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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

합성 치명적인 상호 작용을 대상으로 하는 약물 조합을 식별 하기 위해 데이터 통합 워크플로우

Published: May 27, 2021 doi: 10.3791/60328
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1
1Department of Internal Medicine I - Division of Oncology, Comprehensive Cancer Center, Medical University of Vienna, 2Department of Nephrology, Medical University of Vienna, 3Department of Internal Medicine IV, Medical University Innsbruck

Summary

모형 유기체에 있는 큰 유전 스크린은 부정적인 유전 상호 작용의 확인으로 이끌어 냈습니다. 여기에서는 모델 유기체의 유전 화면에서 데이터를 사용하여 암에 있는 합성 치명적인 상호 작용을 표적으로 하는 약물 조합을 설명하는 데이터 통합 워크플로우를 설명합니다.

Abstract

두 유전자 사이의 합성 치명적인 상호 작용은 두 유전자 중 하나를 노크 아웃 세포 생존가능성에 영향을 미치지 않지만 두 합성 치명적인 인터랙터 모두의 노크 아웃이 세포 생존 가능성 또는 세포 사망의 손실로 이어질 때 주어집니다. 가장 잘 연구 된 합성 치명적인 상호 작용은 BRCA1/2와 PARP1 사이, PARP1 억제제는 BRCA1/2 돌연변이 종양환자를 치료 하기 위해 임상 사례에서 사용 되 고. 모형 유기체에 있는 대형 유전 스크린 뿐 아니라 haploid 인간 세포주에서 수많은 추가적인 합성 치명적인 상호 작용 쌍의 확인으로 이끌어 냈습니다, 모두 새로운 종양 치료의 발달에 관심있는 잠재적인 표적이 되고. 한 가지 접근법은 관심있는 종양에서 돌연변이되거나 현저하게 다운 규제되는 합성 치명적인 상호 작용기를 가진 유전자를 치료적으로 표적으로 하는 것입니다. 두 번째 접근법은 합성 치명적인 상호 작용을 해결하는 약물 조합을 공식화하는 것입니다. 이 문서에서는 데이터 통합 워크플로우에 대해 설명하여 합성 치명적인 상호 작용을 대상으로 하는 약물 조합을 평가하고 식별합니다. 우리는 합성 치명적인 상호 작용 쌍에 사용 가능한 데이터 세트를 사용, homology 매핑 자원, 전용 데이터베이스에서 약물 대상 링크, 관심의 질병 영역에서 임상 시험에서 조사 되는 약물에 대 한 정보. 우리는 또한 난소와 유방암의 맥락에서 약 조합 평가에 우리의 단의 2개의 최근 연구 결과의 중요한 사실 인정을 강조합니다.

Introduction

합성 치사성은 1개의 유전자의 손실이 생존에 영향을 미치지 않는 2개의 유전자의 협회를 정의합니다, 그러나 두 유전자의 손실은 세포 죽음으로 이끌어 냅니다. 1946년 도브잔스키가 호모자구돌연변이를사육하여 drosophila의 다양한 표현형을 분석하면서 처음 기술되었다. 실행 가능한 자손을 생산하지 않은 돌연변이, 비록 실행 가능한 자체, 합성 치사 이론의 설립을위한 기초를 설정, 특정 다른 돌연변이와 교차 할 때 치명적인 표현형을 전시. Hartwell과 동료는 이 개념이 인간에 있는 암 치료에 적용될 지도 모르다2. 약리학적으로 자극된 합성 치사성은 돌연변이 유전자의 합성 치명적인 파트너가 약리학적 화합물에 의해 표적으로 할 수 있다는 점을 감안할 때 단 하나의 돌연변이에 의지할 수 있었습니다. 합성 치사성의 약리학적 인유도를 가능하게 하는 첫번째 유전자 쌍은 BRCA (1/2) 및 PARP1이었습니다. PARP1은 DNA 손상을 위한 센서로서 기능하며, 이중 및 단일 DNA 가닥 브레이크, 슈퍼코일 및 크로스오버3의부위에 묶여 있다. BRCA1 및 2는 동종 재조합4를통해 DNA 이중 가닥 휴식의 수리에 중요한 역할을한다. 농부와 동료는 BRCA1/2에 대한 세포 결핍이 PARP 억제에 취약하다는 사실 인정을 간행했습니다, 어떤 세포 독성이 BRCA 야생 형 세포에서 관찰되지 않는 동안5. 궁극적으로, PARP 억제제는 BRCA 결핍 유방 및 난소암6,7의처리를 위해 승인되었습니다. 또한, 약리학적 화합물의 임상 승인으로 이어지는 합성 치사 유전자 쌍은 많은 기대와 최근 암 연구 노력의 주요 영역8.

합성 치명적인 유전자 상호 작용은 과일 파리, C. 예르간 및 효모2를포함하여 다중 유기체에서 모델링되었습니다. RNA 간섭 및 CRISPR/CAS 라이브러리 녹아웃을 포함한 다양한 접근법을 사용하여 최근9년,10,11에서새로운 합성 치명적인 유전자 쌍이 발견되었습니다. CRISPR/CAS와 함께 RNAi의 실험 절차에 대한 프로토콜은 최근 Housden 및 동료12에의해 출판되었다. 한편, 연구원은 또한 합성 치명적인 상호 작용을 식별 하기 위해 haploid 인간 세포에 큰 화면을 실시13,14. 생물학적 네트워크 분석 및 기계 학습과 같은 실리코 방법에서도 합성 치명적인 상호 작용15, 16의발견에 대한 약속을보여주었습니다.

개념적으로, 항 종양 치료의 맥락에서 합성 치명적인 상호 작용을 사용하는 한 가지 접근법은 종양 세포에서 돌연변이 또는 비 기능성 단백질을 식별하는 것입니다, 치료 개입에 대한 약물 목표를 약속 하는 그들의 합성 치명적인 상호 작용 파트너를 만들기. 대부분의 종양 모형의 이질성 때문에, 연구원은 소위 합성 치명적인 허브 단백질을 위한 수색을 시작했습니다. 이러한 합성 치명적인 허브는 종양 샘플에서 돌연변이및 따라서 비 기능 또는 현저하게 다운 규제되는 다수의 합성 치명적인 상호 작용 파트너가 있습니다. 이러한 합성 치명적인 허브를 해결 하는 것은 약물 효능을 증가 또는 vincristine 내성 신경 아 세포종의 맥락에서 예를 들어 표시 될 수 있는 약물 저항을 극복에 약속을 보유17. 합성 치명적인 상호 작용의 개념을 사용 하 여 약물 치료를 향상 시키기 위해 두 번째 접근 은 합성 치명적인 상호 작용을 대상으로 약물 조합을 식별 하는. 이것은 이미 승인된 단 하나 항종양 치료의 새로운 조합및 종양학의 필드에 그밖 질병 지역에서 약의 재배치로 이끌어 낼 수 있었습니다.

이 문서에서는 합성 치명적인 상호 작용 쌍을 대상으로 하는 약물 조합 목록을 산출하는 단계별 절차를 제시합니다. 이 워크플로우에서, 우리(i)는 BioGRID의 합성 치명적인 상호 작용에 대한 데이터를 사용하고 (ii) Ensembl에서 동종 유전자에 대한 정보, (iii) DrugBank에서 약물 표적 쌍을 검색하고, (iv) ClinicalTrials.gov 질병-약물 협회를 구축하고, (v) 따라서 합성 치명적인 상호 작용을 해결하는 약물 조합세트를 생성한다. 마지막으로, 대표적인 결과 섹션에서 난소와 유방암의 맥락에서 약물 조합을 제공합니다.

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Protocol

1. 합성 치명적인 유전자 쌍 검색

  1. BioGrid에서 데이터 검색.
    1. 웹 브라우저를 사용하거나 컬 또는 wget18을사용하여 리눅스 명령줄에서 직접 https://downloads.thebiogrid.org/Download/BioGRID/Latest-Release/BIOGRID-ALL-LATEST.tab2.zip 탭2 형식으로 최신 BioGRID 상호 작용 파일을 다운로드합니다.

      ##download 최신 BioGRID 상호 작용 파일 의 압축을 풀기
      #download 컬을 사용하여 최신 BioGRID 상호 작용 파일
      컬 -o biogrid_latest.zip https://downloads.thebiogrid.org/Download/BioGRID/Latest-Release/BIOGRID-ALL-LATEST.tab2.zip
      다운로드한 데이터 파일을 #unpack
      지퍼 biogrid_latest.zip
      BG="바이오그리드-올-3.5.171.tab2.txt"
       
    2. zip 아카이브를 다운로드한 후 아카이브를 풀고 실제 데이터 집합 파일(BIOGRID-ALL-X)의 이름을 기록해야 합니다. 후속 단계에 대한 X.X.tab2.txt) BioGRID 데이터 파일은 다음 단계에서 필터링될 다양한 유형의 상호 작용을 보유합니다.
      참고: 합성 치명적인 상호 작용을 보유 하는 다른 소스 (예를 들어, DRYGIN, SynlethDB) 존재, 토론에 설명 된 대로.
  2. 합성 치사및 부정적인 유전 상호 작용 (실험 시스템)에 대한 필터.
    1. 합성 치명적인 상호 작용을 식별 하기 위해 상호 작용에 대 한 증거를 지원 의 특성을 나타내는 열 "실험 시스템"(열 번호 12)에서 정보를 사용 합니다.
    2. 데이터 집합을 음수 유전 또는 합성 치사성 값을 가진 항목으로 제한합니다. 같은 단계에서 는 아래 표 1에 나열된 후속 분석 단계에 관련된 열을 필터링하고 유지합니다.

      ##restrict 관련 컬럼에 BioGRID 상호 작용 파일을 유지하고 부정적인 유전 및 합성 치사성으로 분류 된 상호 작용을 유지
      컷 -d "^I" -f 1,8,9,9,12,16,17 "${BG}" \
      | awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      if(NR == 1){
      인쇄 $0
      }다른 경우 ($4 == "부정적인 유전" || $4 == "합성 치사"){
      인쇄 $0
      }
      }' > bg_synlet.txt

      참고: 코드 조각에서 ^나는 수평 탭을 나타내는 데 사용됩니다. 합성 성장 결함과 같은 추가 BioGRID 범주가 포함될 수 있다. 이 워크플로에 대한 관련성의 다른 열은 표 1에나열됩니다. BioGRID는 또한 개별 상호 작용에 대한 점수를 유지합니다. 컷오프는 강한/높은 신뢰도 상호 작용을 식별하는 데 사용될 수 있습니다.
열 번호 열 헤더 이름
3 유전자 이름
12 종
13 약물 아이디

표 1: BioGRID 데이터 파일의 관련 열입니다.

  1. 합성 치명적인 상호 작용이 보고 된 종을 식별합니다.
    1. 합성 치명적인 상호 작용 파트너 세금-IDs의 수를 결정 하 고 유기 체 당 사용 가능한 합성 치명적인 상호 작용의 수에 대 한 추정을 얻을.

      ##count 이전에 추출된 합성 치명적인 상호 작용에서 각 세금 ID의 출현 수
      컷 -d "^I" -f5,6 bg_synlet.txt | 꼬리 -n +2 | tr "\t" "\n" \
      | 정렬 | 유니크 -c | 정렬 -r -g

      참고: 1단계의 결과로, 상호 작용이 결정된 유기체의 유전자 심볼과의 합성 치명적인 상호 작용 목록. 합성 치명적인 상호 작용의 대다수는 모형 유기체에서 결정되었습니다. 스프레드시트 프로그램(예: Excel)에 파일을 로드할 때 유전자 기호19,20을망치지 않도록 하십시오.

2. 합성 치명적인 유전자 쌍을 인간 정형 교정으로 변환

  1. 1.3단계에서 확인된 관련 모델 유기체에 대한 인간 정형전을 검색합니다.
    1. Ensembl BioMart21에서 인간 정형소그를 검색하여 각각의 모델 유기체 유전자 데이터 집합을 인간 유전자 데이터 세트와 연결합니다. 이 작업을 위해 모델 유기체 및 정형 소인 유전자의 유전자를 나타내는 유전자 기호를 사용합니다. Ensembl BioMart 웹 서비스를 사용하여 검색 프로세스를 자동화하고 정형 전 유전자 쌍을 검색하기 위해 BioMart RESTful 액세스로 직접 쿼리를 보냅니다(자세한 내용은 아래 예제 및 Ensembl BioMart 도움말 및 문서 참조).

      ##retrieve 엔셈블 바이오마트의 사카로미세스 세레비시아에 대한 인간 정형전은 컬을 사용하여 바이오마트 쿼리를 바이오마트 RESTful 액세스 서비스로 직접 전송합니다.
      컬 -o s_cerevisiae.txt --데이터 urlencode '쿼리=

      <쿼리 가상스키마네임 = "기본" 포매트 = "TSV" 헤더 = "0" 고유로우 = "1" 카운트 = "" 데이터 집합ConfigVersion = "0.6" >

      <데이터세트 이름 = "scerevisiae_gene_ensembl" 인터페이스 = "기본" >
      <특성 이름 = "external_gene_name" />


      <데이터세트 이름 = "hsapiens_gene_ensembl" 인터페이스 = "기본" >
      <특성 이름 = "external_gene_name" />


      ' "http://www.ensembl.org/biomart/martservice"

      다른 모델 유기체에 대한 정형 처리 인간 유전자를 검색하기 위해, 제 1 데이터 집합 요소의 이름 속성값을 각각의 Ensembl 데이터 세트의 이름으로 바꾸고 쿼리를 다시 실행한다.

      참고: 정형교정 과정은 Ensembl BioMart 도움말 및 문서(http://www.ensembl.org/info/data/biomart/biomart_combining_species_datasets.html)에 잘 문서화되어 있습니다.
    1. URL http://www.ensembl.org/biomart/martview/9b71da1415aba480a52b8dc7dd554d63?VIRTUALSCHEMANAME=default&ATTRIBUTES=scerevisiae_gene_ensembl.default.feature_page.external_gene_name|hsapiens_gene_ensembl.default.page.external_gene_name&FILTERS=&VISIBLEPANEL=linkattributepanel을 통해 1.3단계에서 확인된 상위 종인 사카로미세스 세레비시아에 대한 인간 정형학에 대한 BioMart 쿼리에 대한 예에 액세스합니다.
      참고: 이 원고의 토론 섹션에 설명된 대로 상동성 매핑을 위한 다른 소스(예: 검거, 오마 브라우저, HomoloGene, inparanoid)가 존재합니다.
  2. 합성 치명적인 상호 작용을 추출하는 인간의 직교를 추가합니다.
    1. 2.1 단계에서 검색된 교정 쌍과 유기체 세금 ID 및 유전자 기호를 기반으로 합성 치명적인 상호 작용에 참여하십시오. 인간 합성 치명적인 상호 작용 쌍의 경우 데이터 집합에 존재하는 각 인간 유전자에 대한 인공 정형 소 쌍을 만들거나 인간 합성 치명적인 상호 작용이 새로 추가 된 컬럼으로 인간 유전자 기호를 결합하고 전송하는 동안 폐기되지 않도록하십시오.

      ##collect 단일 파일에 치열 교정 매핑 및 합성 치명적인 상호 작용 파일과 결합
      직교 매핑을 수집하기 위한 헤더가 있는 대상 파일 #create
      에코 "tax_id/gene_symbol^Ihuman_gene_symbol" > 매핑.txt

      각 모델 유기체에 대한 이 단계를 #repeat 입력 파일 이름과 세금 ID를 조정하십시오.
      매핑의 새 항목을 s_cerevisiae.txt 각 정형 소에 대한 #adds.txt: 유전자 기호는 합성 치명적인 상호 작용 파일과 후속 결합을 용이하게하기 위해 세금 ID와 사전 고정
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      org_tax_id="559292"
      }
      {
      if ($1!= "" & $2 != """){{
      인쇄 org_tax_id"/"$1, $2
      }
      }' s_cerevisiae.txt >> 매핑.txt

      인간 유전자에 대한 #create 인공 매핑 항목
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      human_tax_id="9606"
      }
      {
      if($5 == human_tax_id){
      인쇄 $5"/"$2, $2
      }
      if($6 == human_tax_id){
      인쇄 $6"/"$3, $3
      }
      }' bg_synlet.txt | 정렬 -u >> 매핑.txt

      #add 합성 치명적인 상호 작용에 필요한 키 (세금 ID / 유전자 기호)
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      if(NR == 1){
      인쇄 $0, "키 상호 작용자 A", "키 상호 작용자 B"
      }기타{
      인쇄 $0, $5"/"$2, $6"/"$3
      }
      }' bg_synlet.txt > tmp_bg_synlet_w_keys.txt

      #join 치열 교정 쌍과의 합성 치명적인 상호 작용
      tmp_bg_synlet_w_keys.txt 매핑.txt 7 1 > tmp를 병합합니다.txt
      tmp.txt 매핑.txt 8 1 > bg_synlet_mapped.txt 병합

      참고: 이 예제에서 사용되는 병합 명령은 표준 유닉스 명령이 아닙니다. 그러나 GNU 핵심 유틸리티의 도움으로 구현하는 것은 간단합니다. 명령 조인과 결합하기 전에 파일을 정렬하는 복잡성을 숨기도록 명령이 도입되었습니다. 병합의 구현은 https://github.com/aheinzel/merge-sh 찾을 수 있습니다.
    1. 어떤 유전자 식별자의 사용은 최상의 결과를 위해 특정 네임스페이스에서 유전자를 고유하게 식별한다.
      참고: 2단계는 인간 유전자에 매핑된 여러 유기체의 합성 치명적인 상호 작용 목록을 생성합니다.

3. 합성 치명적인 상호 작용 파트너를 약물에 매핑

  1. DrugBank에서 약물 대상 쌍을 검색합니다.
    1. DrugBank의 다운로드 섹션에서 DrugBank 데이터를 다운로드하고 이미22를생성하지 않은 경우 먼저 계정을 만듭니다. 약물 대상 식별자(단백질 식별자 섹션: https://www.drugbank.ca/releases/latest#protein-identifiers)와 DrugBank 어휘(개방형 데이터 섹션: https://www.drugbank.ca/releases/latest#open-data)와 함께 약물 대상 식별자 및 이름을 사용하여 CSV 파일을 사용합니다. 또는 XML 데이터베이스 덤프에서 필요한 정보를 추출합니다.

      ##restrict 관련 컬럼에 DrugBank 약물 대상 파일을 유지하고 인간 분자 실체에 대한 항목만 유지
      DB_TARGETS="모두.csv"
      DB_NAMES="마약 은행 어휘.csv"

      관련 열 및 리모핀을 #extract 탭을 열 분리기로 사용합니다.
      csvtool 콜 3,12,13 -u TAB "${DB_TARGETS}" > target_to_drugs_agg.txt

      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      if(NR == 1 || $2 == "인간"){
      인쇄 $1, $3
      }
      }' target_to_drugs_agg.txt > human_target_to_drugs_agg.txt

      참고: DrugBank 데이터는 두 가지 주요 형식으로 제공됩니다. 전체 데이터베이스는 XML 파일로 사용할 수 있습니다. 또한 대부분의 데이터는 일련의 CSV(쉼표 구분값) 파일에서 사용할 수 있습니다.
    1. 또한 약국은 비인간 약물 목표를 기록합니다. 종 컬럼(열 번호 12)은 인간 약물 표적을 추출하는 데 사용될 수 있다.
      참고: 추출된 열의 가독성 이름을 보려면 표 2에제공됩니다. 다른 소스 (예를 들어, 치료 대상 데이터베이스 또는 Chembl) 약물 대상 링크를 보유, 토론 섹션에 설명 된 대로.
열 번호 열 헤더 이름
3 유전자 이름
12 종
13 약물 아이디
  1. 약물 표적에 약물 이름을 추가합니다.
    1. 약물 이름과 약물 표적 정보는 두 개의 별도 CSV 파일에 제공되기 때문에 두 파일에서 정보를 병합하여 합성 치명적인 상호 작용 파트너를 대상으로 하는 약물의 이름을 합성 치명적인 상호 작용에 추가합니다. 일반적인 DrugBank-drug-ID 열을 사용하여 두 데이터 집합에 참여하십시오. 약물 표적 데이터 집합을 먼저 정상화하여 단일 DrugBank-drug-ID만 행당 포함되며, 초기 파일은 여러 약물의 표적이 되는 경우 여러 DrugBank 약물 ID를 연속으로 보유할 수 있기 때문에.

      ##generate 약물 표적 유전자 기호, DrugBank 약물 ID 및 약물 이름을 들고 있는 단일 파일
      #normalize 약물 대상 데이터 집합
      awk -F "\t" 'BEGIN{
      OFS="\t"
      }
      {
      if(NR == 1){
      인쇄 $0
      }다른 경우 ($1!= """&$2!= """){
      분할($2, drug_targets, ";")
      for (drug_targets){
      drug_target = drug_targets[i]
      gsub (/, "", drug_target)
      인쇄 $1, drug_target | "sort-u"
      }
      }
      }' human_target_to_drugs_agg.txt > human_target_to_drug.txt

      #extract 관련 열 및 리모핀으로 탭을 열 구분기로 사용
      csvtool 콜 1,3 -u 탭 "${DB_NAMES}" > drugbank_id_to_name.txt

      병합 human_target_to_drug.txt \
      drugbank_id_to_name.txt 2 1 > db_human_drug_targets.txt

      참고 : 칼럼 1 과 3 마약 은행 어휘에.csv 파일은 DrugBank 마약 ID와 각 이름을 보유하고 있습니다.
  1. 합성 치명적인 상호 작용 데이터 집합에 합성 치명적인 상호 작용 파트너를 대상으로 약물을 추가합니다.
    1. 합성 치명적인 상호 작용에 약물을 추가 하는 유전자 심볼 열을 사용 하 여 이전 단계에서 생성 된 약물 표적 약물 이름 파일합성 치명적인 상호 작용 데이터 집합에 가입. 각 합성 치명적인 상호 작용의 두 파트너에 대 한 약물 이름을 추가 하는 주의.
       
      ##enhance 각 합성 치명적인 상호 작용의 파트너를 대상으로 약물을 추가하여 합성 치명적인 상호 작용 파일
      9 1 > tmp bg_synlet_mapped.txt db_human_drug_targets.txt 병합.txt
      병합 tmp.txt db_human_drug_targets.txt 10 1 > bg_synlet_mapped_drugs.txt

      참고: 3단계는 이러한 유전자를 대상으로 하는 정형소 인간 유전자 및 약물과 여러 유기체의 합성 치명적인 상호 작용을 초래합니다.

4. 임상 시험에서 현재 테스트 된 약물 조합 세트 설정

  1. ClinicalTrials.gov 데이터에 액세스할 수 있습니다.
    1. (i) 개별 시험, (ii) 검색 쿼리로 인한 시험 또는 (iii) 데이터베이스의 모든 시험에서 ClinicalTrials.gov XML 형식으로 임상 시험에 대한 정보를 검색합니다. 또는 관계형 데이터베이스에서 ClinicalTrials.gov 모든 데이터를 호스팅하는 임상 시험 변환 이니셔티브에서 제공하는 리소스를 사용하십시오. 자세한 내용은 4.4 단계를 참조하십시오.
      참고: 임상 시험 변환 이니셔티브가 호스팅하는 클라우드 호스팅 데이터베이스 인스턴스에 액세스하려면 무료 계정이 필요합니다. 또한 plsql 클라이언트가 필요합니다.
  2. 중재 적 시험에 초점을 맞춥니다.
  3. 관심 표시에 대한 특정 시험을 필터링합니다.
    참고: ClinicalTrials.gov NCBI 의료 과목 제목(MeSH) 제어 어휘에서 질병 이름을 제공합니다. 제출자가 질병 이름을 제공한 것과는 달리, 통제된 어휘는 관심의 표시를 위한 예심을 효율적으로 식별할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 NCBI MeSH가 제어하는 어휘는 동의어라는 점을 명심해야 합니다. 따라서 일반적인 관심 표시에 자녀 /좁은 용어가 있는 경우 MeSH 브라우저(https://meshb.nlm.nih.gov)를 확인하고 적절한 경우 포함하십시오.
  4. 이 예심에서 시험된 약과 함께 확인된 예심을 검색합니다. 난소암의 일반적인 표시에 있는 예심을 위한 쿼리는 아래에 제공됩니다.

    ##retrieve 임상 시험 변환 이니셔티브에서 일반적인 표시 난소암에 대한 중재 시험은 ClinicalTrials.gov 데이터를 포함하는 관계형 데이터베이스를 호스팅
    고양이 <\pset 푸터 끄기
    고유한 s.nct_id, s.brief_title, i.intervention_type, i.name 선택
    에서 연구
    내부 조인 browse_conditions c ON (s.nct_id = c.nct_id)
    내부 조인 개입 i ON (s.nct_id = i.nct_id)
    s.study_type = '중재'
    c.mesh_term
    '난소신생물',
    '암종, 난소 상피',
    '과립세포 종양',
    '유전 유방 및 난소암 증후군',
    '루테마',
    '메이그 증후군',
    '세르톨리-레이디그 세포 종양',
    '테코마'
    )
    s.nct_id, i.intervention_type 의해 주문;
    EOF
    psql --host="aact-db.ctti-clinicaltrials.org"--사용자 이름="XXX" --암호 --노 정렬 --필드 구분="^I" --출력="clinical_trials.txt" aact
  1. 약물 이름과 지도를 DrugBank 이름으로 추출합니다.
    참고: 임상 시험에서 검색된 약물 이름을 직접 사용하는 것은 유혹적이지만 ClinicalTrials.gov 개입 이름이 제출자에서 무료 텍스트로 입력된다는 것을 알아야 합니다. 결과적으로, 이름은 표준화되지 않고, 브랜드 이름은 공통 복합 이름 대신 사용될 수 있으며 적절한 데이터 정규화(예: 한 항목의 여러 약물 이름)에 대한 보장은 없습니다. 또한 약물이 약물과 다른 다른 내정간섭 유형으로 제출되는 것이 일반적입니다. 따라서, DrugBank 약물 이름에 검색 된 개입 이름의 매핑은 가장 수동으로 수행된다.

      ##Obtain 이전에 검색된 임상 시험 집합에 사용된 내정간섭 목록을 #Obtain.
    컷 -d "^I" -f3,4 clinical_trials.txt | 꼬리 -n +2 | sort -u

    참고: 각각 3열과 4개의 보류 유형의 개입 및 개입 이름입니다.

  1. 지침서에서 이미 임상 사용 약물로 보완
    참고: 4단계는 관심의 표시를 위해 평가/사용 중인 약물 목록을 작성합니다.

5. 합성 치명적인 상호 작용을 대상으로 하는 약물 조합 식별

  1. 관심있는 두 약물에 의해 표적이되는 합성 치명적인 상호 작용을 검색합니다. 약물 A와 약물 B를 모두 보유하는 파일의 줄을 필터링하여 데이터 집합을 3단계에서 관심 있는 약물로 제한합니다.

    ##only 두 파트너가 관심의 두 약물에 의해 대상이되는 합성 치명적인 상호 작용및 약물을 트리거 약물에 대한 항목을 유지 (drug_a 및 drug_b)
    awk -F "\t" '{
    ($12 == drug_a & $14 ===drug_b) || ($12 == drug_b & $14 ===drug_a) ) {
    인쇄 $0
    }
    }' drug_a="XXX" drug_b="YYY" bg_synlet_mapped_drugs.txt
  1. 두 약물 중 어느 것도 두 가지 합성 치명적인 상호 작용 파트너를 대상으로하지 않는지 확인하십시오. 3.2단계에서 확인된 각 약물의 약물 표적을 확인하고 확인된 합성 치명적인 파트너가 특정 약물의 표적인지 평가한다.

    ##find 주어진 약물 이름에 대 한 모든 약물 대상 항목
    awk -F "\t" '{
    if ($3 == 약물){
    인쇄 $0
    }
    }' 마약="XXX" db_human_drug_targets.txt

    참고: 두 합성 치명적인 상호 작용 경로를 대상으로 하는 약물은 모든 세포에 독성이 있을 것이므로 이론적으로는 귀중한 다중 표적 에이전트가 아닙니다. 이것이 알고리즘의 이 단계에서 이러한 가능성이 배제되는 이유입니다.
     

6. 시험관내 신약 조합 선정 테스트

  1. 인간 유방암 세포주 및 인체 양성 유방 상피세포를 다양한 약물 조합으로 5%CO2로 가습된 37°C 분위기에서 체외 배양 방법으로 표준으로 배양하였다.
  2. 태아 소 혈청과 페니실린뿐만 아니라 세균 감염을 방해하기 위해 연쇄 절제술 황산염으로 보충 된 미디어를 사용합니다.
  3. DMSO 또는 인산염 완충식식염과 같은 용매에 약물을 희석하여 이전에 설립된 IC50(억제 농도)에 기초한 적어도 4개의 상이한 농도에서 이를 조합하거나 단독으로 사용하여 세포의 치료를 위해 사용합니다.
  4. 세포 생존성 연구제 및 세포 세포 애떨이 소싱을 수행하여 부속서V/7-AAD 염색을 수행하여 치료에 의한 세포독성 효과를 결정합니다.
  5. 서쪽 얼룩을 사용하여 의심되는 분자 표적의 약리학 억제를 감시합니다.
  6. 추(Chou) 및 다른 사람에 의해 설명된 바와 같이 합성 치사효과를 순수 첨가제 효과와 구별하여 조합지수(CI)를산출한다(23).

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Representative Results

우리 그룹은 최근 난소와 유방암의 맥락에서 합성 치명적인 상호 작용을 대상으로 약물 조합을 식별하기 위해이 원고에 묘사 된 워크 플로우를 적용하는 두 가지 연구를 발표했다24,25. 첫 번째 연구에서는, 우리는 현재 말기 임상 시험에서 시험되는 약물 조합을 평가 (단계 III 및 IV) 또는 합성 치명적인 상호 작용에 미치는 영향에 관한 난소암 환자를 치료하기 위해 임상 사례에 이미 사용되고. 또한, 우리는 현재 임상 시험에서 시험되지 않는 약 조합을 확인했습니다 그러나 합성 치명적인 상호 작용을 표적으로 하는 관점에서 근거를 제공합니다. 따라서 우리는 말기 난소암 예심에 있는 모든 화합물의 풀에서 약을 선택하는 모든 가능한 약 조합을 평가했습니다. 우리는 68의 말기 난소암 예심에서 조사된 61개의 약 조합의 유일한 세트를 확인했습니다. 이들 중 12 11 약물 조합 적어도 하나의 합성 치명적인 상호 작용을 해결. 84 추가 약물 조합은 현재까지 임상 시험에서 조사되지 않고 합성 치명적인 상호 작용을 해결하기 위해 제안되었다. 21 고유 약물은 도 1에서주어진 39 합성 치명적인 인터랙터의 세트를 대상으로 84 확인 된 약물 조합에 기여했다.

Figure 1
그림 1: 난소암의 맥락에서 제안된 새로운 약 조합의 네트워크. 그림 1은 현재 임상 시험에서 테스트되지 않는 두 약물에 의해 상호 작용이 해결되는 합성 치명적인 상호 작용을 표시합니다. Synlet 상호 작용은 빨간색으로 표시되지만 약물 대상 링크는 회색 가장자리로 표시됩니다. 점선은 후기 난소암 임상 시험에서 다른 약물 조합에 의해 해결되는 합성 치명적인 상호 작용을 나타냅니다. 이러한 조사 약물 조합은별표(*)로표시되며, 각각 파클리나셀과 함께 각각 코티라닙과 올라파리브의 추가 조사 조합이 원(o)으로 표시되고 [25]에서적응된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

두 번째 연구에서 동일한 워크플로우를 사용하여 유방암의 맥락에서 166개의 합성 치명적인 유전자 쌍을 대상으로 하는 243개의 유망한 약물 조합을 확인했습니다. 우리는 실험적으로 2개의 유방암 세포주에서 세포 생존및 세포사멸에 그들의 충격에 관하여 선택된 약 조합을 시험했습니다. 특히, 제안된 저독성 약물 조합은 셀레콕시브와 졸레드로닉산의 결합지수에 의해 결정된 유방암 세포주에서 첨가제 효과를 넘어 세포독성을 보였다. 이 약 조합에 대한 생존력 및 아포토시스 의 결과는 도 2에표시된다.

Figure 2
그림 2: SKBR-3 세포의 생존력과 세포멸에 대한 셀레콕시브 및 졸드로닉 산의 영향. (A)SKBR-3 유방암 세포주에서 셀레콕시브(CEL), 졸드로닉산(ZOL) 및 졸레드로닉산과 셀레콕시브(ZOL + CEL)의 조합에 대한 생존성 분석 결과. 사용되는 낮고 높은 CEL 농도는 50μM 및 75μM이었다. 약물 조합은 세포 생존가능성에 상당한 시너지 효과를 보였습니다(** p < 0.001). (B, C) CEL, ZOL 및 약물 조합 ZOL + CEL으로 처리된 SKBR-3 세포의 부속서 V(ANXA5) 및 7-AAD 염색. 7-AADpos/ANXA5pos 세포의 백분율은 약물 조합 ZOL + CEL [24]로치료 후 증가하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

우리는 합성 치명적인 상호 작용에 영향을 미치는 약물 조합을 식별 하기 위해 워크 플로우를 설명 했습니다. 이 워크플로우는 모델 유기체로부터의 합성 치명적인 상호 작용에 대한 (i) 데이터, (ii) 인간 정형소의 정보, (iii) 약물 표적 협회에 대한 정보, (iv) 암의 맥락에서 임상 시험에 대한 약물 정보, 과학 문헌에서 추출된 약물 질환 및 유전자 질환 협회의 정보에 대한 (v)의 데이터를 사용합니다. 통합 된 정보는 합성 치명적인 유전자 쌍에 대한 조사 하에 주어진 약물 조합의 영향을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 통합된 데이터는 현재 암의 맥락에서 임상 시험에서 조사 또는 테스트 중인 일련의 약물을 평가하여 가장 관련성이 높은 합성 치명적인 상호 작용을 표적으로 하는 조합을 찾아서 종양 세포 생존에 영향을 미칠 확률이 높다. 마지막으로, 생성된 데이터는 종양 치료를 위해 처음 개발되지 않은 약물로 구성된 약물 조합을 선별하는 데 사용될 수 있으므로 전산 구동 약물 재배치 케이스에 대한 방법을 제공한다.

데이터 통합 워크플로우의 각 단계에 대해 전체 데이터 워크플로를 완료하기 위해 주요 데이터 원본을 제시하지만 추가 데이터 원본을 사용하여 다양한 단계에서 워크플로를 더욱 향상시킬 수 있다고 지적합니다. 워크플로우에서 BioGRID 데이터베이스18에서합성 치명적인 상호 작용 쌍을 추출했습니다. 우리는 특히 실험 유형 "합성 치사성"과 "부정적인 유전"의 상호 작용에 초점을 맞추지 했습니다. 합성 치명적인 상호 작용에 대한 BioGRID의 정보에는 예를 들어, DRYGIN 데이터베이스27에서사용할 수 있는 Costanzo 및동료(26)가발표한 데이터 세트와 과학 문헌의 개별 실험에 설명된 단일 합성 치명적인 상호 작용에 대한 데이터가 포함되어 있습니다. 예를 들어 SynLethDB28과같이 합성 치명적인 상호 작용을 수집하고 저장하는 추가 데이터 소스가 있습니다. 또한, 정형학 매핑의 수준에, 다른 도구와 데이터베이스의 큰 숫자가 존재한다. 우리는 Ensembl 바이오마트를 사용하여 모델 유기체에서 확인된 합성 치명적인 상호 작용 파트너를 해당 인간 정형 소에 매핑하는 방법을 제시합니다. 다른 조톨로지 데이터베이스 및 서비스는 NCBI의 호모로진데이터베이스(29),스위스 생물정보학 연구소의 OMA 교과데이터베이스(30)또는 스톡홀름 생물정보학센터(31)가관리하는 InParanoid 교정 그룹 데이터베이스를 포함한다. 워크플로우에서 우리는 효모에서 나오는 합성 치명적인 상호 작용의 가장 큰 숫자와 함께 여러 모델 유기체에서 합성 치명적인 상호 작용에 초점을 맞추었어요. 하나는 인간에 가까운 진화마우스와 쥐에서 데이터에 대한 orthology 매핑에 대한 입력 세트를 제한하는 것을 고려할 수 있습니다. 합성 치명적인 상호 작용의 입력 세트를 정의하는 추가 방법은 여러 종에서 보존되는 합성 치명적인 상호 작용에만 초점을 맞추는 것입니다, 따라서 합성 치명적인 상호 작용이 진정으로 긍정적 인 가능성을 증가. 이 다른 한편으로는 합성 치명적인 상호 작용의 집합을 극적으로 줄일 수 있습니다., 이미 S. cerevisiae와 S. pombe 사이 확인 된 합성 치명적인 상호 작용에 큰 차이. 또 다른 방법은 처음에 너무 엄격하지 않고 우리가 대표 결과 섹션에 나열된 두 연구에서했던 것처럼 기계 학습 알고리즘에 의해 실험 합성 치명적인 상호 작용의 집합을 확장하는 것입니다. 간단히 말해서, 임의의 숲 모형은 효모에 있는 아무 정형소 유전자가 존재하지 않는 인간 적인 유전자를 위한 합성 치명적인 상호 작용을 예측하기 위하여 이용되었습니다. 무작위 산림 모델은 이전에 설명된 바와 같이 경로 협회, 유전자 종양학 할당 뿐만 아니라 질병 및 약물 협회에 대한 데이터를 사용하여 효모및 직교 인간 유전자로부터합성 치명적인 상호작용 쌍의 집합에 대해 훈련되었다24,25. 이를 통해 통합 워크플로우에서 정형전성 매핑 정보가 제공되지 않는 인간 유전자를 고려할 수 있었습니다. 약물 대상 협회에 정보를 저장하는 데 널리 사용되는 데이터베이스는 워크플로우의 주요 상호 작용 원인인 DrugBank입니다. 약물 표적에 대한 어느 정도 보완적인 정보를 보유하는 다른 데이터베이스는 치료 대상 데이터베이스(TTD)32 또는 ChEMBL33이다. 난양기술대학교 연구원들이 개발한 이머젠텍과 SynLethDB의 e.Valuation 플랫폼에도 통합되어 있습니다. 그러나 2015년 SynLethDB의 마지막 업데이트는 각 웹 페이지28의다운로드 섹션에 저장된 데이터 집합을 기반으로 했습니다.

확인된 약물 조합과 표적 합성 치명적인 상호 작용 쌍을 평가하는 방법은 합성 치명적인 파트너 및 / 또는 문학 마이닝 방법을 통해 관심의 질병과 약물의 협회를 사용하는 것입니다. 난소암의 맥락에서 약물 조합의 평가에 대한 우리의 작업에서, 우리는 각 약물 조합의 두 합성 치명적인 인터배우 중 하나를 언급 난소암에 간행물의 수를 기반으로 새로운 제안 약물 조합을 선정. Pubmed내MeSH 음표는 주요 MeSH 분기 C. 식별된 간행물에서의 유전자에 대한 정보는다른곳에서 설명된 바와 같이 NCBI의 gene2pubmed 매핑 파일을 사용하여 추출될 수 있는 주요 MeSH 분기 C. 정보에서 주어진 정확한 질병 용어를 사용하여 특정 질병에 대한 간행물을 식별하는 데 사용될 수 있다. 또한, 비교 독성 물질 학 데이터베이스(35,DisGeNET36)또는 e.평가 소프트웨어 플랫폼과 같은 유전자 질환 및 / 또는 약물 질환 링크를 보유하는 전용 데이터베이스가 있습니다. 질병 협회에 근거를 둔 약 조합의 순위는 실험적인 시험을 위한 약 조합의 최종 선택을 지원하는 한 쪽입니다. 추가 적인 양상은 추가 시험을 위한 약 조합을 선택할 때 고려될 필요가 있습니다, 예를 들면 각각의 표적 기관에 있는 합성 치명적인 interactors의 약 또는 발현 상태와 같은 개별적인 독성 단면도.

대표적인 결과 섹션에서는, 유방암의 맥락에서 약물 조합을 규명하기 위해 워크플로우에 따라 확인된 셀레콕시브와 졸레드로닉산의 약물 조합에 대한 데이터를 제시한다. 이러한 특정 약물 조합은 두 화합물의 낮은 독성 프로파일로 인한 실험 테스트를 위해 선택되었다. 우리는 세포 생존력과 세포 세포에 대한 약물 조합의 영향을 평가하기 위해 체외 실험에서 다양한 농도를 사용했습니다. 이상적으로, 약물 농도 크게 두 약물을 결합 하 여 효능을 극대화 하는 동시에 부작용을 최소화 하는 개별 약물에 대 한 낮출 수 있습니다. 체외 검사에 사용되는 약물 농도가 생체 내 모델에서 도달하지 못하는 수프라테라피알(supratherapeutical)으로 비판될 수 있기 때문에 더 낮은 용량에서 생존가능성에 미치는 영향을 보는 것은 더욱 의미가 있습니다. 그러나, 농도는 문헌에서 이들 주어진 약물을 가진 세포 배양 실험에 기초하여 선택되었다. 약물 약 은 대부분의 화합물은 하나 이상의 약물 목표를 가지고 있기 때문에, 대상이 주로 영향을받는 것에 더 영향을 미칠 수 있습니다, 잠재적으로 알려진 알 수없는 다운 스트림 분자의 큰 세트에 영향을 미치는. 따라서 체외 세포 배양 시스템에서 세포 생존가능성에 대한 시너지 효과를 보여주는 약물 조합은 3D 또는 생체 내 모델에서 더 조사되어야 합니다.

요약, 우리는 평가하고 합성 치명적인 상호 작용을 대상으로 약물 조합을 제안하기 위해 다른 데이터 소스에서 정보를 통합 워크 플로플로를 제시한다. 현재까지, 합성 치명적인 상호 작용에 대한 가장 큰 정보는 여전히 모델 유기체에서 오고, 인간의 게놈에 필수 orthology 매핑 단계를 필요로. 인간 haploid 세포에 있는 첫번째 스크린은 인간 적인 세포에 있는 합성 치명적인 상호 작용의 확인으로 이끌어 냈습니다. 또한 CRISPR/CAS 기술은 세포 수준에서 합성 치명적인 상호 작용을 연구하는 새로운 방법을 열었습니다. 더 높은 품질의 생물학적 합성 치명적인 상호 작용 데이터가 제공됨에 따라 BRCA(1/2)/PARP1을 제외한 신규및 임상적으로 의미 있는 합성 치명적인 유전자 쌍을 발견함으로써 향후 임상 암 치료를 변화시킬 것을 제안합니다.

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Disclosures

AH와 PP는 대표 결과 섹션에 제시된 결과로 이어지는 분석을 수행할 때 emergentec 바이오 개발 GmbH의 직원이었습니다. MM과 MK는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgments

데이터 통합 워크플로우 개발을 위한 기금은 보조금 협정 인 nu에 따라 유럽 커뮤니티의 일곱 번째 프레임워크 프로그램에서 획득했습니다. 279113 (OCTIPS). 이 출판물 내의 데이터 적응은 공공 과학 출판 및 영향 저널, LLC에 의해 친절하게 승인되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioGRID n/a n/a thebiogrid.org
ClinicalTrials.gov n/a n/a ClinicalTrials.gov
DrugBank n/a n/a drugbank.ca
Ensembl BioMart n/a n/a ensembl.org
for alternative computational databases please refer to the manuscript
7-AAD ebioscience 00-6993-50
AnnexinV-APC BD Bioscience 550474
celecoxib Sigma-Aldrich PZ0008-25MG
CellTiter-Blue Viability Assay Promega G8080
FACS Canto II BD Bioscience n/a
fetal bovine serum Fisher Scientific/Gibco 16000044
FloJo Software FloJo LLC V10
McCoy's 5a Medium Modified Fisher Scientific/Gibco 16600082
penicillin G/streptomycin sulfate Fisher Scientific/Gibco 15140122
SKBR-3 cells American Type Culture Collection (ATCC) ATCC HTB-30
zoledronic acid Sigma-Aldrich SML0223-50MG
further materials or equipment will be made available upon request

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References

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