発的で致命的な胚への損傷が最も頻繁に起こる重要なステップである。ひよこ胚の生存率は、CAMへの損傷を防ぐことによって改善することができる。
CAM腫瘍モデルにはいくつかの制限がある。第1に、全ての腫瘍細胞型に対するモデルの適用性である。私たちは、腎臓、膀胱、前立腺腫瘍細胞株(RENCA、ACHN、T24、HT1376、CWR22Rv1、C4-2、Myc-CaP)および卵巣癌細胞株(ID8およびSKOV3)を含む、CAM上の異なる確立された腫瘍細胞株を移植する100%の成功率を有しています。我々のグループからの2つの追加の研究は、これらのCAM腫瘍に関するさらなる情報を提供します25,27.しかし、CAM上のいくつかの卵巣癌細胞の成長は、成長因子または腫瘍関連細胞25の補充によって増強される。細胞数または細胞種別の細胞数の最適化や、細胞種別の必須増殖因子の最適化が重要です。また、レポーターまたはマーカー遺伝子、例えばルシフェラーゼ、タンパク質タグ(例えば、HAまたはフラグ)、または蛍光タグ(例えば、mストロベリーまたはEGFP)を組み込み、動物25、27における腫瘍の増殖および転移のモニタリングを容易にする。私たちの経験に基づいて、増殖する癌細胞株の大部分はCAMで確立することができる。生着の主な制限は、腫瘍の成長のために許可される短い10日間のウィンドウであり、このような短い時間枠で十分な質量を確立するために成長の遅い細胞株にとって特に困難である可能性があります。
CAMモデルのもう一つの欠点は、鳥類胚と哺乳類の間の生理学の違いです。CAM腫瘍から胚の肝臓や肺などの主要臓器への転移は、主として感受性PCR技術28によって検出されている。CAMの成長の短い期間は、組織学的分析によって検証することができる大きな転移性病変を確立するには不十分であろう。さらに、膨張していない胚肺の血管灌流の減少は、肺転移の成長を確立または支持するために好ましくない。これらの制限を克服するために、私たちの機関動物使用委員会(IACUC)からの承認を得て、CAM腫瘍を持つ胚から鶏を孵化させ、孵化後2週間でさらに飼育しました。このように腫瘍の増殖時間を延長することで、IHCによる遠隔肺転移を検出することができました。孵化した鶏の研究は、CAM腫瘍研究が行わない追加のIACUC承認を必要とするが、このアプローチは、マウスで以前に行われたように鶏の転移性カスケードを研究する貴重な機会を提供する。鶏の免疫システムは、受精後12日目から発症することが報告されています20.受精24、25、27の10日目にCAMで報告された他の多くのヒト癌細胞株およびPDXの移植性マウス由来RENCA腫瘍の高効率を考えると、我々は胚の免疫系がこの時点で完全に発達していないと推測することができた。鶏の免疫系とCAM腫瘍の相互作用は明らかにさらなる調査を保証する。
我々の研究は、CAM腫瘍モデルが転移を含む癌生物学を研究するための単純な初期インビボモデルであり得ることを強く支持する証拠を提供する。上記の制限により、CAM モデルはマウス モデルを置き換えるのではなく、それを補完する必要があります。我々の進行中の研究は、ccRCCにおける異種細胞集団間のシグナルクロストークが転移性進行11、12の統治に役立っていることを示唆している。CAMとマウスの両方のモデルの使用はccRCCで遊びで転移性クロストークを検証する貴重な手段となり得ます。ここで紹介したCAMモデルの多くの利点は、がんのこの致命的な段階を改善するための新しい転移メカニズムと効果的な治療法の発見のペースを加速させる可能性があると考えています。
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Disclosures
著者たちは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この作業は、UCLA JCCCシード補助金、UCLA 3R助成金、UCLA CTSI、およびUC TRDRP(LW)によって資金提供されました。私たちは、クランプ研究所の前臨床画像施設、TPCL、UCLAの実験動物医学部門(DLAM)が実験的方法に協力してくれたことに感謝します。フローサイトメトリーは、国立衛生研究所賞P30 CA016042および5P30 AI028697によって支援されているUCLAジョンソン総合がんセンター(JCCC)とエイズ研究フローサイトメトリーコア施設で行われ、JCCC、UCLAエイズ研究所、デビッド・ゲッフェン医学部、UCLA首相事務所、UCLA統計コンサルティングおよびデータ分析サービスは、NIH/国立トランスレーショナルサイエンス進歩センターUCLA CTSIグラント番号UL1TR001881によって支援されているUCLA CTSI生物統計学、疫学、および研究デザイン(BERD)プログラムによって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | 25053CI | |
| 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | |
| anti-VHL antibody | Abcam | ab135576 | |
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD Biosciences | 14-826-79 | |
| BD Pharm Lyse | BD Biosciences | 555899 | |
| BDGeneral Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| DAB Chromogen Kit | Biocare Medical | DB801R | |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Gibco | LS14190250 | |
| DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R) | eBioscience | 14-6681-82 | |
| Ethanol 200 Proof | Cylinders Management | 43196-11 | Prepare 70% in water |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Fisher Scientific | 10-437-028 | |
| Fisherbrand Sharp-Pointed Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-940 | |
| Fisherbrand Sterile Cotton Balls | Fisher Scientific | 22-456-885 | |
| FisherbrandHigh Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| FisherbrandPremium Microcentrifuge Tubes: 1.5mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Formaldehyde Soln., 4%, Buffered, pH 6.9 (approx. 10% Formalin soln.), For Histology | MilliporeSigma | 1.00496.5000 | |
| Hamilton customized syringe | Hamilton | 80408 | 25 µL, Model 702 SN, Gauge: 30, Point Style: 4, Angle: 30, Needle Length: 17 mm |
| HA-probe Antibody (Y-11) | Santa Cruz Biotechnology | sc805 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D | |
| Isothesia (Isoflurane) solution | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | C354230 | |
| Medline Surgical Instrument Drape, Clear Adhesive, 24" x 18" | Medex Supply | MED-DYNJSD2158 | |
| OmniPur BSA, Fraction V [Bovine Serum Albumin] Heat Shock Isolation | MilliporeSigma | 2910-25GM | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution, 100X, 10,000 IU Penicillin, 10,000ug/mL Streptomycin | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Pentobarbital Sodium | Sigma Aldrich | 57-33-0 | Prepare 1% in saline |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-062 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) Available Iodine, for Laboratory Use | Ricca Chemical | 395516 | |
| pSicoR | Addgene | 11579 | |
| Puromycin dihydrochloride hydrate, 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC227420500 | |
| Renca | ATCC | CRL-2947 | |
| RPMI 1640 Medium (Mod.) 1X with L-Glutamine | Corning | 10040CV | |
| Scientific 96-Well Non-Skirted Plates, Low Profile | Fisher Scientific | AB-0700 | |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-200, 200 µl, 960 (10 racks of 96) | Thomas Scientific | 1159M40 | |
| Shipping Tape, Multipurpose, 1.89" x 109.4 Yd., Tan, Pack Of 6 Rolls | Office Depot | 220717 | |
| Suture | Ethicon | J385H | |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 1634 | |
| Thermo-Chicken Heated Pad | K&H manufacturing | 1000 | |
| Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | |
| VHL-KO | CRISPR/Cas9-mediated knockout of VHL, then lentivirally labeled with flag-tagged EGFP & firefly luciferase | ||
| VHL-WT | Lentivirally labeled with HA-tagged mStrawberry fluorescent protein & firefly luciferase | ||
| World Precision Instrument FORCEPS IRIS 10CM CVD SERR | Fisher Scientific | 50-822-331 | |
| Wound autoclips kit | Braintree scientific, inc. | ACS KIT | |
| Xylenes (Histological), Fisher Chemical | Fisher Scientific | X3S-4 |
References
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