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Immunology and Infection

Infection chronique, aigue et réactivée du VIH dans des modèles de souris immunodéficientes humanisés

doi: 10.3791/60315 Published: December 3, 2019

Summary

On décrit ici trois approches expérimentales pour étudier la dynamique de l'infection par le VIH chez les souris humanisées. Le premier permet l'étude des événements d'infection chronique, tandis que les deux derniers permettent l'étude des événements aigus après l'infection primaire ou la réactivation virale.

Abstract

Les sourisnulles humanisées de NOD/SCID/IL-2 de récepteur de chaîne de NOD/SCID/IL-2 récapitulent certaines caractéristiques de l'immunité humaine, qui peuvent être exploitées dans la recherche fondamentale et préclinique sur des maladies infectieuses. Décrit ici sont trois modèles de souris immunodéficientes humanisées pour étudier la dynamique de l'infection par le VIH. La première est basée sur l'injection intrahépatique de cellules souches hématopoïétiques CD34chez les souris nouveau-nées, ce qui permet la reconstitution de plusieurs cellules confinées dans le sang et les lymphoïdes, suivies d'une infection par une souche de référence du VIH. Ce modèle permet de surveiller jusqu'à 36 semaines après l'infection et est donc appelé le modèle chronique. Les deuxième et troisième modèles sont appelés modèles aigus et de réactivation, dans lesquels les cellules mononucléaires périphériques de sang sont injectées par voie intrapéritone chez les souris adultes. Dans le modèle aigu, les cellules d'un donneur sain sont greffées par la voie intrapéritonéale, suivies d'une infection par une souche de référence du VIH. Enfin, dans le modèle de réactivation, les cellules d'un donneur infecté par le VIH sous traitement antirétroviral sont greffées par voie intrapéritonéale. Dans ce cas, un environnement sans drogue chez la souris permet la réactivation du virus et une augmentation de la charge virale. Les protocoles fournis ici décrivent l'approche expérimentale conventionnelle pour les modèles humains et immunodéficients de souris de l'infection par le VIH.

Introduction

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Le modèle humanisé de souris NOD/SCID/interleukin (IL)-2 récepteur (ci-après appelé huNS -chaînenulle)modèle de souris a été largement utilisé pour étudier la pathogénie des infections, l'auto-immunité, et le cancer, ainsi que pour les études précliniques des médicaments et des thérapies à base de cellules humaines1,2. Ces souris sont basées sur un fond diabétique non-obèse (NOD), avec la mutation cid et la mutation ciblée au locus de chaîne de récepteur d'IL-2 (chaîne commune pour IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, et IL-21), qui induisent une altération grave dans le développement des cellules de t-, b-, et de tueur naturel (NK) de souris1. Ainsi, ils soutiennent l'engraftment des tissus humains, des cellules souches hématopoïétiques (HSC) humaines CD34 et humaines, et des cellules mononucléaires sanguines périphériques humaines (PBMC)3,4,5. En outre, l'expression transgénique des facteurs hématopoïétiques humains, tels que le facteur de cellules souches (SCF), le facteur de stimulation de colonie de granulocyte/macrophage (GM-CSF), et IL-3 favorise l'engraftment des populations myéloïdes humaines6,7,8.

Pour les études sur le VIH, plusieurs modèles de sourisnulles à chaîne huNS ont été décrits, qui diffèrent dans la souche de souris, le type de cellules humaines utilisées, le type de tissus pour l'engraftment, et l'origine des cellules (c.-à-d., sain vs. donneur infecté par le VIH)9,10. La souche originale, cependant, est largement utilisée en raison des niveaux élevés de greffe de cellules humaines et de réplication virale après l'infection avec une souche de référence du VIH11,12,13. Souches de souris immunodéficientes similaires avec expression transgénique de facteurs hématopoïétiques humains (p. ex., NOG-EXL ou NSG-SGM3) ou avec des implants de foie humain et de tissus thymus (souris de moelle-foie-thymus [BLT]) sont utiles pour évaluer le rôle des populations myéloïdes dans la réponse immunitaire anti-VIH, les effets du VIH sur ces tissus, et leur participation en tant que réservoirs viraux14,15. En outre, certaines souches avec l'expression transgénique des molécules humaines d'antigène de leucocyte (HLA), aussi bien que des souris de BLT, peuvent être employées pour étudier la réponse de T-cell à l'infection de HIV16,17.

En général, chez ces souris, l'humanisation dépend de l'origine cellulaire, de la voie d'accouchement (intrapéritonéal, intrahépatique, intraveineuse, intracardiaque) et de l'âge de la souris au moment de l'engraftment18,19,20. En ce qui concerne l'origine cellulaire, l'homme CD34- HSC dérivé du sang de cordon, du foie foetal, ou du sang périphérique mobilisé peut être injecté chez les souris nouveau-nées ou jeunes3,21. En outre, les sourisnulles adultes en chaîne de chaîne peuvent être humanisées par l'injection de PBMC (ici, appelée sourisnulles de la chaîne hu-PBL-NS), permettant la circulation temporelle de ces cellules dans le sang, les organes lymphoïdes secondaires et les tissus enflammés22,23,24.

Décrit ici est un protocole détaillé pour l'établissement de huNS -chaîne des modèles de sourisnulles pour l'étude de l'infection par le VIH. Le premier est le modèle chronique, dans lequel les CD34humains et les HSC dérivés du sang de cordon ombilical d'un donneur sain sont injectés chez des souris nouveau-nées, suivis d'une infection par une souche de référence du VIH après 14 semaines de reconstitution du système immunitaire humain. Ce modèle permet de surveiller les souris jusqu'à 36 semaines après l'infection. Le deuxième modèle est un modèle aigu, dans lequel les PBMC dérivés d'un donneur sain sont injectés chez des sourisnulles adultes de la chaîne NS, suivies d'une infection par une souche de référence du VIH après 3 semaines d'expansion des lymphocytes T humains chez la souris. Enfin, le troisième modèle est le modèle de réactivation, dans lequel les PBMC dérivés d'un donneur infecté par le VIH sous traitement antirétroviral suppressif (TAR) sont injectés chez des sourisadultes à chaîne NS. Dans ce cas, un environnement sans drogue permet la réactivation virale et l'augmentation de la charge virale. Les deux derniers modèles permettent une surveillance jusqu'à 9 semaines après l'engraftment.

Dans l'ensemble, ces trois modèles sont utiles pour les études virologiques, les études précliniques de nouveaux médicaments et l'évaluation des effets de l'infection par le VIH sur la réponse immunitaire mondiale. Il est également important de considérer que l'utilisation de souris infectées par le VIH doit être examinée et approuvée par le Comité institutionnel de biosécurité (BAC) ainsi que par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) avant toute expérience. Cela garantit que l'étude suit toutes les réglementations institutionnelles internes et externes pour l'utilisation de matières biologiques dangereuses et la manipulation humaine d'animaux expérimentaux.

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Protocol

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Dans le cadre de ce travail, tous les soins et procédures pour animaux ont été exécutés selon des protocoles examinés et approuvés par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'École de médecine de l'Université du Maryland (numéros de protocole 1018017, 1018018 et 0318009).

1. L'engraftment humain de CD34et de HSC des souris nouveau-nées

  1. Utilisez toujours de l'équipement de protection personnelle jetable (EPI), y compris des gommages stériles, des gants, des chaussures dédiées, des couvre-chaussures, un masque, des lunettes, un bonnet de cheveux et de barbe et des blouses de laboratoire stériles.
  2. Resuspendre 1 x 106 de CD34 congeléset HSC (voir Tableau des matériaux) dans 10 mL de RPMI 1640 médias 10 % FBS sous une armoire de biosécurité certifiée et maintenir des conditions stériles.
  3. Utilisez 10 L de la suspension pour compter (pour assurer la présence du nombre prévu de cellules) et vérifier la viabilité des cellules en tactant l'exclusion bleue trypan dans un hémocytomètre.
  4. Centrifugeuse à 400 x g pendant 15 min à température ambiante (RT). Jeter le supernatant et le resuspendre dans le FROID 1x PBS à la concentration requise (1,4 x 105 de CD34et HSC s'en50 L). Gardez les cellules sur la glace jusqu'à l'injection.
  5. Placer les chiots (nS-chaîne des chiotsnull des deux sexes à partir de 1 à 4 jours) dans un plat stérile de 100 mm2 Petri ainsi qu'une petite quantité de matériel de literie de la cage d'éleveur. En outre, frottez la literie propre entre les mains pour masquer davantage toutes les odeurs étrangères sur les chiots receveurs.
    REMARQUE: Cela minimise les odeurs étrangères étant imprégnés sur les chiots, améliorant ainsi les chances des mères d'accepter leurs chiots de nouveau dans les cages après la procédure.
  6. Placez le plat Petri dans une cage de transport propre et placez la cage dans une cage de microisolateur propre de souris pour protéger des chiots de l'environnement. Couvrir la cage de transport d'un coussin de couverture pour éviter l'exposition des animaux à la lumière extérieure pendant le transport vers la salle d'irradiation.
  7. Irradier les chiots avec 100 cGy irradiation du corps entier (WBI) par l'exposition à une source de 137 Cs. Nettoyez l'intérieur de l'irradiateur avec une solution désinfectante, placez les souris dans l'irradiateur et allumez la plaque tournante afin que tous les chiots soient irradiés de façon homogène. Fermez l'irradiateur et appuyez sur le commutateur d'alimentation pour initier le processus d'irradiation. Attendez que le temps d'irradiation soit terminé et retirez immédiatement les souris.
    REMARQUE : Comme l'irradiation ne génère pas de stress chez les souris, l'anesthésie préalable n'est pas nécessaire.
  8. 2 à 4 h après la procédure d'irradiation, placer les chiots dans une armoire de biosécurité à l'intérieur d'un plat petri stérile réfrigéré recouvert de gaze stérile sur la glace, jusqu'à ce qu'ils soient anesthésiés (5 à 10 min). Une anesthésie suffisante est obtenue lorsque les mouvements bruts cessent.
  9. Chargez la seringue avec une aiguille attachée (29 G, 0,5 po) avec 50 l de la suspension cellulaire et 1,4 x 105 de CD34et hSC sous l'armoire de biosécurité certifiée.
  10. Pour l'engraftment par injection hépatique, retenir les chiots avec le pouce et les index. Pour réduire au minimum la retenue de la souris (30 à 45 s), laissez un enquêteur tenir le chiot et administrer l'injection, et demandez au deuxième enquêteur de charger la seringue avec la suspension HSC. Nettoyez le site d'injection avec 70 % d'alcool et livrez 50 L de cellules directement dans le foie. Utilisez un angle d'aiguille peu profond lors de l'injection pour éviter de percer complètement le foie. En tant que contrôle, injecter des souris avec 50 oL de 1x PBS dans le foie.
  11. Déposer les chiots sur un plat Petri stérile préréchauffé recouvert de gaze stérile pendant 1 à 5 min pour permettre la récupération. Préchauffez le plat à l'aide d'un tampon de réchauffement infrarouge pour les rongeurs à 20 oC afin de vous assurer que les petits ne seront pas trop réchauffés.
  12. Immédiatement avant de retourner les chiots à leurs parents, appliquez une petite quantité d'onduleur à base de menthol et d'eucalyptus, à l'aide du pouce et des index, au museau des deux parents pour éviter le cannibalisme ou le rejet des chiots.
  13. Vérifiez les cages tous les jours, à la recherche de tout signe de maladie de greffe contre hôte (GVHD) chez les chiots tels que la peau sèche, pas d'alimentation, éruption cutanée, et l'alopécie. Euthanasier les animaux si l'un de ces signes est observé.
  14. Souris de soulement à 3 semaines d'âge, les regroupant par sexe. Ne mettez pas plus de 5 animaux par cage. Vérifier l'engraftment dans le sang périphérique par cytométrie de flux à 14 semaines d'âge.
    REMARQUE : Le taux de réussite de l'engraftment se situe entre 80 % et 100 %.

2. Engraftment humain de PBMC des souris juvéniles

  1. Pour les modèles aigus et de réactivation, injectez des sourisnulles de 6 à 8 semaines à la chaîne NS par voie intrapéritone avec des PBMC humains provenant d'un donneur en bonne santé ou d'un patient infecté par le VIH qui était sous multithérapie, respectivement. Dans les deux modèles, inclure des souris injectées avec des PBMC d'un donneur en bonne santé sans infection par le VIH (faux) comme témoins.
  2. Couche 15 ml de sang entier dans 5 ml de gradient de densité stérile dans un tube conique de 50 ml.
  3. Centrifugeuse à 400 x g pendant 30 min à RT, sans freins, pour éviter que le pelage bouffi ne se mélange au milieu de gradient de densité.
  4. Recueillir soigneusement la fraction de cellules mononucléaires (entre le milieu de gradient de densité et le supernatant) et transférer la couche bouffie dans un tube de centrifugeuse de 15 ml contenant 10 ml de 1x PBS. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à RT.
  5. Jeter le supernatant et enlever les globules rouges restants en lysing avec 5 ml de tampon ACK ajouté aux cellules granulées. Incuber pendant 4 min à RT.
  6. Centrifugeà euretuge à 300 x g pendant 10 min à RT. Jeter le supernatant et le resuspendre dans 10 ml de 1x PBS ou RPMI 1640 milieu.
  7. Utilisez 10 L de la suspension cellulaire pour compter les cellules et vérifier la viabilité en tactant l'exclusion bleue trypan dans un hémocytomètre. Typiquement, 1/2 x 106 cellules sont obtenues pour chaque 1 ml de sang, avec plus de 95% de viabilité.
  8. Centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à RT. Jetez le supernatant et ajustez le nombre de cellules à la concentration requise (dans ce cas, 3,5 x 106 cellules dans 200 'L de 1x PBS).
  9. Chargez la seringue avec une aiguille attachée (28 G, 0,5 po) avec 3,5 x 106 de PBMC dans 200 L de 1x PBS sous une armoire de biosécurité certifiée.
  10. Retirez la souris de la cage et tenez-la par la queue afin qu'elle puisse saisir le maillage, en appliquant une traction douce vers l'arrière. Ensuite, placez l'index et les doigts du pouce sur les épaules de l'animal, saisissant la peau lâche du cou et en utilisant le majeur pour stabiliser son dos.
  11. Faites glisser la tête de la souris vers l'arrière de sorte que son dos est au-dessus de la tête. Cela permet aux viscères de la cavité abdominale d'être déplacés vers l'arrière et réduit le risque de perforation des organes internes pendant l'injection.
  12. Nettoyer le site d'injection avec 70% d'alcool.
  13. Pénétrer la seringue utilisée à l'étape 2.9 à travers la paroi abdominale et aspirer avant d'injecter les cellules, si un matériau est aspiré, retirez la seringue et jetez-la. Sinon, injectez les cellules lentement dans la cavité intrapéritonéale, retirez la seringue et jetez-la. Injecter 1x PBS pour contrôler les souris.
  14. Remettre l'animal dans sa cage.
  15. Vérifier l'engraftment dans le sang périphérique par cytométrie de flux à 3 semaines après injection.

3. Soins post-greffe

  1. Identifiez les souris par marquage des oreilles.
  2. Observez les souris utilisées dans ces expériences de près 2x par jour après chaque procédure pour les signes cliniques de détresse.
  3. Après la transplantation de cellules humaines, surveillez des souris pour GVHD. Pour surveiller les symptômes du GVHD chez les souris nouveau-nées, juvéniles et adultes, évaluez les animaux pour l'apparence de la maladie de peau (c.-à-d. couleur, sécheresse, éruption cutanée, alopécie), en plus de la mesure du poids corporel. Évaluer les animaux qui montrent ces signes par un vétérinaire pour envisager l'euthanasie précoce.

4. Procédure d'infection par le VIH et procédure d'infection fictive

REMARQUE : Pour les modèles chroniques et aigus, les souris sont infectées par la souche de référence du VIH BaL à la semaine 14 et à la semaine 3 après l'engraftment, respectivement. Les injections avec le VIH sont administrées par voie intrapéritone dans les quadrants abdominaux inférieurs.

  1. Effectuer le processus de chargement du virus/PBS dans des seringues, à l'aide d'une aiguille de 28 G 0,5 po, dans des armoires BSL2 suivant les procédures ABSL2. La quantité totale de virus injecté est de 15 000 dose infectieuse médiane de culture tissulaire (TCID50) dans 200 L de RPMI stérile 1640.
  2. Retirez la souris de la cage et tenez-la par sa queue afin qu'elle puisse saisir le maillage, en appliquant une traction douce vers l'arrière. Ensuite, placez l'index et le pouce sur les épaules de l'animal, saisissant la peau lâche du cou et en utilisant le majeur pour stabiliser le dos.
  3. Faites glisser la tête de la souris vers l'arrière de sorte que son dos est au-dessus de sa tête. Cela permet aux viscères de la cavité abdominale d'être déplacés vers l'arrière et réduit le risque de perforation des organes internes pendant l'injection.
  4. Nettoyez les souris avec un tampon d'alcool pré-humide dans le quadrant inférieur gauche/droit de l'abdomen. Injecter 15 000 TCID50 du virus DU VIH BaL contenu dans 200 L de RPMI 1640 stérile.
  5. Après l'injection, retournez la souris dans sa cage d'origine.

5. Collecte de sang par ponction rétroorbitale

REMARQUE : Le saignement rétroorbital permet la collecte rapide du sang, réduisant de ce fait le temps global de collecte et augmentant la stabilité des marqueurs humains de lymphocyte. Utilisez des tubes EDTA pour recueillir le sang des souris.

  1. Dans le modèle chronique, à 14 semaines après l'injection de HSC, recueillir le sang par l'intermédiaire de la veine rétroorbitale. Dans les modèles aigus et de réactivation, effectuer cette procédure à 3 semaines après l'injection PBMC.
  2. Anesthésiez les animaux à l'aide de 250 l d'inhalation d'isoflurane avant la collecte de sang dans une classe B2 de hotte de biosécurité qui est conduit à l'extérieur.
  3. Distribuer l'Isoflurane dans des tampons de coton sous un treillis métallique dans un bocal clair de 1 L dans une armoire de biosécurité ventilée à l'extérieur du bâtiment. L'utilisation de la maille assure que les animaux ne contactent pas le tampon imbibé d'isoflurane, ce qui peut causer une irritation de la peau et une surdose potentielle puisque l'isoflurane est également absorbé par la peau. En outre, mettez une serviette en papier doux entre le maillage et l'animal pour éviter des dommages de membre.
  4. Une fois que le pot est saturé d'isoflurane (environ 1 min après l'avoir ajouté), introduire l'animal et observer le taux respiratoire, qui augmentera puis diminuera. Vérifiez l'indication clinique d'un plan profond d'anesthésie, qui comprend l'absence d'un réflexe de redressement (sur le pot de basculement doucement) et l'absence de mouvements bruts. Commencez la procédure de saignement dès que l'animal est complètement détendu et manque du réflexe de pincement de l'orteil.
    REMARQUE : Puisque l'isoflurane s'évapore, distribuez plus de drogue si aucun signe d'anesthésie n'est observé.
  5. Pour le saignement rétroorbital, appuyez sur la caudale de veine jugulaire externe de souris à la mandibule avec le pouce, et avec la même main, élever doucement la paupière supérieure avec l'index.
  6. Insérez un tube hématocrit dans le canthus médial de l'œil et dirigez-le dans une direction ventrolatérale jusqu'à ce que le sang commence à fluctuer.
  7. Recueillir au moins 100 l de sang. Une fois que le volume désiré de sang est obtenu (un volume ne plus que le 1% du poids corporel de l'animal), arrêter la pression jugulaire externe et enlever le tube hématocrit.
  8. Assurez-vous que l'hémostase est complète en appliquant la pression directe sur l'œil à l'aide d'une gaze stérile pour un minimum de 30 s.
  9. Appliquer des gouttes de tétraïne dans l'œil. Surveillez l'animal jusqu'à ce qu'il soit complètement remis de l'anesthésie et placez-le dans la cage.
    REMARQUE : Les 100 L de sang recueilli sont utilisés pour l'évaluation du niveau d'engraftment des CD45 humains et d'autres populations de cellules sanguines, ainsi que pour l'évaluation de la charge virale plasmatique.

6. Dépistage de l'analyse du niveau d'engraftment et de la cytométrie du débit

  1. Suivez un protocole de coloration classique de cytométrie de flux pour le sang entier, qui inclut l'incubation des anticorps anti-humains fluorochrome-étiquetés (pour le panneau suggéré de flux, voir tableau des matériaux),suivi par la lyse des globules rouges et les étapes de lavage13,15.
    REMARQUE : Pour le dépistage du niveau d'engraftment, inclure un anticorps cD45 anti-humain. Pour la comparaison, un anticorps anti-souris CD45 peut également être utilisé. Inclure des contrôles de compensation ainsi qu'un échantillon de sang humain taché du même mélange d'anticorps, des échantillons de sang non tachés de souris et d'humains, et un contrôle non humanisé pour tester la réactivité croisée des réactifs. Après la coloration, il y a toujours un certain signal de fond ; cependant, tous les signaux positifs sont clairement distingués des contrôles négatifs et interactifs.
  2. Dans un cytomètre de débit approprié, acquérez au moins 10 000 événements sur la porte des lymphocytes (FSC-A vs SSC-A). Pour l'analyse de cytométrie de flux, après l'exclusion en double, déterminez le pourcentage de cellules CD45et d'autres cellules d'intérêt.

7. Évaluation de la charge virale plasmatique

  1. Évaluer la charge virale chez les animaux infectés par le VIH 1 fois par semaine après l'infection.
  2. Après le saignement rétroorbital (environ 100 l), obtenir du plasma en recueillant le supernatant après centrifugation du sang anticoagulé à 3 500 x g pendant 3 min dans un microcentrifugeur. La pastille est utilisée pour le phénotypage des cellules sanguines.
  3. Utilisez un kit commercial d'extraction d'ARN viral (voir Tableau des matériaux) pour obtenir de l'ARN à partir de 40 l de plasma.
  4. Convertir l'ARN en aDNc à l'aide du premier mélange de synthèse des souches (voir Tableau des matériaux)et de l'amorce de bâillon vih SK431.
  5. Effectuer des PCR quantitatifs en temps réel à l'aide d'amorces séropositives SK38/SK39 et de colorants verts fluorescents (p. ex., vert SYBR) tels que décrits dans les études précédentes13,25.

8. Administration d'un traitement antirétroviral

  1. Administrer la multithérapie orale au moins 3 semaines après l'infection, lorsqu'une charge virale élevée est observée, dans les modèles chroniques, aigus et de réactivation.
  2. Calculer les doses de ténofovir disoproxil fumarate (TDF), emtricitabine (FTC), et raltegravir (RAL), selon les valeurs Km de 37 et 3 pour les humains et les souris, respectivement26. Typiquement, les doses équivalentes humaines de TDF, FTC, et RAL sont 61.7 mg/kg/jour, 40.7 mg/kg/jour, et 164 mg/kg/jour, respectivement.
  3. Pour l'administration dans l'eau potable, écraser les comprimés de drogue et ajouter la quantité respective dans la bouteille d'eau, en veillant à ce que chaque souris dans la cage acquiert sa dose quotidienne. Puisque la poudre de drogue peut former des sédiments dans la bouteille, secouez périodiquement la bouteille d'eau pour obtenir une suspension homogène.
  4. Changez la bouteille d'eau chaque semaine avec des médicaments fraîchement dissous.
  5. Recueillir le sang par veine rétroorbitale chaque semaine ou toutes les 2 semaines après l'initiation de la multithérapie pour évaluer les changements dans la charge virale et le ratio CD4:CD8.

9. Euthanasie de souris, collecte des organes lymphoïdes secondaires, et isolement des cellules mononucléaires

  1. L'euthanasie est pratiquée dans les trois modèles de souris humanisés, périodiquement le long du temps d'infection, ou à la fin de l'expérience.
  2. Effectuer l'euthanasie des souris adultes par asphyxie au CO2, suivie de la luxation cervicale. Pour l'asphyxie, utilisez une chambre non préchargée, distribuez le CO2 d'un cylindre commercial avec régulateur à pression fixe et le limiteur de ligne contrôlant le flux de gaz dans un délai de 20 % à 30 % du volume de la chambre/minute pour se conformer aux lignes directrices de l'AVMA de 2013.
  3. Maintenir le débit de CO2 pour l'arrêt respiratoire de surveillance de la catégorie des 'gt;60's (qui peut prendre jusqu'à 5 min), suivi de la dislocation cervicale pour assurer l'euthanasie.
  4. Euthanasier les nouveau-nés de 7 jours par une méthode physique (c.-à-d. à l'aide de ciseaux pointus).
  5. Visualisez les ganglions lymphatiques axillaires, mediastinal et mésentériques (qui sont généralement observés) et extrayez-les avec des pinces à épiler et des ciseaux pointus. Extraire également la rate, située dans le côté supérieur gauche de la cavité péritonéale.
  6. Déposer les tissus lymphoïdes dans des tubes centrifugeurs de 1,5 ml contenant un milieu prieur stérile de RPMI 1640.
  7. Traiter immédiatement les tissus lymphoïdes dans une passoire à cellules en nylon de la taille d'un pore de 70 mm, en recueillant les cellules dans un tube de 50 ml. N'aspirez pas les tissus.
  8. Laver les cellules avec 5 ml de RPMI 1640 milieu complété par 1% FBS pour faciliter le filtrage des cellules.
  9. Après la désagrégation des tissus, centrifuger la suspension des cellules à 3 500 x g pendant 10 min dans un microcentrifugeur.
  10. Jeter le supernatant et resuspendre les cellules avec 500 OL de 1x PBS.
  11. Transférer la suspension des cellules dans un tube centrifugeur de 1,5 ml contenant 500 l de milieu de gradient de densité stérile.
  12. Centrifugeuse à 3 500 x g pendant 3 min dans un microcentrifuge, sans frein, pour empêcher la couche bouffie de se mélanger avec le milieu de gradient de densité
  13. Recueillir soigneusement la fraction de cellules mononucléaires (entre le milieu de gradient de densité et le supernatant) et transférer la couche bouffie dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml contenant 500 l de 1x PBS. Centrifugeuse à 3 000 x g pendant 3 min.
  14. Enlever les globules rouges restants en lysing avec 500 L de tampon ACK, en couve pendant 4 min à RT.
  15. Centrifugeàeur à 3 000 x g pendant 3 min. Jeter le supernatant et le resuspendre dans 1 ml de 1x PBS ou moyen.

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Representative Results

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Comme décrit ci-dessus, à 14 semaines après l'injection de HSC (modèle chronique) ou à 3 semaines d'injection post-PBMC (modèles aigus et de réactivation), les souris sont saignées pour le dépistage du niveau d'engraftment des cellules humaines par cytométrie de flux. Une stratégie de gating représentative pour l'évaluation de 1) CD45 humainet la reconstitution des cellules et 2) le pourcentage de CD4 et de CD8et les lymphocytes T est indiqué dans la figure 1A. En règle générale, le niveau d'engraftment (pourcentage de CD45et cellules humaines) varie de 10 à 80 % après l'injection de CD34et de HSC et dépend de la voie d'injection et de la souche de la souris, entre autres facteurs décrits précédemment (figure 1B). Après l'injection de PBMC, le niveau d'engraftment (pourcentage de CD45 et De Cellules CD3) varie de 5 % à 65 %, également avec des différences entre les souches de souris ( figure1B). De plus, on peut observer certaines différences entre les souris injectées avec du PBMC provenant d'un donneur sain par rapport à un donneur infecté par le VIH(figure 1D). Habituellement, pour l'infection par le VIH, les niveaux d'engraftment supérieurs à 5 % à 10 % sont suffisants pour la réplication virale active.

Fait important, une caractéristique de hu-PBL-NS - chaîne des modèles de sourisnulles est le développement de GVHD xénogénique dans quelques semaines après l'engraftment cellulaire, en raison de la reconnaissance humaine des lymphocytes T de murine majeur complexe d'histocompatibilité (MHC) molécules23. Ce processus est évident, même après 3 semaines après l'injection de PBMC, par des signes tels que la perte de cheveux et de poids (figure 2A,B), ainsi que par l'expression accrue des marqueurs d'activation dans les lymphocytes T tels que HLA-DR et CD38 (Figure 2C,D). D'autre part, GVHD est plus lentement développé chez les souris injectées avec l'homme CD34HSC et est directement corrélé avec le niveau initial de l'engraftment.

Après l'infection par le VIH, il y a une augmentation rapide de la charge virale plasmatique, généralement détectable après 2 à 3 semaines après l'infection, tant dans les modèles chroniques que dans les modèles aigus(figure 3A,B),avec des cinétiques similaires dans le modèle de réactivation (figure 3C). L'augmentation de la charge virale coïncide avec une diminution du ratio CD4:CD8 (figure 3D,E,F). Ces changements ne sont pas observés chez les souris témoins (sans infection par le VIH, figure 3). Il convient de noter que, dans le modèle de sourisnulles à chaîne hu-PBL-NS, on peut observer une inversion initiale du ratio CD4:CD8, reconstituée pendant le temps de surveillance(figure 3E,F). Enfin, si la multithérapie est administrée à des souris infectées par le VIH, on s'attend à ce qu'une suppression de la charge virale ainsi qu'une récupération dans le ratio CD4:CD8 atteignent des niveaux semblables à ceux des témoins non infectés(figure 3A,C,D,F). Typiquement, après 2-3 semaines de traitement, une diminution de la charge virale et une augmentation du rapport CD4:CD8 est observée dans les modèles chroniques, aigus et de réactivation. Si cela n'est pas observé, les doses de médicaments et la voie d'administration doivent être évaluées.

Figure 1
Figure 1 : Stratégie de gating représentative pour l'évaluation des niveaux d'engraftment des CD45 et des lymphocytes T humains. (A) Stratégie de gating utilisée pour le dépistage du pourcentage de CD45 humains (huCD45), CD3,CD4etCD8- lymphocytes T chez les sourisnulles en chaîne huNS, à la semaine 14 après injection avec du sang de cordon CD34et HSC. Les chiffres indiquent le pourcentage de chaque population. (B) Niveaux représentatifs d'engraftment (pourcentage de huCD45et cellules) dans huNS -chaînenulle (n - 6) et une souche immunodéficiente similaire avec expression transgénique de l'IL-3 et de gm-CSF (huNOG-EXL, n - 6), comme indiqué précédemment15. (C) Niveaux représentatifs d'engraftment (pourcentage de huCD3et cellules) chez les souris hu-PBL-NSnulles et hu-PBL-SGM3 (sourisnulles à chaîne NS avec expression transgénique de SCF, GM-CSF et IL-3), à la semaine 3 suivant l'injection avec des PBMC d'un donneur sain (modèle aigu, n ' 7 et n ' 8, respectivement). (D) Niveaux représentatifs d'engraftment (pourcentage de huCD3et cellules) chez les souris hu-PBL-NSG-SGM3 après injection avec des PBMC d'un patient en bonne santé ou infecté par le VIH qui était sous multithérapie (modèle de réactivation, n ' 10 et n - 12, respectivement). Dans b-D, la ligne indique la médiane, et la valeur p du test Mann-Whitney est affichée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Développement du GVHD dans le modèle de sourisnulles hu-PBL-NS. (A) Perte de cheveux chez deux souris représentatives de hu-PBL-NSG-SGM3, à la semaine 7 suivant l'injection avec PBMC d'un donneur sain. (B) Perte de poids de la souris tout au long du temps de surveillance normalisée au pourcentage de poids de départ chez les souris hu-PBL-NSG-SGM3 injectées avec PBMC d'un donneur en bonne santé (n - 10) et le patient infecté par le VIH (n - 12). (C) Expression représentative (à la semaine 7 post-engraftment) de HLA-DR et CD38 en CD4et CD8- lymphocytes T de souris hu-PBL-NSG-SGM3 injectées avec des PBMC d'un donneur sain. Les chiffres indiquent le pourcentage de chaque population. (D) Pourcentages représentatifs de CD4et CD8- lymphocytes T qui sont HLA-DR- CD38- chez des souris hu-PBL-NSG-SGM3 injectées avec PBMC à partir d'un donneur sain. Il convient de noter que dans les cellules avant l'injection chez la souris, les niveaux de HLA-DR, CD38, CD4et CD8- lymphocytes T étaient respectivement de 2,0 % et 5,7 %. En B et D, la plage médiane et interquartile est indiquée. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Changements représentatifs de la charge virale et du ratio CD4:CD8 chez les sourisnulles de la chaîne huNS après l'infection par le VIH et après l'introduction de la multithérapie. (A, D) Rapport CD4:CD8 et charge virale plasmatique chez les sourisnulles huNS-chaîne après l'infection par le VIH BaL (points rouges et ligne, n - 3), qui ont été effectués après la semaine 14 de l'injection avec du sang de cordon CD34- HSCd. Les contrôles non infectés (PBS-injecté) ont également été inclus (points verts et ligne, n ' 5). (B, E) Charge virale plasmatique et rapport CD4:CD8 chez les souris hu-PBL-NSG-SGM3 après infection par le VIH BaL (points rouges et ligne, n - 4), qui a été réalisée à la semaine 3 après injection avec PBMC d'un donneur sain (modèle aigu). Les contrôles non infectés (injectés par PBS) ont également été inclus (points verts et ligne, n ' 3). (C et F) Charge virale plasmatique et rapport CD4:CD8 chez les souris hu-PBL-NSG-SGM3 injectées avec des PBMC à partir d'un donneur infecté par le VIH (points rouges et ligne, n ' 9) ou donneur sain (points verts et ligne, n ' 10) (modèle de réactivation). Dans tous les cas, la plage médiane et interquartile est montrée. Dans l'aïe, la ligne pointillée indique la limite de détection de l'analyse (150 copies/mL). Pour les échantillons dont la charge virale est indétectable, une valeur égale à la moitié de la limite de détection a été attribuée. Dans d'après, la ligne pointillée indique un ratio CD4:CD8 de 1. En A, C, D et F, la boîte grise indique l'heure avec l'administration de l'ART. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

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D'importants progrès ont été réalisés dans le développement de souches de souris immunodéficientes pour l'humanisation, avec un certain nombre d'options différentes qui peuvent être utilisées selon l'intérêt de la recherche1. Fourni ici est un protocole général pour l'humanisation des sourisnulles n.-chaîne NS et souches génétiquement similaires à employer dans trois modèles différents pour étudier l'infection par le VIH. Dans la première approche expérimentale, les souris nouveau-nées irradiées sont injectées avec des CD34 humainset des HSC, qui peuvent être dérivés du sang de cordon, du foie foetal, ou du sang périphérique mobilisé3,21. L'irradiation appropriée des sourisnulles de nS est une étape critique, car elle élimine la moelle osseuse de la souris et d'autres cellules progénitrices, permettant une reconstitution efficace des populations cellulaires humaines. Cependant, certains rapports ont démontré la reconstitution des cellules humaines dans différentes souches de souris, sans irradiation27. À cet égard, des doses appropriées d'irradiation doivent être fournies, puisque les sourisnulles de nS-chaîne sont radiosensibles, et l'irradiation élevée pourrait induire la lymphomagénèse thymique21,28.

D'autres étapes et facteurs critiques qui pourraient affecter le niveau d'engraftment incluent la voie de l'injection (intrahépatique, intraveineuse, intracardiaque), l'âge des souris, le pourcentage de pureté des CD34et des HSC, et l'expertise de l'opérateur29. Dans les deuxième et troisième approches basées sur les modèles de sourisnulles à chaîne hu-PBL-NS, certains facteurs critiques incluent la voie d'injection (intrapéritonéal, intraveineuse, intrasplégique), l'âge des souris et le nombre de cellules humaines injectées, ce qui peut influencer le niveau final de l'engraftment. En ce qui concerne ce dernier facteur, plusieurs études ont utilisé 5-10 x 106 PBMC pour l'engraftment22,23,30, alors que le protocole actuel suggère l'utilisation de 3,5 x 106 PBMC. A noter que ce nombre de cellules est suffisant pour la reconstitution des lymphocytes T et pour la réplication du VIH, tant dans les modèles aigus que de réactivation, et retarde également le développement du GVHD23. Néanmoins, les chercheurs devraient optimiser les conditions d'humanisation en fonction des objectifs de recherche. En outre, il est important de valider la souche de VIH utilisée pour l'infection des sourisnulles de huNS-chaîne. Ici, la souche tropique R5 HIV-1 BaL est utilisée, ce qui donne des niveaux élevés de réplication virale chez les sourisnulles en chaîne huNS. D'autres souches de reporter, telles que celles contenant de la luciferase ou des protéines fluorescentes, conviennent également à l'analyse à cellule unique des cellules infectées par le VIH31.

Dans l'ensemble, trois limitations majeures sont démontrées dans les modèles de sourisnulles à la chaîne huNS après l'engraftment avec CD34et HSC. Tout d'abord, en raison de l'absence d'un environnement thymique humain, les lymphocytes T sont éduqués dans le contexte des molécules murines MHC, limitant la stimulation antigène-spécifique ultérieure par l'intermédiaire de leurs récepteurs de cellule T. Ce problème limite l'utilisation de modèles de sourisnulles à chaîne NS pour l'étude de la réponse spécifique aux lymphocytes T spécifique au VIH. Néanmoins, cette limitation peut être surmontée par l'utilisation de souris BLT ou de sourisnulles en chaîne NS avec l'expression transgénique des molécules de HLA16,17. Deuxièmement, il y a généralement une mauvaise reconstitution des populations myéloïdes dans les modèles de sourisnulles en chaîne NS, ce qui limite l'étude de ces sous-ensembles qui ont une pertinence dans le contexte de la présentation des antigènes et de la pathogénie de l'infection par le VIH14,15. Dans ce cas, l'utilisation de souches de souris avec l'expression transgénique des facteurs hématopoïétiques est recommandée8,15,32.

Troisièmement, il y a un développement pauvre de 1) des structures lymphoïdes de follicule dans les tissus lymphoïdes secondaires et 2) le manque des tissus lymphoïdes tertiaires, qui est lié aux niveaux bas des cellules immunitaires innées (c.-à-d., cellules dendritiques dans les sourisnulles de huNS-chaîne) qui sont critiques pour le développement des follicules33. Ce problème est associé à une mauvaise réponse humoristique dans huNS - chaînenull modèles de souris34. Néanmoins, certains rapports ont mis en évidence le développement de structures folliculaires chez les sourisnulles de la chaîne huNS4, tandis que les lymphes et les lympholes confinées à la mandiale (exprimant le récepteur chimiokine CXCR5) sont détectées chez les sourisnulles de la chaîne huNS et les souches connexes15). Encore une fois, l'utilisation de 1) souris BLT ou 2) souches de souris avec l'expression transgénique des facteurs hématopoïétiques et / ou avec l'expression des molécules HLA peut améliorer la reconstitution des populations myéloïdes, le développement de structures lymphoïdes secondaires et tertiaires organisées, et efficaces lymphocytes T et B-cellulesréponses 8,35,36.

Semblable aux limitations des modèles de sourisnulles DeS-HS-humanized DeC-HS-chaîne, il y a un manque de réponses de T-cell et d'humoral d'antigène-spécifique, d'absence des populations myéloïdes, et des structures lymphoïdes organisées dans les souris hu-PBL-NS-chaînenulles. En outre, une limitation importante du modèle de sourisnulles à chaîne hu-PBL-NS (modèles aigus et de réactivation de l'infection par le VIH) est la courte fenêtre de surveillance, puisque ces souris développent le GVHD xénogénique23. Le développement de GVHD pourrait également induire des changements phénotypiques et fonctionnels indésirables des populations immunitaires, inhérents au processus pathogène23,37. Néanmoins, ce modèle a l'avantage d'être plus simple et plus accessible, d'autant plus que les PBMC humains sont plus facilement acquis auprès de donneurs sains ou infectés par le VIH38. En outre, l'injection de cellules primaires directement des patients est utile pour l'étude des conditions cellulaires ou pathogènes intrinsèques du donneur, telles que les mutations de résistance aux médicaments viraux ou les altérations immunitaires spécifiques aux donneurs. Il convient de noter que pour le modèle de réactivation, des essais in vitro avec des agents de réactivation du VIH peuvent être effectués pour corroborer la réponse des PBMC avant l'injection chez les souris39. Une autre limite pour certains établissements est que ce travail exige que les installations BSL2MD manipulent les animaux infectés par le VIH en raison de la réglementation.

Les modèles de sourisnulles à chaîne huNS ont certains avantages par rapport à d'autres modèles animaux pour l'étude de l'infection par le VIH, tels que les primates non humains infectés par le virus de l'immunodéficience simienne. Par exemple, les sourisnulles à chaîne huNS permettent la création de souches de gène knock-out ou transgéniques, qui permettent l'évaluation de cibles génétiques spécifiques. En outre, l'utilisation de cellules humaines primaires chez les sourisnulles à chaîne huNS permet d'éviter d'éventuelles restrictions spécifiques aux espèces, comme le cas de gènes stimulés par l'interféron chez les primates non humains, qui peuvent influencer la réponse antivirale et le cours de l'infection40. Ainsi, la cinétique de l'infection est très cohérente entre les sourisnulles huNS-chaîne. Enfin, les modèles de sourisnulles à chaîne huNS sont moins chers, ne nécessitent pas d'installations de base complexes et sont plus accessibles.

En résumé, les modèles de sourisnulles à chaîne CD34et HSC humanisées et hu-PBL-NS offrent une variété de possibilités pour l'étude des événements chroniques, aigus et de réactivation de l'infection par le VIH. Avec la reconnaissance et le dépassement des limitations susmentionnées de ces modèles, l'utilisation des sourisnulles de NS-chaîne peut être un outil puissant pour les études précliniques virologiques, immunologiques, et de drogue, aussi bien que pour l'édition de génome et les immunothérapies cellulaires.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des fonds internes de la division clinique IHV à JCZ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3735.S.X
1. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3745.S.X
10 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0010
15 ml conical tubes Stellar scientific T15-600
25 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0025
5 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0005
50 ml conical tubes Stellar scientific T50-600
ACK lysis buffer Quality biological 118-156-101
Alcohol prep pads Fisher scientific 06-669-62 Sterile
Anti-Human CD3 clone UCHT1 Biolegend 300439 APC conjugated
Anti-Human CD4 clone OKT4 Biolegend 317420 AF488 conjugated
Anti-Human CD45 clone 2D1 Biolegend 368522 BV421 conjugated
Anti-Human CD8 clone SK1 Biolegend 344710 PerCP-Cy5.5 conjugated
Biosafaty cabinet level 2 If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane
Bonnet Fisher scientific 17-100-900 Single use cap for basic protection
Cavicide Metrex 13-1000 Surface desinfectant
CD34+ cells Lonza 2C-101 As many vials available from a single donor
Centrifuge Beckman 65-6KR
Clear jar Amazon 77977
Cotton gauze pad Fisher scientific 22-415-468 Sterile
Disposable lab coats Fisher scientific 19-472-422
EDTA micro tubes Greiner bio-one 450480
Face Mask Fisher scientific 17-100-897
FACS lysing solution BD 340202
FBS premium HI Atlanta biologicals S1115OH
Ficoll GE health one 17-1440-02
Flow cytometer We used FACS Aria II
Flow cytometry tubes Falcon 352054 5 ml polystyrene and round bottom
HIV BaL Prepared in our uQUANT core facility
Human PBMCs HIV positive and negative volunteers
Infrared warming pad Venet scientific DCT-25 Temporary therapeutic warming pad for small animals
Isentress (Raltegravir) Merck NSC 0006-0227061 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor
Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Mark I irradiator Equipment belonging to university of Maryland
Micro pipettes
Microcentrifuge Eppendorf
Mouse ear tags National Band & Tag company 1005-1L1
Natelson blood collection tubes Fisher scientific 02-668-10
NOG-EXL Taconic HSCFTL-13395-F
NSG mice Jackson 5557 Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment
NSG-SGM3 Jackson 13062
Paraformaldehyde 16% Electron microscopy sciences 15710
PBS 1X pH 7.4 Gibco 100-10-023
Petri dishes Fisher scientific 08-757-28
Quantistudio qPCR machine Thermo QS3
Reagent reservoirs Costar 4870
RPMI media 1640 1X Gibco 11875-093
Shoe covers Fisher scientific 17-100-911
Sterile disposable Gloves Microflex SUF-524
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix Invitrogen 10080-400 cDNA synthesis
Syringes 28-G x 1/2 BD 329-461
Syringes 29-G x 1/2 BD 324-702
Truvada (Emtricitabine and Tenofovir Gilead NDC 61958-0701-1 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor
Trypan blue Sigma T8154 Cell count and viability
Vick Vaporub School health 43214 Ointment based on menthol and eucalyptus
Water molecular biology grade Quality biological 351-029-131

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Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Heredia, A., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models. J. Vis. Exp. (154), e60315, doi:10.3791/60315 (2019).More

Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Heredia, A., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models. J. Vis. Exp. (154), e60315, doi:10.3791/60315 (2019).

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