JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Immunology and Infection

Kronisk, akut, og reaktiveret HIV-infektion i humaniserede immundefekt musemodeller

Published: December 03, 2019
doi:
10.3791/60315
, , , , ,
1Institute of Human Virology, School of Medicine,University of Maryland, 2Grupo Inmunovirología, Facultad de Medicina,Universidad de Antioquia

Summary

Beskrevet her er tre eksperimentelle tilgange til at studere dynamikken i HIV-infektion i humaniserede mus. Den første tillader studiet af kroniske infektions hændelser, mens de to sidstnævnte giver mulighed for undersøgelse af akutte hændelser efter primær infektion eller viral reaktivering.

Abstract

Humaniseret NOD/SCID/IL-2 receptor γ-kædeNull -mus rekapitulere nogle funktioner i menneskelig immunitet, som kan udnyttes i grundlæggende og præ-klinisk forskning om smitsomme sygdomme. Beskrevet her er tre modeller af humaniseret immundefekt mus til at studere dynamikken i HIV-infektion. Den første er baseret på intrahepatisk injektion af CD34+ hæmatopoietiske stamceller i nyfødte mus, som giver mulighed for rekonstitution af flere blod og lymfoide væv-indesluttet celler, efterfulgt af infektion med en reference hiv-stamme. Denne model tillader overvågning for op til 36 uger efter infektion og er derfor kaldes den kroniske model. Den anden og tredje model omtales som de akutte og reaktiverings modeller, hvor mononukleære celler i perifert blod intraperitonealt injiceres i voksne mus. I den akutte model, celler fra en sund donor er indpodet gennem intraperitoneal rute, efterfulgt af infektion med en reference HIV-stamme. Endelig indpodes celler fra en HIV-inficeret donor under antiretroviral behandling i reaktiverings modellen via intraperitoneal-ruten. I dette tilfælde, et stoffri miljø i musen giver mulighed for virus reaktivering og en stigning i viral belastning. Protokollerne her beskriver den konventionelle eksperimentelle tilgang til humaniserede, immunodedygtige musemodeller af HIV-infektion.

Introduction

Den humaniseret NOD/scid/interleukin (Il)-2 receptor γ-kædeNull (herefter benævnt huns γ-kædeNull) musemodel har været meget anvendt til at studere patogenesen af infektioner, autoimmunitet, og kræft, samt for prækliniske undersøgelser af narkotika og human celle-baserede terapier1,2. Disse mus er baseret på en ikke-overvægtige diabetiker (NOD) baggrund, med scid mutation og målrettet MUTATION på Il-2 receptor γ-kæde locus (fælles γ-kæde til Il-2, IL-4, IL-7, Il-9, Il-15, og Il-21), som inducerer en alvorlig svækkelse i udviklingen af mus T-, B-, og naturlige Killer (NK) celler1. Således, de støtter engraftment af humant væv, Human CD34+ hæmatopoietiske stamceller (hscs), og humant perifert blod mononukleære celler (pbmcs)3,4,5. Desuden, transgene ekspression af humane hæmatopoietiske faktorer, såsom stamcellefaktor (SCF), granulocyt/makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF), og Il-3 fremmer engraftment af humane myeloid populationer6,7,8.

For HIV-studier er flere huNS γ-kædeNull -musemodeller blevet beskrevet, som varierer i muse stammen, typen af humane celler, type af væv til engraftment og oprindelsen af celler (dvs. sund vs. HIV-inficerede donor)9,10. Den oprindelige stamme, dog, er meget udbredt på grund af de høje niveauer af humane celler engraftment og viral replikation efter infektion med en reference hiv stamme11,12,13. Lignende immundefekt muse stammer med transgene ekspression af humane hæmatopoietiske faktorer (f. eks. nog-exl eller NSG-SGM3) eller med implantater af humant lever og thymus væv (knoglemarvs-lever-thymus [BLT] mus) er nyttige til at evaluere rollen af myeloid populationer i anti-hiv immunrespons, virkningerne af hiv på disse væv, og deres deltagelse som virale reservoirer14,15. Desuden kan nogle stammer med transgene udtryk af humane leukocytantigen (HLA) molekyler, samt BLT-mus, anvendes til at studere T-celle respons på hiv-infektion16,17.

Generelt, i disse mus, humanisering afhænger af cellulær oprindelse, levering rute (intraperitoneal, intrahepatisk, intravenøs, intracardiac) og mus alder på tidspunktet for engraftment18,19,20. Med hensyn til cellens oprindelse, Human CD34+ HSC afledt af navlestrengsblod, føtal lever, eller mobiliseret perifert blod kan injiceres i nyfødte eller unge mus3,21. Desuden kan voksne γ-kædeNull -mus være humaniseret ved injektion af PBMC (her benævnt Hu-PBL-NS γ-ChainNull -mus), der tillader den tidsmæssige cirkulation af disse celler i blodet, sekundære lymfoide organer og betændede væv22,23,24.

Beskrevet her er en detaljeret protokol til etablering af huNS γ-kædeNull -musemodeller til studiet af hiv-infektion. Den første er den kroniske model, hvor humane CD34 + hscs afledt af navlestrengsblod fra en sund donor injiceres i nyfødte mus, efterfulgt af infektion med en reference HIV– stamme efter 14 ugers humant immunsystem rekonstitution. Denne model tillader overvågning af mus for op til ~ 36 uger efter infektion. Den anden model er en akut model, hvor Pbmc’er afledt af en sund donor injiceres i voksne NS γ-kædeNull -mus, efterfulgt af infektion med en reference hiv-stamme efter 3 ugers menneskelig T-celle ekspansion i musen. Endelig er den tredje model reaktiverings modellen, hvor Pbmc’er afledt af en HIV-inficeret donor under suppressiv antiretroviral behandling (ART) injiceres i voksne NS γ-kædedeNull -mus. I dette tilfælde, et stoffri miljø giver mulighed for viral reaktivering og stigning i den virale belastning. De to sidstnævnte modeller tillader overvågning i op til ~ 9 uger efter engraftment.

Samlet set er disse tre modeller nyttige for virologiske undersøgelser, prækliniske undersøgelser af nye lægemidler, og evaluering af HIV-infektion virkninger på den globale immunrespons. Det er også vigtigt at overveje, at brugen af HIV-inficerede, humaniserede mus kræver gennemgang og godkendelse af det institutionelle biosikkerheds udvalg (IBC) samt af Udvalget for institutionel dyrepleje og-anvendelse (IACUC) før ethvert eksperiment. Dette sikrer, at undersøgelsen følger alle interne og eksterne institutionelle regler for anvendelse af farligt biologisk materiale og human håndtering af forsøgsdyr.

Protocol

I dette arbejde blev alle dyrepasning og-procedurer udført i henhold til protokoller, der blev gennemgået og godkendt af Udvalget for institutionel dyrepleje og-anvendelse (IACUC) ved University of Maryland School of Medicine (protokolnummer 1018017, 1018018 og 0318009). 1. Human CD34+ HSC engraftment af nyfødte mus Brug altid engangsudstyr til personlig beskyttelse (PPE), herunder sterile scrubs, handsker, dedikerede sko, sko betræk, maske, beskyttelsesbriller, hår/s…

Representative Results

Som beskrevet ovenfor, ved 14 uger efter HSC injektion (kronisk model) eller 3 uger efter PBMC injektion (akut og reaktiverings modeller), er musene blødte for screening af niveauet af humane celler engraftment ved flow cytometri. En repræsentativ gating-strategi for evaluering af 1) humane CD45+ celler rekonstitution og 2) procentdel af CD4+ og CD8+ T-celler er vist i figur 1A. Typisk varierer niveauet af engraftment (procentdel af humane …

Discussion

Der er opnået vigtige fremskridt i udviklingen af immunodedygtige muse stammer for humanisering, med en række forskellige muligheder, som kan anvendes i henhold til forskningsinteresse1. Forudsat her er en generel protokol til humanisering af NS γ-kædeNull -mus og genetisk lignende stammer, der skal anvendes i tre forskellige modeller til at studere hiv-infektion. I den første eksperimentelle tilgang injiceres bestrålede nyfødte mus med humane CD34+ hscs, som kan udled…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af de interne midler fra IHV Clinical division til JCZ.

Materials

0. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3735.S.X
1. 5 ml Microcentrifuge tubes Neptune 3745.S.X
10 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0010
15 ml conical tubes Stellar scientific T15-600
25 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0025
5 ml Serologial pipetes stellar sceintific VL-4090-0005
50 ml conical tubes Stellar scientific T50-600
ACK lysis buffer Quality biological 118-156-101
Alcohol prep pads Fisher scientific 06-669-62 Sterile
Anti-Human CD3 clone UCHT1 Biolegend 300439 APC conjugated
Anti-Human CD4 clone OKT4 Biolegend 317420 AF488 conjugated
Anti-Human CD45 clone 2D1 Biolegend 368522 BV421 conjugated
Anti-Human CD8 clone SK1 Biolegend 344710 PerCP-Cy5.5 conjugated
Biosafaty cabinet level 2 If posible connected to an exauste chimeny when handling Isoflurane
Bonnet Fisher scientific 17-100-900 Single use cap for basic protection
Cavicide Metrex 13-1000 Surface desinfectant
CD34+ cells Lonza 2C-101 As many vials available from a single donor
Centrifuge Beckman 65-6KR
Clear jar Amazon 77977
Cotton gauze pad Fisher scientific 22-415-468 Sterile
Disposable lab coats Fisher scientific 19-472-422
EDTA micro tubes Greiner bio-one 450480
Face Mask Fisher scientific 17-100-897
FACS lysing solution BD 340202
FBS premium HI Atlanta biologicals S1115OH
Ficoll GE health one 17-1440-02
Flow cytometer We used FACS Aria II
Flow cytometry tubes Falcon 352054 5 ml polystyrene and round bottom
HIV BaL Prepared in our uQUANT core facility
Human PBMCs HIV positive and negative volunteers
Infrared warming pad Venet scientific DCT-25 Temporary therapeutic warming pad for small animals
Isentress (Raltegravir) Merck NSC 0006-0227061 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Integrase inhibitor
Isoflurane Henry Schein NDC 11695-6776-2
Mark I irradiator Equipment belonging to university of Maryland
Micro pipettes
Microcentrifuge Eppendorf
Mouse ear tags National Band & Tag company 1005-1L1
Natelson blood collection tubes Fisher scientific 02-668-10
NOG-EXL Taconic HSCFTL-13395-F
NSG mice Jackson 5557 Time pregnant females for CD34 engraftment and Juveniles for PBMCs engraftment
NSG-SGM3 Jackson 13062
Paraformaldehyde 16% Electron microscopy sciences 15710
PBS 1X pH 7.4 Gibco 100-10-023
Petri dishes Fisher scientific 08-757-28
Quantistudio qPCR machine Thermo QS3
Reagent reservoirs Costar 4870
RPMI media 1640 1X Gibco 11875-093
Shoe covers Fisher scientific 17-100-911
Sterile disposable Gloves Microflex SUF-524
SuperScript II First-Strand Synthesis SuperMix Invitrogen 10080-400 cDNA synthesis
Syringes 28-G x 1/2 BD 329-461
Syringes 29-G x 1/2 BD 324-702
Truvada (Emtricitabine and Tenofovir Gilead NDC 61958-0701-1 Antiretroviral medication to treat human immunodeficiency virus (HIV)-Nicleoside analog-transcriptase inhibitor
Trypan blue Sigma T8154 Cell count and viability
Vick Vaporub School health 43214 Ointment based on menthol and eucalyptus
Water molecular biology grade Quality biological 351-029-131
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nature Reviews Immunology. 7, 118-130 (2007).
  2. Koboziev, I., et al. Use of humanized mice to study the pathogenesis of autoimmune and inflammatory diseases. Inflammatory Bowel Diseases. 21 (7), 1652-1673 (2015).
  3. Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: An excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  4. Ishikawa, F., et al. Development of functional human blood and immune systems in NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood. 106 (5), 1565-1573 (2005).
  5. Kim, K. C., et al. A Simple Mouse Model for the Study of Human Immunodeficiency Virus. AIDS research and human retroviruses. 32 (2), 194-202 (2016).
  6. Wunderlich, M., et al. AML xenograft efficiency is significantly improved in NOD/SCID-IL2RG mice constitutively expressing human SCF, GM-CSF and IL-3. Leukemia. 24 (10), 1785-1788 (2010).
  7. Billerbeck, E., et al. Development of human CD4+FoxP3+ regulatory T cells in human stem cell factor-, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-, and interleukin-3-expressing NOD-SCID IL2Rγnull humanized mice. Blood. 117 (11), 3076-3086 (2011).
  8. Coughlan, A. M., et al. Myeloid Engraftment in Humanized Mice: Impact of Granulocyte-Colony Stimulating Factor Treatment and Transgenic Mouse Strain. Stem cells and development. 25 (7), 530-541 (2016).
  9. Kumar, P., et al. T Cell-Specific siRNA Delivery Suppresses HIV-1 Infection in Humanized Mice. Cell. 134 (4), 577-586 (2008).
  10. Victor Garcia, J. Humanized mice for HIV and AIDS research. Current Opinion in Virology. 19, 56-64 (2016).
  11. Araínga, M., Su, H., Poluektova, L. Y., Gorantla, S., Gendelman, H. E. HIV-1 cellular and tissue replication patterns in infected humanized mice. Scientific Reports. 6, 1-12 (2016).
  12. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational ART. Journal of Virology. 92 (7), 2118 (2018).
  13. Medina-Moreno, S., et al. Targeting of CDK9 with indirubin 3’-monoxime safely and durably reduces HIV viremia in chronically infected humanized mice. PLoS ONE. 12 (8), 1-13 (2017).
  14. Honeycutt, J. B., et al. Macrophages sustain HIV replication in vivo independently of T cells. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1353-1366 (2016).
  15. Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. HIV Replication in Humanized IL-3/GM-CSF-Transgenic NOG Mice. Pathogens. 8 (33), 1-16 (2019).
  16. Akkina, R., et al. Improvements and Limitations of Humanized Mouse Models for HIV Research: NIH/NIAID “Meet the Experts” 2015 Workshop Summary. AIDS Research and Human Retroviruses. 32 (2), 109-119 (2015).
  17. Dudek, T. E., Allen, T. M. HIV-Specific CD8+ T-Cell Immunity in Humanized Bone Marrow-Liver-Thymus Mice. The Journal of Infectious Diseases. 208, 150-154 (2013).
  18. Skelton, J. K., Ortega-Prieto, A. M., Dorner, M. A Hitchhiker’s guide to humanized mice: new pathways to studying viral infections. Immunology. 154, 50-61 (2018).
  19. Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Creation of “humanized” mice to study human immunity. Current Protocols in Immunology. , (2008).
  20. Hasgur, S., Aryee, K. E., Shultz, L. D., Greiner, D. L., Brehm, M. A. Generation of Immunodeficient Mice Bearing Human Immune Systems by the Engraftment of Hematopoietic Stem Cells. Methods in molecular biology. 1438, 67-78 (2016).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  22. King, M., et al. A new Hu-PBL model for the study of human islet alloreactivity based on NOD-scid mice bearing a targeted mutation in the IL-2 receptor gamma chain gene. Clinical Immunology. 126 (3), 303-314 (2008).
  23. King, M. A., et al. Human peripheral blood leucocyte non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2 receptor gamma chain gene mouse model of xenogeneic graft-versus-host-like disease and the role of host major histocompatibility complex. Clinical and Experimental Immunology. 157 (1), 104-118 (2009).
  24. Covassin, L., et al. Human peripheral blood CD4 T cell-engrafted non-obese diabetic-scid IL2rgamma(null) H2-Ab1 (tm1Gru) Tg (human leucocyte antigen D-related 4) mice: a mouse model of human allogeneic graft-versus-host disease. Clinical and experimental immunology. 166 (2), 269-280 (2011).
  25. Heredia, A., et al. Targeting of mTOR catalytic site inhibits multiple steps of the HIV-1 lifecycle and suppresses HIV-1 viremia in humanized mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (30), 9412-9417 (2015).
  26. Nair, A., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  27. Miller, P. H., et al. Analysis of parameters that affect human hematopoietic cell outputs in mutant c-kit-immunodeficient mice. Experimental Hematology. 48, 41-49 (2017).
  28. Murphy, W. J., et al. Induction of T cell differentiation and lymphomagenesis in the thymus of mice with severe combined immune deficiency (SCID). Journal of Immunology. 153 (3), 1004-1014 (1994).
  29. Poluektova, L. Y., et al. Humanized Mice as Models for Human Disease. Humanized Mice for HIV Research. , 15-24 (2015).
  30. Nakata, H., et al. Potent anti-R5 human immunodeficiency virus type 1 effects of a CCR5 antagonist, AK602/ONO4128/GW873140, in a novel human peripheral blood mononuclear cell nonobese diabetic-SCID, interleukin-2 receptor gamma-chain-knocked-out AIDS mouse model. Journal of Virology. 79 (4), 2087-2096 (2005).
  31. Terahara, K., et al. Fluorescent Reporter Signals, EGFP, and DsRed, Encoded in HIV-1 Facilitate the Detection of Productively Infected Cells and Cell-Associated Viral Replication Levels. Frontiers in Microbiology. 2, 280 (2012).
  32. Nicolini, F. E., Cashman, J. D., Hogge, D. E., Humphries, R. K., Eaves, C. J. NOD/SCID mice engineered to express human IL-3, GM-CSF and Steel factor constitutively mobilize engrafted human progenitors and compromise human stem cell regeneration. Leukemia. 18 (2), 341-347 (2004).
  33. Cyster, J. G., et al. Follicular stromal cells and lymphocyte homing to follicles. Immunological Reviews. 176, 181-193 (2000).
  34. Seung, E., Tager, A. M. Humoral Immunity in Humanized Mice: A Work in Progress. Journal of Infectious Diseases. 208, 155-159 (2013).
  35. Wahl, A., Victor Garcia, J. The use of BLT humanized mice to investigate the immune reconstitution of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 410, 28-33 (2014).
  36. Suzuki, M., et al. Induction of human humoral immune responses in a novel HLA-DR-expressing transgenic NOD/Shi-scid/γc null mouse. International Immunology. 24 (4), 243-252 (2012).
  37. Ali, N., et al. Xenogeneic Graft-versus-Host-Disease in NOD-scid IL-2Rγnull Mice Display a T-Effector Memory Phenotype. PLoS ONE. 7 (8), 1-10 (2012).
  38. Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. Journal of Immunological Methods. 410, 3-17 (2014).
  39. Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. HIV latency: experimental systems and molecular models. FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).
  40. Wu, F., et al. TRIM5α Restriction Affects Clinical Outcome and Disease Progression in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Rhesus Macaques. Journal of Virology. 89 (4), 2233 (2015).

Tags

Chronic HIV InfectionAcute HIV InfectionReactivated HIV InfectionHumanized Immunodeficient Mouse ModelsNSG Humanized MiceCD34+ Human Stem CellsHepatic InjectionHIV Pre-clinical Studies

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Perdomo-Celis, F., Medina-Moreno, S., Heredia, A., Davis, H., Bryant, J., Zapata, J. C. Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models. J. Vis. Exp. (154), e60315, doi:10.3791/60315 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image