Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Рабочий процесс интеграции данных для выявления комбинаций лекарств, нацеленных на синтетические смертельные взаимодействия

Published: May 27, 2021 doi: 10.3791/60328
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1
1Department of Internal Medicine I - Division of Oncology, Comprehensive Cancer Center, Medical University of Vienna, 2Department of Nephrology, Medical University of Vienna, 3Department of Internal Medicine IV, Medical University Innsbruck

Summary

Большие генетические скрининги в модельных организмах привели к выявлению негативных генетических взаимодействий. Здесь мы описываем рабочий процесс интеграции данных с использованием данных генетических скринингов в модельных организмах для определения комбинаций лекарств, нацеленных на синтетические смертельные взаимодействия при раке.

Abstract

Синтетическое летальное взаимодействие между двумя генами дается, когда нокаут одного из двух генов не влияет на жизнеспособность клеток, но нокаут обоих синтетических смертельных интеракторов приводит к потере жизнеспособности клеток или гибели клеток. Наиболее изученным синтетическим летальным взаимодействием является взаимодействие между BRCA1/2 и PARP1, причем ингибиторы PARP1 используются в клинической практике для лечения пациентов с мутированными опухолями BRCA1/2. Большие генетические скрининги в модельных организмах, а также в гаплоидных клеточных линиях человека привели к выявлению многочисленных дополнительных синтетических пар летального взаимодействия, которые являются потенциальными целями, представляющими интерес для разработки новых методов лечения опухолей. Один из подходов заключается в терапевтическом нацеливание генов с синтетическим смертельным интерактором, который мутирует или значительно понижается в интересуемой опухоли. Второй подход заключается в разработке комбинаций лекарств, направленных на синтетические смертельные взаимодействия. В этой статье мы описываем рабочий процесс интеграции данных для оценки и идентификации комбинаций лекарств, нацеленных на синтетические смертельные взаимодействия. Мы используем доступные наборы данных о синтетических парах летального взаимодействия, ресурсы картирования гомологий, ссылки на лекарственные средства из специализированных баз данных, а также информацию о лекарствах, исследуемых в клинических испытаниях в интересующих заболевания областях. Мы также выделяем ключевые результаты двух недавних исследований нашей группы по оценке комбинации лекарств в контексте рака яичников и молочной железы.

Introduction

Синтетическая летальность определяет ассоциацию двух генов, где потеря одного гена не влияет на жизнеспособность, но потеря обоих генов приводит к гибели клеток. Впервые он был описан в 1946 году Добжанским при анализе различных фенотипов дрозофилы путем разведения гомозиготных мутантов1. Мутанты, которые не производили жизнеспособного потомства, хотя и жизнеспособны сами, демонстрировали смертельные фенотипы при скрещивались с некоторыми другими мутантами, создавая почву для создания теории синтетической летальности. Хартвелл и его коллеги предположили, что эта концепция может быть применима для терапии рака у людей2. Фармакологически спровоцированная синтетическая летальность может зависеть только от одной мутации, учитывая, что синтетический смертельный партнер мутированного гена является мишенью фармакологического соединения. Первой парой генов, которая обеспечила фармакологическую индукцию синтетической летальности, были BRCA(1/2) и PARP1. PARP1 функционирует как датчик повреждения ДНК и привязан к участкам двойных и одиночных разрывов нитей ДНК, суперкатушек и кроссоверов3. BRCA1 и 2 играют важную роль в репарации двухцепочечных разрывов ДНК через гомологичную рекомбинацию4. Фармер и его коллеги опубликовали результаты того, что клетки с дефицитом BRCA1/2 были восприимчивы к ингибированию PARP, в то время как цитотоксичность не наблюдалась в клетках дикого типа BRCA5. В конечном счете, ингибиторы PARP были одобрены для лечения BRCA-дефицита рака молочной железы и яичников6,7. Кроме того, пары генов синтетической летальности, ведущие к клиническому одобрению фармакологических соединений, являются долгожданным и основной областью недавних исследований рака8.

Синтетические смертельные взаимодействия генов были смоделированы у нескольких организмов, включая плодовых мушек, C. elegans и дрожжи2. Используя различные подходы, включая РНК-интерференции и нокауты CRISPR/CAS-библиотеки, в последние годы были обнаружены новые синтетические смертельные пары генов9,10,11. Протокол об экспериментальных процедурах РНКи в сочетании с CRISPR/CAS был недавно опубликован Хузденом и его коллегами12. Между тем, исследователи также провели большие экраны в гаплоидных клетках человека для выявления синтетических летальных взаимодействий13,14. Методы in silico, такие как биологический сетевой анализ и машинное обучение, также показали перспективность в открытии синтетических смертельных взаимодействий15,16.

С точки зрения концепции, одним из подходов к использованию синтетических летальных взаимодействий в контексте противоопухолевой терапии является идентификация мутированных или нефункциональных белков в опухолевых клетках, что делает их синтетических партнеров по летальному взаимодействию перспективными лекарственными мишенями для терапевтического вмешательства. Из-за неоднородности большинства типов опухолей исследователи начали поиск так называемых синтетических летальных белков-концентраторов. Эти синтетические летальные центры имеют ряд синтетических летальных партнеров по взаимодействию, которые либо мутируют и, следовательно, нефункциональны, либо значительно понижаются в образцах опухолей. Устранение таких синтетических смертельных узлов обещает повысить эффективность лекарств или преодолеть лекарственную устойчивость, что может быть показано, например, в контексте винкристин-резистентной нейробластомы17. Второй подход к улучшению лечения наркомании с использованием концепции синтетических летальных взаимодействий заключается в выявлении комбинаций лекарств, нацеленных на синтетические летальные взаимодействия. Это может привести к новым комбинациям уже одобренных одиночных противоопухолевых методов лечения и к перемещению лекарств из других областей заболевания в область онкологии.

В этой статье мы представляем пошаговую процедуру получения списка комбинаций лекарств, нацеленных на синтетические пары летального взаимодействия. В этом рабочем процессе мы (i) используем данные о синтетических летальных взаимодействиях из BioGRID и (ii) информацию о гомологичных генах из Ensembl, (iii) извлекаем пары лекарств-мишеней из DrugBank, (iv) строим ассоциации между болезнями и лекарствами из ClinicalTrials.gov и (v) следовательно, генерируем набор комбинаций лекарств, направленных на синтетические смертельные взаимодействия. Наконец, мы предоставляем комбинации лекарств в контексте рака яичников и молочной железы в разделе репрезентативных результатов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Извлечение синтетических летальных пар генов

  1. Извлечение данных из BioGrid.
    1. Загрузите последний файл взаимодействия BioGRID в формате tab2 с https://downloads.thebiogrid.org/Download/BioGRID/Latest-Release/BIOGRID-ALL-LATEST.tab2.zip либо с помощью веб-браузера, либо непосредственно из командной строки Linux с помощью curl или wget18.

      ##download и распакуйте последний файл взаимодействия BioGRID
      #download новейшего файла взаимодействия BioGRID с помощью curl
      завиток -o biogrid_latest.zip https://downloads.thebiogrid.org/Download/BioGRID/Latest-Release/BIOGRID-ALL-LATEST.tab2.zip
      #unpack загруженный файл данных
      распакуем biogrid_latest.zip
      BG="БИОГРИД-ВСЕ-3.5.171.tab2.txt"
       
    2. После того, как zip-архив был загружен, необходимо распаковать архив и отметить имя фактического файла набора данных (BIOGRID-ALL-X. X.X.tab2.txt) для последующих шагов. Файл данных BioGRID содержит взаимодействия различных типов, которые будут отфильтрованы на следующем шаге.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют и другие источники (например, DRYGIN, SynlethDB), хучащие синтетические летальные взаимодействия, как указано в обсуждении.
  2. Фильтр для синтетической летальности и отрицательных генетических взаимодействий (Экспериментальная система).
    1. Используйте информацию в графе «Экспериментальная система» (столбец No 12), которая указывает на характер подтверждающих доказательств взаимодействия для выявления синтетических летальных взаимодействий.
    2. Ограничьте набор данных записями со значением отрицательной генетической или синтетической летальности. На этом же этапе фильтруйте столбцы и сохраняйте только столбцы, относящиеся к последующим этапам анализа, как указано в таблице 1 ниже.

      ##restrict файл взаимодействия BioGRID в соответствующие столбцы и сохраняет только взаимодействия, классифицированные как отрицательная генетическая и синтетическая летальность
      cut -d "^I" -f 1,8,9,12,16,17 "${BG}" \
      | awk -F "\t" 'BEGIN{
      ОЦС="\t"
      }
      {
      if(NR == 1){
      распечатать $0
      }else if($4 == "Negative Genetic" || $4 == "Synthetic Lethality"){
      распечатать $0
      }
      }' > bg_synlet.txt

      ПРИМЕЧАНИЕ: В фрагментах кода ^I используется для представления горизонтальных табуляций. Могут быть включены дополнительные категории BioGRID, такие как синтетический дефект роста. Другие столбцы, имеющие отношение к этому рабочему процессу, перечислены в таблице 1. BioGRID также сохраняет оценки для отдельных взаимодействий. Отсечки могут использоваться для выявления сильных/высокоуверенных взаимодействий.
Номер столбца Имя заголовка столбца
3 Имя гена
12 вид
13 Идентификаторы лекарств

Таблица 1: Соответствующие столбцы файла данных BioGRID.

  1. Определите виды, для которых сообщалось о синтетических смертельных взаимодействиях.
    1. Определите количество налоговых идентификаторов партнеров по синтетическому летальному взаимодействию, чтобы получить оценку количества синтетических летальных взаимодействий, доступных для каждого организма.

      ##count количество появлений каждого налогового идентификатора в ранее извлеченных синтетических смертельных взаимодействиях
      cut -d "^I" -f5,6 bg_synlet.txt | хвост -n +2 | тр "\t" "\n" \
      | сортировать | uniq -c | сортировать -r -g

      ПРИМЕЧАНИЕ: В результате шага 1 приведен список синтетических летальных взаимодействий с генными символами организмов, в которых были определены взаимодействия. Большинство синтетических летальных взаимодействий были определены в модельных организмах. При загрузке файлов в программу для работы с электронными таблицами (например, Excel) избегайте разрушения Gene Symbols19,20.

2. Перевод синтетических летальных пар генов в ортологи человека

  1. Извлечение человеческих ортологов для соответствующих модельных организмов, идентифицированных на этапе 1.3.
    1. Извлеките человеческие ортологи из Ensembl BioMart21, связав соответствующий набор данных генов модельного организма с набором данных генов человека. Для этой задачи используйте генные символы, обозначающие ген в модельном организме и ортологичные гены человека. Используйте веб-службу Ensembl BioMart для автоматизации процесса извлечения и отправки запроса непосредственно в доступ BioMart RESTful для извлечения ортологичных пар генов (см. пример ниже и справку и документацию Ensembl BioMart для получения дополнительной информации).

      ##retrieve человеческий ортологич для Saccharomyces Cerevisiae от Ensembl BioMart с помощью curl для отправки запроса BioMart непосредственно в службу доступа BioMart RESTful
      curl -o s_cerevisiae.txt --data-urlencode 'query=



      <Имя набора данных = интерфейс "scerevisiae_gene_ensembl" = > "по умолчанию"
      <Атрибутное имя = "external_gene_name" />


      <Имя набора данных = интерфейс "hsapiens_gene_ensembl" = > "по умолчанию"
      <Атрибутное имя = "external_gene_name" />


      ' "http://www.ensembl.org/biomart/martservice"

      Чтобы получить ортологичные человеческие гены для других модельных организмов, замените значение атрибута name первого элемента Dataset именем соответствующего набора данных Ensembl и повторно выполните запрос.

      ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс ортолог-картирования хорошо документирован в справке и документации Ensembl BioMart (http://www.ensembl.org/info/data/biomart/biomart_combining_species_datasets.html).
    1. Доступ к примеру запроса BioMart для человеческих ортологов для Saccharomyces cerevisiae, основных видов, идентифицированных на шаге 1.3, по URL-адресу http://www.ensembl.org/biomart/martview/9b71da1415aba480a52b8dc7dd554d63?VIRTUALSCHEMANAME=default&ATTRIBUTES=scerevisiae_gene_ensembl.default.feature_page.external_gene_name|hsapiens_gene_ensembl.default.feature_page.external_gene_name&FILTERS=&VISIBLEPANEL=linkattributepanel.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют и другие источники (например, roundup, oma browser, HomoloGene, inparanoid) для гомологического отображения, как описано в разделе обсуждения этой рукописи.
  2. Добавьте человеческие ортологи к извлеченным синтетическим смертельным взаимодействиям.
    1. Соедините синтетические летальные взаимодействия, основанные на идентификаторе и символе гена организма, с ортологичными парами, полученными на шаге 2.1. Для синтетических пар летального взаимодействия человека либо создают искусственные ортологичные пары для каждого человеческого гена, присутствующего в наборе данных, либо следят за тем, чтобы синтетические смертельные взаимодействия человека не отбрасывались при объединении и передаче символов генов человека во вновь добавленные столбцы.

      ##collect ортологопоставлений в одном файле и соединяются с синтетическим файлом летального взаимодействия
      #create целевого файла с заголовками для сбора ортолог-сопоставлений
      эхо "tax_id/gene_symbol^Ihuman_gene_symbol" > отображении.txt

      #repeat этом шаге для каждого модельного организма, позаботьтесь о том, чтобы адаптировать имя входного файла и идентификатор налогоплательщика
      #adds для каждой пары ортологов в s_cerevisiae.txt новую запись в картографировании.txt: Символ гена префиксируется с налоговым идентификатором, чтобы облегчить последующее соединение с файлом синтетических смертельных взаимодействий
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      ОЦС="\t"
      org_tax_id="559292"
      }
      {
      if($1 != "" && $2 != ""){
      распечатать org_tax_id"/"$1, $2
      }
      }' s_cerevisiae.txt >> картографирование.txt

      #create записи искусственного картирования для генов человека
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      ОЦС="\t"
      human_tax_id="9606"
      }
      {
      if($5 == human_tax_id){
      печать $5"/"$2, $2
      }
      if($6 == human_tax_id){
      печать $6"/"$3, $3
      }
      }' bg_synlet.txt | сортировка -u >> отображение.txt

      #add необходимых ключей соединения (идентификационный номер налогоплательщика / символ гена) к синтетическим смертельным взаимодействиям
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      ОЦС="\t"
      }
      {
      if(NR == 1){
      печать $0, "Ключ Интерактор A", "Ключ Интерактор B"
      }else{
      печать $0, $5"/"$2, $6"/"$3
      }
      }' bg_synlet.txt > tmp_bg_synlet_w_keys.txt

      #join синтетических летальных взаимодействий с ортологичными парами
      слияние tmp_bg_synlet_w_keys.txt сопоставление.txt 7 1 > tmp.txt
      слияние tmp.txt сопоставление.txt 8 1 > bg_synlet_mapped.txt

      ПРИМЕЧАНИЕ: Команда merge, используемая в этом примере, не является стандартной командой Unix. Однако его реализация с помощью GNU Core Utilities сортирует и объединяет просты. Команда была введена, чтобы скрыть сложность сортировки файлов до того, как их можно будет соединить с командой join. С реализацией слияния можно ознакомиться по адресу https://github.com/aheinzel/merge-sh.
    1. Использование любого идентификатора гена, однозначно идентифицирующего ген в определенном пространстве имен для достижения наилучших возможных результатов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 2 приводит к списку синтетических смертельных взаимодействий от нескольких организмов, сопоставленных с генами человека.

3. Сопоставление синтетических партнеров по летальному взаимодействию с наркотиками

  1. Извлеките пары из DrugBank.
    1. Скачайте данные DrugBank из раздела загрузок DrugBank и создайте учетную запись первой, если еще не создана22. Используйте CSV-файл с идентификаторами мишеней лекарств (раздел идентификаторов белка: https://www.drugbank.ca/releases/latest#protein-identifiers) и словарь DrugBank (раздел открытых данных: https://www.drugbank.ca/releases/latest#open-data) с идентификаторами и названиями DrugBank. Кроме того, можно извлечь необходимую информацию из дампа базы данных XML.

      ##restrict файл drugBank drug target в соответствующие столбцы и сохранить записи только для молекулярных сущностей человека
      DB_TARGETS="все.csv"
      DB_NAMES="словарь наркобанка.csv"

      #extract соответствующие столбцы и переформатировать для использования табуляции в качестве разделителя столбцов
      csvtool col 3,12,13 -u TAB "${DB_TARGETS}" > target_to_drugs_agg.txt

      awk -F "\t" 'BEGIN{
      ОЦС="\t"
      }
      {
      if(NR == 1 || $2 == "Люди"){
      печать $1, $3
      }
      }' target_to_drugs_agg.txt > human_target_to_drugs_agg.txt

      ПРИМЕЧАНИЕ: Данные DrugBank предоставляются в двух основных форматах. Полная база данных доступна в виде XML-файла. Кроме того, большая часть данных предоставляется в виде серии файлов с разделиемыми запятыми (CSV).
    1. Имейте в виду, что DrugBank также регистрирует нечеловеческие мишени для наркотиков. Видовая колонка (колонка No 12) может быть использована для извлечения человеческих лекарственных мишеней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшей удобочитаемости имена извлеченных столбцов приведены в таблице 2. Существуют и другие источники (например, База данных терапевтических мишеней или Chembl), в которых содержатся ссылки на лекарственные средства, как указано в разделе обсуждения.
Номер столбца Имя заголовка столбца
3 Имя гена
12 вид
13 Идентификаторы лекарств
  1. Добавьте названия лекарств к лекарственным мишеням.
    1. Поскольку название препарата и информация о мишени лекарства предоставляются в двух отдельных файлах CSV, объедините информацию из двух файлов, чтобы впоследствии добавить названия лекарств, нацеленных на синтетического партнера по летальному взаимодействию, к синтетическим смертельным взаимодействиям. Объедините два набора данных, используя общий столбец DrugBank-drug-ID. Сначала нормализуйте набор данных о лекарственных средствах, чтобы он содержал только один идентификатор drugBank-drug-ID на строку, так как исходный файл может содержать несколько идентификаторов лекарств DrugBank подряд, если белок нацелен на несколько лекарств.

      ##generate один файл, вмещенный символ гена-мишени лекарственного средства, идентификатор препарата DrugBank и название препарата
      набор данных #normalize о лекарственных средствах
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      ОЦС="\t"
      }
      {
      if(NR == 1){
      распечатать $0
      }else if($1 != "" && $2 != ""){
      сплит($2, drug_targets, ";")
      for(i в drug_targets){
      drug_target = drug_targets[i]
      gsub(/ /, "", drug_target)
      распечатать $1, drug_target | "сортировать -u"
      }
      }
      }' human_target_to_drugs_agg.txt > human_target_to_drug.txt

      #extract соответствующих столбцов и переформатировать для использования табуляции в качестве разделителя столбцов
      csvtool col 1,3 -u TAB "${DB_NAMES}" > drugbank_id_to_name.txt

      слияние human_target_to_drug.txt \
      drugbank_id_to_name.txt 2 1 > db_human_drug_targets.txt

      ПРИМЕЧАНИЕ: В первой и третьей колонках словаря drugbank.csv файл содержит идентификатор препарата DrugBank и соответствующее название.
  1. Добавьте препараты, нацеленные на синтетических партнеров по летальному взаимодействию, в набор данных о синтетическом летальном взаимодействии.
    1. Объедините набор данных о синтетическом летальном взаимодействии с файлом названия лекарственного средства-мишени, созданным на предыдущем шаге, используя столбцы символов генов, чтобы добавить лекарства к синтетическим смертельным взаимодействиям. Позаботьтесь о том, чтобы добавить названия лекарств для обоих партнеров каждого синтетического летального взаимодействия.
       
      ##enhance файл синтетического летального взаимодействия, добавив лекарства, нацеленные на партнеров каждого синтетического летального взаимодействия
      объединить bg_synlet_mapped.txt db_human_drug_targets.txt 9 1 > tmp.txt
      объединить tmp.txt db_human_drug_targets.txt 10 1 > bg_synlet_mapped_drugs.txt

      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 3 приводит к синтетическому летальному взаимодействию нескольких организмов с их ортологичными человеческими генами и препаратами, нацеленными на эти гены.

4. Установление набора тестируемых в настоящее время комбинаций лекарственных средств в клинических испытаниях

  1. Получите доступ к ClinicalTrials.gov данным.
    1. Получение информации о клинических испытаниях в формате XML из ClinicalTrials.gov по (i) отдельным испытаниям, (ii) испытаниям, полученным в результате поискового запроса, или (iii) по всем испытаниям в базе данных. В качестве альтернативы используйте ресурсы, предоставляемые инициативой по трансформации клинических испытаний, которая также содержит все данные из ClinicalTrials.gov в реляционной базе данных. Более подробную информацию см. в шаге 4.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для доступа к облачному экземпляру базы данных, размещенному в рамках инициативы по трансформации клинических испытаний, требуется бесплатная учетная запись. Кроме того, требуется plsql клиент.
  2. Сосредоточьтесь на интервенционных испытаниях.
  3. Фильтр для испытаний, специфичных для указания интереса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ClinicalTrials.gov приводит названия заболеваний из контролируемого словаря NCBI Medical Subject Headings (MeSH). В отличие от названий заболеваний, предоставленных заявителем, контролируемый словарь позволяет эффективно идентифицировать испытания для указания интереса. Тем не менее, нужно иметь в виду, что контролируемый словарь NCBI MeSH является тезаурусом. Поэтому проверьте Браузер MeSH (https://meshb.nlm.nih.gov), если общее указание интереса имеет какие-либо дочерние / более узкие термины, и включите их, если это необходимо.
  4. Получить идентифицированные испытания вместе с препаратами, протестированными в этих испытаниях. Запрос на испытания с общим показанием рака яичников приведен ниже.

    ##retrieve интервенционные испытания для рака яичников с общим показанием из инициативы по трансформации клинических испытаний, размещенной реляционной базой данных, содержащей ClinicalTrials.gov данные
    кошка <\pset нижний колонтитул выключен
    ВЫБЕРИТЕ ОТДЕЛЬНЫЕ s.nct_id, s.brief_title, i.intervention_type i.name
    ОТ исследований
    ВНУТРЕННЕЕ СОЕДИНЕНИЕ browse_conditions c ON(s.nct_id = c.nct_id)
    Внутреннее соединение интервенций i ON(s.nct_id = i.nct_id)
    ГДЕ s.study_type = «Интервенционный»
    И c.mesh_term В (
    'Новообразования яичников',
    'Карцинома, эпителия яичников',
    'Гранулезо-клеточная опухоль',
    «Наследственный синдром рака молочной железы и яичников»,
    'Лютеома',
    'Синдром Мейгса',
    'Клеточная опухоль Сертоли-Лейдига',
    'Thecoma'
    )
    ЗАКАЗ ПО s.nct_id, i.intervention_type;
    ЕОФ
    psql --host="aact-db.ctti-clinicaltrials.org" --username="XXX" --password --no-align --field-separator="^I" --output="clinical_trials.txt" aact
  1. Извлеките названия лекарств и сопоставьте с названиями DrugBank.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя заманчиво напрямую использовать названия лекарств, полученные из клинических испытаний, представляющих интерес, необходимо знать, что названия вмешательств в ClinicalTrials.gov вводятся заявителем в качестве свободного текста. Как следствие, названия не стандартизированы, вместо общего названия соединения могут использоваться фирменные наименования, и нет никаких гарантий надлежащей нормализации данных (например, несколько наименований лекарственных средств в одной позиции). Кроме того, распространено, что препараты подаются с другим типом вмешательства, отличающимся от лекарственного. Поэтому сопоставление полученных названий вмешательств с названиями лекарств DrugBank лучше всего проводить вручную.

      ##Obtain список вмешательств, используемых в ранее полученном наборе клинических испытаний.
    вырезать -d "^I" -f3,4 clinical_trials.txt | хвост -n +2 | сортировать -u

    ПРИМЕЧАНИЕ: В колонках три и четыре содержатся тип вмешательства и название вмешательства, соответственно.

  1. Дополнение к препаратам, уже использующимся в клинических условиях из руководящих принципов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этап 4 приводит к составлению перечня препаратов, оцениваемых/используемых для индикации интереса.

5. Идентификация комбинаций лекарственных средств, нацеленных на синтетические летальные взаимодействия

  1. Поиск синтетических летальных взаимодействий, нацеленных на два препарата, представляющих интерес. Ограничьте набор данных от этапа 3 до препаратов, представляющих интерес, отфильтровав строки в файле, в которых содержится как лекарство А, так и лекарство В.

    ##only сохраняют записи о синтетических смертельных взаимодействиях и препаратах, вызывающих их, когда оба партнера являются мишенью двух интересующих препаратов (drug_a и drug_b).
    awk -F "\t" '{
    if( ($12 == drug_a && $14 == drug_b) || ($12 == drug_b && $14 == drug_a) ) {
    распечатать $0
    }
    }' drug_a="XXX" drug_b="YYY" bg_synlet_mapped_drugs.txt
  1. Убедитесь, что ни один из двух препаратов в одиночку не нацелен на обоих синтетических партнеров по летальному взаимодействию. Проверьте мишени каждого идентифицированного препарата в наборе данных из шага 3.2 и оцените, являются ли оба идентифицированных синтетических смертельных партнера мишенями конкретного препарата.

    ##find все записи о мишенях лекарств для данного названия препарата
    awk -F "\t" '{
    if($3 == лекарство){
    распечатать $0
    }
    }' drug="XXX" db_human_drug_targets.txt

    ПРИМЕЧАНИЕ: Препарат, который будет нацелен на оба синтетических пути летального взаимодействия, будет токсичен для любой клетки, поэтому теоретически он не является ценным многоцелевым агентом. Именно по этой причине эта возможность исключена на данном этапе алгоритма.
     

6. Тестирование выбранных новых комбинаций препаратов in vitro

  1. Лечить клеточные линии рака молочной железы человека и доброкачественные эпителиальные клетки молочной железы человека, культивированные стандартными методами культивирования in vitro в увлажненной атмосфере 37 ° C с 5% CO2 с различными комбинациями лекарств.
  2. Используйте средства, дополненные фетальной бычим сывороткой и пенициллином, а также сульфатом стрептомицина, чтобы предотвратить бактериальную инфекцию.
  3. Разбавляют лекарственные средства в растворителях, таких как ДМСО или фосфатно-буферный физиологический раствор, по меньшей мере в четырех различных концентрациях на основе их ранее установленного IC50 (ингибирующая концентрация) и используют их в комбинации или отдельно для лечения клеток.
  4. Выполняйте анализы жизнеспособности клеток и анализы апоптоза, такие как окрашивания AnnexinV / 7-AAD, чтобы определить цитотоксические эффекты, вызванные лечением.
  5. Мониторинг фармакологического ингибирования подозреваемых молекулярных мишеней с использованием вестерн-блотов.
  6. Различают синтетическую летальность от чисто аддитивных эффектов, вычисляя комбинаторный индекс (КИ), как описано Чоу и др.23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Наша группа недавно опубликовала два исследования, применяющих рабочий процесс, изображенный в этой рукописи, для выявления комбинаций лекарств, нацеленных на синтетические смертельные взаимодействия в контексте рака яичников и молочной железы24,25. В первом исследовании мы оценили комбинации лекарств, которые в настоящее время тестируются на поздней стадии клинических испытаний (фазы III и IV) или уже используются в клинической практике для лечения пациентов с раком яичников в отношении их влияния на синтетические летальные взаимодействия. Кроме того, мы определили комбинации лекарств, которые в настоящее время не тестируются в клинических испытаниях, но дают обоснование с точки зрения нацеливания на синтетические смертельные взаимодействия. Поэтому мы оценили все возможные комбинации лекарств, выбирая препараты из пула всех соединений в испытаниях рака яичников на поздней стадии. Мы идентифицировали уникальный набор из 61 комбинации лекарств, которые были исследованы в 68 испытаниях рака яичников на поздней стадии. Двенадцать из этих 61 комбинаций лекарств касались по меньшей мере одного синтетического летального взаимодействия. Было предложено 84 дополнительные комбинации лекарств для решения синтетических летальных взаимодействий без исследования в клинических испытаниях на сегодняшний день. 21 уникальный препарат внес свой вклад в 84 идентифицированные комбинации лекарств, нацеленные на набор из 39 синтетических смертельных интеракторов, как показано на рисунке 1.

Figure 1
Рисунок 1: Сеть предлагаемых новых комбинаций лекарств в контексте рака яичников. На рисунке 1 показаны синтетические летальные взаимодействия, в которых интеракторы рассматриваются двумя препаратами, которые в настоящее время не тестируются в клинических испытаниях. Синлетные взаимодействия отображаются красным цветом, тогда как связи между лекарством и мишенью обозначены серыми краями. Пунктирные линии представляют синтетические летальные взаимодействия, рассматриваемые другими комбинациями лекарств в клинических испытаниях рака яичников на поздней стадии. Эти исследуемые комбинации лекарственных средств обозначены звездочкой (*),каждая в комбинации с паклитакселом, причем дополнительная исследуемая комбинация цедираниба и олапариба обозначена кругом (o) [адаптировано из 25]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Используя тот же рабочий процесс во втором исследовании, мы идентифицировали 243 многообещающие комбинации лекарств, нацеленные на 166 синтетических смертельных генных пар в контексте рака молочной железы. Мы экспериментально протестировали выбранные комбинации лекарств относительно их влияния на жизнеспособность клеток и апоптоз в двух клеточных линиях рака молочной железы. В частности, предложенная низкотоксичная комбинация препаратов целекоксиба и золедроновой кислоты показала цитотоксичность за пределами аддитивных эффектов в клеточных линиях рака молочной железы, определяемых их комбинаторным индексом. Результаты анализов жизнеспособности и апоптоза для этой комбинации препаратов показаны на рисунке 2.

Figure 2
Рисунок 2: Влияние целекоксиба и золедроновой кислоты на жизнеспособность и апоптоз в клетках SKBR-3. (A)Результаты анализа жизнеспособности для целекоксиба (CEL), золедроновой кислоты (ZOL) и комбинации золедроновой кислоты и целекоксиба (ZOL + CEL) в клеточных линиях рака молочной железы SKBR-3. Использовались низкие и высокие концентрации CEL 50 мкМ и 75 мкМ. Низкие и высокие концентрации ЗОЛ были 500 мкМ и 750 мкМ. Комбинация препарата оказала значительное синергетическое влияние на жизнеспособность клеток (** p < 0,001). (В, С) Аннексин V (ANXA5) и 7-AAD окрашивания клеток SKBR-3, обработанных CEL, ZOL и комбинацией препаратов ZOL + CEL. Процентное содержание клеток 7-AADpos/ANXA5pos увеличивалось после лечения лекарственной комбинацией ZOL + CEL [адаптировано из 24]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Мы наметили рабочий процесс для выявления комбинаций лекарств, влияющих на синтетические смертельные взаимодействия. Этот рабочий процесс использует (i) данные о синтетических летальных взаимодействиях из модельных организмов, (ii) информацию ортологов человека, (iii) информацию об ассоциациях лекарственного средства-мишени, (iv) информацию о лекарственных средствах о клинических испытаниях в контексте рака, а также (v) информацию о лекарственных средствах и ассоциациях генов-болезней, извлеченную из научной литературы. Консолидированная информация может быть использована для оценки влияния данной исследуемой комбинации лекарственных средств на синтетические смертельные пары генов. Кроме того, консолидированные данные могут быть использованы для оценки набора лекарств, которые в настоящее время исследуются или тестируются в клинических испытаниях в контексте рака, чтобы найти комбинации, нацеленные на наиболее релевантные синтетические летальные взаимодействия, поэтому имеют более высокие шансы повлиять на выживаемость опухолевых клеток. Наконец, полученные данные могут быть использованы для скрининга комбинаций лекарств, состоящих из лекарств, первоначально не разработанных для лечения опухоли, что обеспечивает способ для вычислительного случая репозиционирования лекарств.

Для каждого шага в рабочем процессе интеграции данных мы представляем ключевые источники данных для завершения полного рабочего процесса данных, но указываем, что рабочий процесс может быть дополнительно улучшен на различных этапах за счет использования дополнительных источников данных. В нашем рабочем процессе мы извлекли синтетические пары летального взаимодействия из базы данных BioGRID18. Особое внимание мы уделили взаимодействиям экспериментальных типов «синтетическая летальность» и «негативная генетическая». Информация в BioGRID о синтетических летальных взаимодействиях содержит наборы данных из большого генетического экрана, как, например, набор данных, опубликованный Костанцо и его коллегами26,который также доступен в базе данных DRYGIN27,а также данные об одиночных синтетических смертельных взаимодействиях, как описано в отдельных экспериментах в научной литературе. Существуют дополнительные источники данных, собирающие и хранящие синтетические летальные взаимодействия, как, например, SynLethDB28. Кроме того, на уровне картографирования орфографии существует большое количество различных инструментов и баз данных. Мы представляем способ использования биомарта Ensembl для сопоставления синтетических летальных партнеров взаимодействия, идентифицированных в модельных организмах, с их соответствующими человеческими ортологами. Другие ортологические базы данных и услуги включают базу данных HomoloGene29NCBI, ортологическую базу данных OMA от Швейцарского института биоинформатики30или базу данных групп ортологов InParanoid, поддерживаемую Стокгольмским центром биоинформатики31. В нашем рабочем процессе мы сосредоточились на синтетических смертельных взаимодействиях от нескольких модельных организмов, причем наибольшее количество синтетических смертельных взаимодействий происходит от дрожжей. Можно было бы рассмотреть вопрос об ограничении входного набора для картографирования орфографии данными только от мышей и крыс, которые эволюционно ближе к людям. Дополнительный способ определения входного набора синтетических летальных взаимодействий заключается в том, чтобы сосредоточиться только на синтетических смертельных взаимодействиях, сохраняемых у нескольких видов, тем самым увеличивая шансы на то, что синтетическое летальное взаимодействие действительно положительно. Это, с другой стороны, может значительно сократить набор синтетических летальных взаимодействий, поскольку уже существует большая разница в идентифицированных синтетических летальных взаимодействиях между S. cerevisiae и S. pombe. Другой подход заключается в том, чтобы не быть слишком строгим в начале и даже расширить набор экспериментальных синтетических смертельных взаимодействий с помощью алгоритмов машинного обучения, как мы это делали в двух исследованиях, перечисленных в разделе репрезентативных результатов. Короче говоря, случайная модель леса была использована для прогнозирования синтетических смертельных взаимодействий для человеческих генов, для которых в дрожжах не существовало ортологичных генов. Модель случайного леса была обучена на наборе синтетических пар летального взаимодействия из дрожжей и их ортологичных генов человека с использованием данных об ассоциациях путей, назначении генной онтологии, а также ассоциациях болезней и лекарств, как описаноранее 24,25. Это позволило нам рассмотреть человеческие гены, для которых в нашем рабочем процессе интеграции не было доступно информации ортолого картографирования. Широко используемой базой данных, хранящей информацию об ассоциациях лекарственных средств и мишеней, является DrugBank, который также является основным источником взаимодействий в рабочем процессе. Другими базами данных, вмещими в некоторой степени дополнительную информацию о мишенях лекарств, являются База данных терапевтических мишеней(TTD) 32 или ChEMBL33. Основные компоненты рабочего процесса также включены в платформу e.valuation от emergentec и SynLethDB, которая была разработана исследователями из Наньянского технологического университета. Последнее обновление SynLethDB в 2015 году, однако, было основано на наборах данных, хранящихся в разделе загрузки на соответствующей веб-странице28.

Способ ранжирования идентифицированных комбинаций лекарств и целевых пар синтетического летального взаимодействия заключается в использовании ассоциации синтетических летальных партнеров и / или лекарств с интересующей болезнью с помощью методов добычи литературы. В нашей работе по оценке комбинаций лекарств в контексте рака яичников мы ранжировали новые предлагаемые комбинации лекарств на основе количества публикаций о раке яичников, упоминающих один из двух синтетических смертельных интеракторов соответствующей комбинации лекарств. Аннотация MeSH в Pubmed может быть использована для идентификации публикаций для конкретного заболевания, используя точные термины заболевания, как указано в основной ветви MeSH C. Информация о генах в идентифицированных публикациях может быть извлечена с использованием картографического файла NCBI gene2pubmed, как описано в другом месте34. Кроме того, существуют специальные базы данных, вмещая связи между генами и/или лекарственными заболеваниями, такие как Сравнительная токсикогеномическая база данных35,DisGeNET36или программная платформа e.valuation. Ранжирование комбинаций лекарств на основе ассоциаций заболеваний является одним из способов поддержки окончательного выбора комбинаций лекарств для экспериментального тестирования. При выборе комбинаций лекарств для дальнейшего тестирования необходимо учитывать дополнительные аспекты, такие как, например, индивидуальные профили токсичности лекарств или статус экспрессии синтетических смертельных интеракторов в соответствующем органе-мишени.

В разделе репрезентативных результатов мы представляем данные о комбинации препаратов целекоксиба и золедроновой кислоты, которая была идентифицирована после рабочего процесса по выявлению комбинаций лекарств в контексте рака молочной железы. Эта конкретная комбинация препаратов была выбрана для экспериментальных испытаний из-за низких профилей токсичности обоих соединений. Мы использовали различные концентрации в экспериментах in vitro для оценки влияния комбинации препаратов на жизнеспособность клеток и апоптоз. В идеале концентрации лекарств могут быть значительно снижены для отдельных лекарств, чтобы свести к минимуму побочные эффекты и в то же время максимизировать эффективность путем объединения двух препаратов. Наблюдение влияния на жизнеспособность при более низких дозах еще более значимо, поскольку концентрации лекарств, используемые для тестирования in vitro, могут быть подвергнуты критике как супратерапевтические, которые не достигаются в моделях in vivo. Тем не менее, концентрации были выбраны на основе экспериментов клеточной культуры с этими данными препаратами в литературе. Дозирование лекарств может дополнительно влиять на то, какие мишени в первую очередь затронуты, поскольку большинство соединений имеют более одной лекарственной мишени, потенциально влияя на большой набор известных и неизвестных молекул. Поэтому комбинации лекарств, демонстрирующие синергетическое влияние на жизнеспособность клеток в системах культивирования клеток in vitro, должны быть дополнительно исследованы в 3D- или in-vivo моделях.

Подводя итог, мы представляем рабочий процесс, который объединяет информацию из различных источников данных для оценки и предложения комбинаций лекарств, нацеленных на синтетические смертельные взаимодействия. На сегодняшний день наибольшая информация о синтетических летальных взаимодействиях по-прежнему поступает от модельных организмов, требующих обязательного этапа картографирования орфографии в геном человека. Первые скрининги в гаплоидных клетках человека привели к выявлению синтетических летальных взаимодействий в клетках человека. Кроме того, технология CRISPR/CAS открыла новые способы изучения синтетических летальных взаимодействий на клеточном уровне. С получением более качественных данных о биологическом синтетическом летальном взаимодействии мы предполагаем, что усилия по интеграции данных, такие как наши, преобразуют клиническое лечение рака в будущем, обнаружив новые и клинически значимые синтетические пары летальных генов помимо BRCA (1/2) / PARP1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

AH и PP были сотрудниками emergentec biodevelopment GmbH на момент проведения анализов, приведших к результатам, представленным в репрезентативном разделе результатов. ММ и МК нечего раскрывать.

Acknowledgments

Финансирование для разработки рабочего процесса интеграции данных было получено из Седьмой рамочной программы Европейского сообщества в рамках грантового соглашения nu. 279113 (OCTIPS). Адаптация данных в рамках этой публикации была любезно одобрена Публичной библиотекой научных публикаций и Impact Journals, LLC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioGRID n/a n/a thebiogrid.org
ClinicalTrials.gov n/a n/a ClinicalTrials.gov
DrugBank n/a n/a drugbank.ca
Ensembl BioMart n/a n/a ensembl.org
for alternative computational databases please refer to the manuscript
7-AAD ebioscience 00-6993-50
AnnexinV-APC BD Bioscience 550474
celecoxib Sigma-Aldrich PZ0008-25MG
CellTiter-Blue Viability Assay Promega G8080
FACS Canto II BD Bioscience n/a
fetal bovine serum Fisher Scientific/Gibco 16000044
FloJo Software FloJo LLC V10
McCoy's 5a Medium Modified Fisher Scientific/Gibco 16600082
penicillin G/streptomycin sulfate Fisher Scientific/Gibco 15140122
SKBR-3 cells American Type Culture Collection (ATCC) ATCC HTB-30
zoledronic acid Sigma-Aldrich SML0223-50MG
further materials or equipment will be made available upon request

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dobzhansky, T. Genetics of natural populations; recombination and variability in populations of Drosophila pseudoobscura. Genetics. 31, 269-290 (1946).
  2. Hartwell, L. H., Szankasi, P., Roberts, C. J., Murray, A. W., Friend, S. H. Integrating genetic approaches into the discovery of anticancer drugs. Science. 278 (5340), New York, N.Y. 1064-1068 (1997).
  3. D'Amours, D., Desnoyers, S., D'Silva, I., Poirier, G. G. Poly(ADP-ribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions. The Biochemical Journal. 342 (2), 249-268 (1999).
  4. Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).
  5. Farmer, H., et al. Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature. 434 (7035), 917-921 (2005).
  6. McCann, K. E., Hurvitz, S. A. Advances in the use of PARP inhibitor therapy for breast cancer. Drugs in Context. 7, 212540 (2018).
  7. Franzese, E., et al. PARP inhibitors in ovarian cancer. Cancer Treatment Reviews. 73, 1-9 (2019).
  8. Ashworth, A., Lord, C. J. Synthetic lethal therapies for cancer: what’s next after PARP inhibitors. Nature Reviews. Clinical Oncology. 15 (9), 564-576 (2018).
  9. Yu, B., Luo, J. Synthetic lethal genetic screens in Ras mutant cancers. The Enzymes. 34, Pt B 201-219 (2013).
  10. Thompson, J. M., Nguyen, Q. H., Singh, M., Razorenova, O. V. Approaches to identifying synthetic lethal interactions in cancer. The Yale Journal of Biology and Medicine. 88 (2), 145-155 (2015).
  11. Ruiz, S., et al. A Genome-wide CRISPR Screen Identifies CDC25A as a Determinant of Sensitivity to ATR Inhibitors. Molecular Cell. 62 (2), 307-313 (2016).
  12. Housden, B. E., Nicholson, H. E., Perrimon, N. Synthetic Lethality Screens Using RNAi in Combination with CRISPR-based Knockout in Drosophila Cells. Bio-Protocol. 7 (3), (2017).
  13. Blomen, V. A., et al. Gene essentiality and synthetic lethality in haploid human cells. Science. 350 (6264), New York, N.Y. 1092-1096 (2015).
  14. Forment, J. V., et al. Genome-wide genetic screening with chemically mutagenized haploid embryonic stem cells. Nature Chemical Biology. 13 (1), 12-14 (2017).
  15. Wildenhain, J., et al. Prediction of Synergism from Chemical-Genetic Interactions by Machine Learning. Cell Systems. 1 (6), 383-395 (2015).
  16. Madhukar, N. S., Elemento, O., Pandey, G. Prediction of Genetic Interactions Using Machine Learning and Network Properties. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 172 (2015).
  17. Fechete, R., et al. Synthetic lethal hubs associated with vincristine resistant neuroblastoma. Molecular BioSystems. 7 (1), 200-214 (2011).
  18. Oughtred, R., et al. The BioGRID interaction database: 2019 update. Nucleic Acids Research. 47, D1 529-541 (2019).
  19. Zeeberg, B. R., et al. Mistaken identifiers: gene name errors can be introduced inadvertently when using Excel in bioinformatics. BMC bioinformatics. 5, 80 (2004).
  20. Ziemann, M., Eren, Y., Gene El-Osta, A. name errors are widespread in the scientific literature. Genome Biology. 17 (1), 177 (2016).
  21. Kersey, P. J., et al. Ensembl Genomes 2018: an integrated omics infrastructure for non-vertebrate species. Nucleic Acids Research. 46, D1 802-808 (2018).
  22. Wishart, D. S., et al. DrugBank 5.0: a major update to the DrugBank database for 2018. Nucleic Acids Research. 46, D1 1074-1082 (2018).
  23. Chou, T. C. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Research. 70 (2), 440-446 (2010).
  24. Marhold, M., et al. Synthetic lethal combinations of low-toxicity drugs for breast cancer identified in silico by genetic screens in yeast. Oncotarget. 9 (91), 36379-36391 (2018).
  25. Heinzel, A., et al. Synthetic lethality guiding selection of drug combinations in ovarian cancer. PloS One. 14 (1), 0210859 (2019).
  26. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), 425-431 (2010).
  27. Koh, J. L. Y., et al. DRYGIN: a database of quantitative genetic interaction networks in yeast. Nucleic Acids Research. 38, 502-507 (2010).
  28. Guo, J., Liu, H., Zheng, J. SynLethDB: synthetic lethality database toward discovery of selective and sensitive anticancer drug targets. Nucleic Acids Research. 44, 1011-1017 (2016).
  29. NCBI Resource Coordinators. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7-19 (2016).
  30. Altenhoff, A. M., et al. The OMA orthology database in 2018: retrieving evolutionary relationships among all domains of life through richer web and programmatic interfaces. Nucleic Acids Research. 46 (1), 477-485 (2018).
  31. Sonnhammer, E. L. L., Östlund, G. InParanoid 8: orthology analysis between 273 proteomes, mostly eukaryotic. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 234-239 (2015).
  32. Li, Y. H., et al. Therapeutic target database update 2018: enriched resource for facilitating bench-to-clinic research of targeted therapeutics. Nucleic Acids Research. 46 (1), 1121 (2018).
  33. Gaulton, A., et al. The ChEMBL database in 2017. Nucleic Acids Research. 45 (1), 945-954 (2017).
  34. Heinzel, A., Mühlberger, I., Fechete, R., Mayer, B., Perco, P. Functional molecular units for guiding biomarker panel design. Methods in Molecular Biology. 1159 (12), 109-133 (2014).
  35. Davis, A. P., et al. The Comparative Toxicogenomics Database: update 2019. Nucleic Acids Research. 47 (1), 948-954 (2019).
  36. Piñero, J., et al. DisGeNET: a comprehensive platform integrating information on human disease-associated genes and variants. Nucleic acids research. 45 (1), 833-839 (2017).

Tags

Исследования рака выпуск 171 синтетическая летальность генетические скрининги интеграция данных гомологическое картирование комбинации лекарств рак молочной железы лечение анализ жизнеспособности клеток
Рабочий процесс интеграции данных для выявления комбинаций лекарств, нацеленных на синтетические смертельные взаимодействия
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marhold, M., Heinzel, A., Merchant,… More

Marhold, M., Heinzel, A., Merchant, A., Perco, P., Krainer, M. A Data Integration Workflow to Identify Drug Combinations Targeting Synthetic Lethal Interactions. J. Vis. Exp. (171), e60328, doi:10.3791/60328 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter