Summary
I ligandi a matrice extracellulare possono essere modellati su idrogel di poliacrilammide per consentire la coltura di cellule staminali embrionali umane in colonie confinate su substrati conformi. Questo metodo può essere combinato con la microscopia a forza di trazione e i saggi biochimici per esaminare l'interazione tra la geometria dei tessuti, le forze generate dalle cellule e le specifiche del destino.
Abstract
Le cellule staminali embrionali umane dimostrano una capacità unica di rispondere ai morfogeni in vitro mediante modelli auto-organizzanti di specifiche del destino cellulare che corrispondono alla formazione primaria dello strato germinale durante l'embriogenesi. Così, queste cellule rappresentano un potente strumento con cui esaminare i meccanismi che guidano il primo sviluppo umano. Abbiamo sviluppato un metodo per la coltura di cellule staminali embrionali umane in colonie confinate su substrati conformi che fornisce il controllo sia sulla geometria delle colonie che sul loro ambiente meccanico al fine di ricapitolare i parametri fisici che embriogenesi. La caratteristica chiave di questo metodo è la capacità di generare idrogel di poliacrilammide con modelli definiti di legamento matrice extracellulare in superficie per promuovere l'attaccamento cellulare. Ciò si ottiene fabbricando stencil con i motivi geometrici desiderati, utilizzando questi stencil per creare modelli di ligando a matrice extracellulare su coperchi di vetro, e trasferendo questi modelli agli idrogel poliacrilamiti durante la polimerizzazione. Questo metodo è anche compatibile con la microscopia a forza di trazione, consentendo all'utente di misurare e mappare la distribuzione delle forze generate dalle cellule all'interno delle colonie confinate. In combinazione con i saggi biochimici standard, queste misurazioni possono essere utilizzate per esaminare il ruolo dei segnali meccanici nelle specifiche del destino e nella morfogenesi durante lo sviluppo umano precoce.
Introduction
Le cellule staminali embrionali umane (HESC) sono molto promettenti per l'uso nella medicina rigenerativa e nelle applicazioni di ingegneria tissutale. La natura pluripotente di queste cellule dà loro la capacità di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula adulta. Mentre sono stati fatti grandi passi avanti nel dirigere il destino degli hESC verso particolari tipi di cellule, è rimasto molto difficile generare tessuti interi o organi de novo1,2,3,4, 5. Ciò è dovuto, in gran parte, ad una comprensione limitata dei meccanismi che guidano la formazione di questi tessuti durante lo sviluppo umano. Al fine di colmare questa lacuna nella conoscenza, negli ultimi anni sono emersi diversi metodi per modellare l'embrione precoce e le successive fasi di sviluppo con cellule staminali embrionali6,7,8,9 ,10,11,12,13.
Poco dopo la derivazione delle prime linee hESC14, è stato dimostrato che i corpi embrionali formati da hESC erano in grado di produrre spontaneamente cellule dei tre strati germinali primari6. Tuttavia, a causa della mancanza intrinseca di controllo sulle dimensioni e la morfologia dei corpi embrionali, l'organizzazione degli strati germinali variava in modo significativo e non corrispondeva all'organizzazione dell'embrione precoce. Più recentemente, Warmflash ealtri ha sviluppato un metodo per confinare colonie di hESC su substrati di vetro tramite micropatterning, fornendo controllo e coerenza sulle dimensioni e la geometria delle colonie8. In presenza di BMP4, un importante morfogeno nello sviluppo iniziale, queste colonie confinate erano in grado di auto-organizzare modelli riproducibili di specificazione per i destini che rappresentano gli strati germinali primari. Anche se questo ha fornito un modello utile per studiare i meccanismi con cui vengono stabiliti gli strati germinali primari, i modelli di specifica del destino non corrispondevano esattamente all'organizzazione e alla morfogenesi osservate durante l'embriogenesi15. Una ricapitolazione più fedele dello sviluppo embrionale precoce è stata ottenuta incorporando hESC in una matrice extracellulare tridimensionale (ECM) di matrigel11, fornendo la prova più forte fino ad oggi per la capacità degli hESC di auto-organizzarsi e modellare primi stadi dell'embriogenesi ex vivo. Tuttavia, questo metodo produce risultati incoerenti ed è quindi incompatibile con una serie di saggi che potrebbero essere utilizzati per rivelare i meccanismi sottostanti di auto-organizzazione e specifica del destino.
Dati questi metodi esistenti e le rispettive limitazioni, abbiamo cercato di sviluppare un metodo per la coltura riproducibil di hESC colonie di geometrie definite in condizioni che modellano l'ambiente extracellulare del primo embrione. Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo usato idrogel di poliacrilammide di elasticità regolabile per controllare le proprietà meccaniche del substrato. Utilizzando la microscopia a forza atomica sugli embrioni di pollo in stadio di gasastrulation, abbiamo scoperto che l'elasticità dell'epiblasto variava da centinaia di pascal a pochi chilodi. Così, ci siamo concentrati sulla generazione di idrogel di poliacrilammide con elasticità in questa gamma per servire come substrato per le colonie hESC. Abbiamo modificato i nostri metodi precedenti per la coltura di hESC su idrogel poliacrilammide7,9 per fornire un controllo robusto sulla geometria delle colonie. Abbiamo ottenuto questo modellando i ligandi ECM, vale a dire matrigel, su coperture in vetro attraverso stencil microfabbricati, come precedentemente riportato16. Abbiamo quindi progettato una nuova tecnica per trasferire il ligando modellato sulla superficie degli idrogel di poliacrilammide durante la polimerizzazione. Il metodo che qui descriviamo prevede l'utilizzo della fotolitografia per fabbricare un wafer di silicio con i motivi geometrici desiderati, creando timbri di tesi geometriche con polidimetilsiloxane (PDMS), e utilizzando questi francobolli per generare gli stencil che consentire infine la modellata del ligando sulla superficie di vetro coverslips e il trasferimento alla poliacrilammide.
Oltre a riassumere l'ambiente meccanico dell'embrione precoce, confinare le colonie di hESC sulla poliacrilammide consente la misurazione delle forze generate dalle cellule con la microscopia della forza di trazione (TFM), come riportato nel nostro metodo precedente9. In breve, le perle fluorescenti possono essere incorporate nella poliacrilammide e utilizzate come marcatori fiduciari. Le forze generate dalle cellule sono calcolate mediante l'imaging dello spostamento di queste perline dopo la semina di hESC sul substrato modellato. Inoltre, le mappe delle forze di trazione risultanti possono essere combinate con i saggi tradizionali, come l'immunostaining, per esaminare come la distribuzione delle forze generate dalle cellule nelle colonie hESC confinate possa regolare o modulare la segnalazione a valle. Ci aspettiamo che questi metodi rivelino che le forze meccaniche svolgono un ruolo critico nella modellina delle specifiche del destino cellulare durante lo sviluppo embrionale precoce che è attualmente trascurato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutti i metodi qui descritti relativi all'uso di hESC sono stati approvati dal comitato di ricerca sulle cellule staminali umane (GESCR) presso l'Università della California a San Francisco.
1. Preparazione del wafer di silicio con caratteristiche geometriche
- Creare una fotomaschera con le entità geometriche desiderate. Utilizzare software di disegno assistito da computer per progettare le funzionalità. Per l'uso con il fotoresist negativo, rendete trasparenti le funzioni opache e il resto della maschera.
NOTA: per la ripetizione su tratti di 18 mm di diametro, raggruppare le funzioni per ogni condizione sperimentale in aree 10 x 10 mm per garantire che gli stencil generati nel passaggio 3 si adattino ai coperchi. - Girare il cappotto fotoresist negativo su un wafer di silicio da 100 mm. Utilizzare la scheda dati fotoresist per determinare la velocità e la lunghezza di rotazione per generare uno spessore della pellicola di 100-250 m.
NOTA: Lo spessore della pellicola deve essere regolato in modo che le proporzioni della larghezza dei modelli all'altezza dello stencil siano il più vicino possibile a 1:1. Tuttavia, si consiglia uno spessore minimo di 100 m, poiché meno produce stencil delicati che si strappano facilmente. - Elaborare la fotoresist in base alla scheda dati del prodotto. Questo comporta in genere una cottura morbida, esposizione ai raggi UV con fotomaschera in un aligner maschera, post-esposizione cuocere, sviluppo, e duro cuocere. Ad esempio, la procedura utilizzata per elaborare i wafer utilizzati in questo protocollo è descritta nella tabella 1.
NOTA: Prestare attenzione quando si maneggiano wafer di silicio in quanto sono fragili. Una volta generati, i wafer possono essere utilizzati ripetutamente, purché non siano danneggiati.
2. Preparazione di copricoperture
-
Preparazione di coverlip "top" lavati con acido
- Posizionare 18 mm di diametro #1 copertura spessorein una parabola Petri di vetro. Il numero appropriato di coverlips dipende dalle dimensioni del piatto. Per un piatto da 100 mm, preparare 50-100 coverlips alla volta. Le quantità di volume fornite durante il resto di questa sezione corrispondono a un piatto da 100 mm.
- Aggiungere 20 mL di 1 M HCl al piatto Petri e scuotere delicatamente il piatto per disperdere i copricoproe. Assicurarsi che tutti i copricopertine siano sommersi e rilasciare bolle d'aria tra i copricopertine. Incubare pernottamento a temperatura ambiente con agitazione delicata.
AVVISO: HCl è acido e corrosivo. Prestare attenzione e indossare un PPE appropriato mentre si lavora con HCl. - Decant HCl dal piatto. Aggiungere 20 mL di acqua ultrapura e lavare con agitazione delicata per 10 min. Scartare l'acqua e ripetere per un totale di cinque lavaggi.
- Dopo aver scartato il lavaggio finale, aggiungere 20 mL di 100% etanolo al piatto. Utilizzando pinze, rimuovere i copricoperture singolarmente e disporre tra due pezzi di carta da filtro per asciugare.
- Conservare i coperchi secchi in un contenitore sigillato. I coperchi lavati acidi possono essere preparati in anticipo e conservati per un mese o più in condizioni di assenza di polvere.
-
Preparazione di coverlips "bottom" attivati dalla glutaraldeide
NOTA: fare riferimento ai metodi precedenti per ulteriori dettagli7,9.- Posizionare 18 mm di diametro #1 coperture di spessorein un piatto Petri.
- Aggiungere 20 mL di 0,2 m di HCl alla piastra di Petri e scuotere delicatamente il piatto per disperdere i coprilabbra. Assicurarsi che tutti i copricopertine siano sommersi e rilasciare bolle d'aria tra i copricopertine. Incubare pernottamento a temperatura ambiente con agitazione delicata.
- Decant HCl dal piatto. Aggiungere 20 mL di acqua ultrapura e lavare con agitazione delicata per 10 min. Scartare l'acqua e ripetere per un totale di cinque lavaggi.
- Dopo aver scartato il lavaggio finale, aggiungere 20 mL di 0,1 M NaOH e agitare delicatamente per disperdere e sommergere i coverlip. Incubare a temperatura ambiente con agitazione delicata per 1 h.
- Decant NaOH dal piatto. Aggiungere 20 mL di acqua ultrapura e lavare con agitazione delicata per 10 min. Scartare l'acqua e ripetere per un totale di cinque lavaggi.
- Dopo aver scartato il lavaggio finale, aggiungere 20 mL di una diluizione di 1:200 di 3-aminopropyltrimethoxysilane in acqua ultrapura e agitare delicatamente per disperdere e sommergere i coperchi. Incubare a temperatura ambiente con agitazione delicata per 1 h o durante la notte.
AVVISO: 3-aminopropyltrimethoxysilane è infiammabile e può causare irritazione della pelle. Maneggiare con cura, indossare un PPP appropriato e scartare i rifiuti secondo le normative locali di smaltimento. - Decant la soluzione diluita 3-aminopropyltrimethoxysilane dal piatto. Aggiungere 20 mL di acqua ultrapura e lavare con agitazione delicata per 10 min. Scartare l'acqua e ripetere per un totale di almeno cinque lavaggi. È fondamentale rimuovere tutti i 3-aminopropyltrimethoxysilane prima di procedere.
- Dopo aver scartato il lavaggio finale, aggiungere 20 mL di una diluizione di 1:140 di glutaraldeide 70% nel fosfato tamponato salina (PBS) e agitare delicatamente per disperdere e sommergere i coperchi. Incubare a temperatura ambiente con agitazione delicata per 1 h o durante la notte.
AVVISO: il 70% di glutaraldeide è tossico e può causare irritazione cutanea. Maneggiare con cura, indossare un PPP appropriato e scartare i rifiuti secondo le normative locali di smaltimento. - Decant la soluzione diluita glutaraldeide dal piatto. Aggiungere 20 mL di acqua ultrapura e lavare con agitazione delicata per 10 min. Scartare l'acqua e ripetere per un totale di cinque lavaggi.
- Dopo aver scartato il lavaggio finale, aggiungere 20 mL di 100% etanolo. Utilizzando pinze, rimuovere i copricoperture singolarmente e disporre tra due pezzi di carta da filtro per asciugare.
- Conservare i coperchi secchi in un contenitore sigillato. I coperchi attivati dalla glutaraldeide possono essere preparati in anticipo e conservati per un massimo di sei mesi.
3. Generazione di stencil per la modellazione del ligando ECM
- Generazione di stampi intermedi poliditilsiloxane (PDMS)
- Mescolare la base PDMS con l'agente di polimerità PDMS a un rapporto 10:1, in base al peso. Mescolare accuratamente.
NOTA: Per l'applicazione iniziale di PDMS, preparare circa 100 g di PDMS per riempire un piatto da 100 mm. Per le applicazioni successive, rimuovere PDMS solo dal centro del piatto in cui si trovano le caratteristiche wafer di silicio e preparare 20-30 g di nuovo PDMS. - Degas la miscela PDMS in un desiccatore per 30-60 min o fino a quando tutte le bolle d'aria vengono rimosse.
- Collocare il wafer di silicio modificato dal punto 1 in un piatto di plastica da 100 mm. Versare lentamente e uniformemente la miscela PDMS sulla superficie del wafer. Toccare il piatto sulla superficie di lavoro per rilasciare eventuali bolle d'aria dalla superficie del wafer.
- Degas la miscela PDMS versato sopra il wafer per 10 min o fino a quando tutte le bolle d'aria vengono rimossi o sono venuti alla superficie del PDMS.
- Cuocere il PDMS a 70 gradi centigradi per 2 h. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente.
- Utilizzando un bisturi o una taglierina, ritagliare la sezione di PDMS dal centro del piatto che contiene le caratteristiche geometriche.
- Tagliare il PDMS in circa 10 x 10 mm quadrati, ciascuno contenente le caratteristiche per una singola condizione sperimentale. Questi sono indicati come "timbri" nei passaggi successivi del protocollo.
- Mescolare la base PDMS con l'agente di polimerità PDMS a un rapporto 10:1, in base al peso. Mescolare accuratamente.
- Generazione di lastre piatte di PDMS
- Mescolare la base PDMS con l'agente di polimerità PDMS con un rapporto 8:1, in base al peso. Preparare circa 20 g per ogni piatto da 100 mm da utilizzare. Mescolare accuratamente.
- Degas la miscela PDMS in un desiccatore per 30-60 min o fino a quando tutte le bolle d'aria vengono rimosse.
- Versare lentamente e uniformemente il PDMS in un piatto pulito da 100 mm. Toccare il piatto sulla superficie di lavoro per rilasciare eventuali bolle d'aria.
- Cuocere il PDMS a 70 gradi centigradi per 2 h. Lasciare raffreddare a temperatura ambiente.
- Rimuovere il PDMS dal piatto. Invertire in modo che la superficie del PDMS che era in contatto con il fondo del piatto sia rivolta verso l'alto.
- Per ogni timbro generato nel passaggio 3.1, tagliare un quadrato di 15 x 15 mm di PDMS. Queste sono definite "lastre piatte" nelle fasi successive del protocollo.
- Generazione di stencil
- Disporre lastre piatte di PDMS sul coperchio di un piatto da 150 mm o di un'altra superficie piana per una maneggevolezza più semplice. Garantire una spaziatura sufficiente tra le lastre (ad esempio, per un piatto da 150 mm, disporre nove lastre piatte con spaziatura uniforme).
- Invertire ogni timbro generato nel passaggio 3.1 su una lastra piatta di PDMS, in modo che le caratteristiche del timbro siano in contatto con la lastra piatta di PDMS. Premere delicatamente sulla parte superiore del timbro con pinze per garantire un contatto uniforme.
- Sostenere con attenzione le coppie timbro/lastra PDMS sulla base del piatto, in modo che il coperchio poggia ad angolo. Questo aiuta il wicking del polimero UV-curable nella fase successiva.
- Posizionare una piccola goccia di polimero UV-curable nell'interfaccia superiore di ogni coppia timbro/soletta. Il polimero sarà malvagio tra i due dalla tensione superficiale, assistito dalla gravità.
NOTA: Molti polimeri UV-curable diversi possono funzionare in questo protocollo. Abbiamo selezionato Norland Optical Adhesive 74 per le seguenti proprietà: i) polizzatura rapida sull'esposizione alla luce UV, ii) Facile rimozione dai francobolli PDMS dopo la polimerità, iii) Robusta adesione ai coperchi di vetro con pressione manuale. - Una volta che il polimero è stato completamente malvagio attraverso, posizionare il coperchio con le coppie timbro / lastra piatta sulla superficie di lavoro. Posizionare una piccola goccia di polimero UV-curable su ciascuno dei restanti tre lati di ogni interfaccia timbro/lastre.
- Utilizzando una punta di pipetta da 200 l,l, collegare le gocce di polimero intorno ai bordi dell'interfaccia timbro/lastre. Questo crea un bordo che manterrà la soluzione di ligando nel passaggio 4.
NOTA: Fare attenzione quando si lavora il polimero intorno ai bordi del timbro. Se l'interfaccia timbro/soletta viene interrotta, il polimero si blocca sotto le caratteristiche e lo stencil non si formerà correttamente. - Posizionare con cura le coppie timbro/lastra in una scatola di sterilizzazione UV. Utilizzare l'impostazione di alimentazione sterile "Str" ed esporre per 10 min.
- Rimuovere le coppie timbro/lastra dalla scatola di sterilizzazione UV. Utilizzando due coppie di pinze, rimuovere delicatamente il timbro PDMS tenendo premuto la lastra piatta e lo stencil che si formava dal polimero UV-curable.
- Utilizzando le pinze, rimuovere con attenzione lo stencil e invertirlo in modo che la superficie che era in contatto con la lastra piatta di PDMS sia rivolta verso l'alto.
NOTA: gli stencil sono delicati. Fare attenzione durante la consegna, soprattutto durante la rimozione iniziale dal PDMS, in modo che non si strappino. - Riportare gli stencil invertiti in una scatola di sterilizzazione UV. Utilizzare l'impostazione di alimentazione sterile "Str" ed esporre per 3 min.
4. Modellazione ligando ECM su copricopre
-
Pressione di stencil su coverlip lavati acidi
- Posizionare uno scivolo di copertura lavato acidi per ogni stencil su un pezzo pulito di pellicola da laboratorio.
- Utilizzando pinze, posizionare con cura ogni stencil, flat-side-down, su una coverslip acid-washed. Posizionare in modo che le funzioni siano centrate sul coperchio.
- Posizionare un piccolo pezzo di pellicola da laboratorio sopra ogni stencil. Premere saldamente e uniformemente verso il basso sullo stencil per creare un forte contatto tra lo stencil e la coverslip.
NOTA: Questo è un passo fondamentale! Premere con fermezza e su tutta la superficie dello stencil. Se non viene creato un contatto sufficiente, la soluzione di ligando perderà tra lo stencil e i trattiri e la modelliera avrà esito negativo. FACOLTATIVO: Per confermare un contatto sufficiente tra lo stencil e la coverslip, pipette 100 -L di acqua sterile ultrapura sulla superficie di ogni stencil e incubare a temperatura ambiente. Dopo 1 h, verificare la presenza di perdite. Aspirare l'acqua da stencil con successo incollati e procedere.
-
Pulizia al plasma della superficie dei coperchi stencil per aumentare l'idrofilia
- Posizionare i copricopertine con stencil in un detergente al plasma. Applicare plasma ad alta potenza per 30 s.
-
Preparazione della soluzione di ligando ECM
NOTA: Tutti i passaggi successivi devono essere completati in condizioni sterili, se possibile.- Mettere sulla ghiaccio una soluzione sterile da 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8.0. Una volta ghiacciato, aggiungere il matrigel e il collagene per ottenere concentrazioni rispettivamente di 225 g/mL e 25 g/mL. OPTIONAL: Per la risoluzione dei problemi o per la visualizzazione del ligando, includere un ligando con tag fluorescente nella soluzione di ligando.
- NOTA: con questo metodo è possibile utilizzare diversi ligandi ECM. Per i diversi ligandi, può essere necessaria un'ottimizzazione aggiuntiva per determinare la concentrazione ideale, il tempo di incubazione e la temperatura di incubazione. Per ulteriori informazioni, vedere la sezione Discussione.
- Pipette la soluzione di ligando sulla superficie di ogni stencil. Per gli stencil realizzati con timbri quadrati da 10 x 10 mm, applicare 100 L per stencil.
- Controllare le bolle d'aria nelle funzioni di stencil. Se necessario, utilizzare pinze a punta fine o una punta di pipetta da 2 luna per rimuovere le bolle d'aria dalle funzioni.
NOTA: Questo è un passo fondamentale! Se le bolle d'aria rimangono intrappolate sulla superficie della coverslip, il ligando non adsorberà alla superficie e il modello risultante sarà incompleto. - Posizionare i coperchi stencil con ligando in un piatto, avvolgere con pellicola da laboratorio, e incubare a 4 gradi durante la notte.
- Mettere sulla ghiaccio una soluzione sterile da 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8.0. Una volta ghiacciato, aggiungere il matrigel e il collagene per ottenere concentrazioni rispettivamente di 225 g/mL e 25 g/mL. OPTIONAL: Per la risoluzione dei problemi o per la visualizzazione del ligando, includere un ligando con tag fluorescente nella soluzione di ligando.
5. Trasferimento di ligando al gel poliacrilammide
- Rimozione della soluzione di ligando e dello stencil da ogni coverslip
- Aspirare la soluzione di ligando dalla superficie di uno stencil. La soluzione Ligand può essere raccolta e immagazzinata a 4 gradi centigradi e riutilizzata per un massimo di un mese.
- Utilizzando pinze, immergere brevemente il coperchio con stencil in un piatto contenente PBS sterile da lavare.
- In breve tempo immergere il coperchio con stencil in un secondo piatto di PBS sterile per lavare.
- Rimuovere lo stencil dalla superficie dello scivolo. Fare attenzione a non rompere il coverslip.
- Immergi brevemente il coperchio in un piatto contenente acqua sterile ultrapura per rimuovere i sali dai lavatori PBS. Toccare il bordo della coverslip per un compito delicato pulire per spazzare via l'acqua in eccesso.
- Asciugare il coperchio sotto un gas inerte, come l'azoto. Contrassegnare la parte inferiore della coverslip per tenere traccia dell'orientamento da questo punto in avanti. Fare attenzione a mantenere il lato modellato rivolto verso l'alto.
- Ripetere i passaggi da 5.1.1 a 5.1.6 per ogni copertina stampata.
- Realizzazione di idrogel di poliacrilammide con coperchi a motivi geometrici
NOTA: Fare riferimento ai metodi precedenti per ulteriori dettagli7,9 Sterilizzare tutti i portatappo, tubi e distanziali utilizzati per fare gel poliacrilammide lavando con 10% candeggina durante la notte, risciacquo con acqua almeno cinque volte per rimuovere la candeggina, e lavando brevemente nel 70% di etanolo. Mettere tutti i pezzi su salviette compito delicato in un armadio di biosicurezza sterile per asciugare prima dell'uso.- Preparare la soluzione poliacrilammide per ottenere l'elasticità dell'idrogel desiderata (Tabella 2). Mescolare tutti i componenti ad eccezione delle microsfere fluorescenti e del persulfato di potassio (PPS).
NOTA: Preparare ogni volta una soluzione persovolta all'1% di potassio fresco. - Degas la soluzione di poliacrilammide, microsfere e PPS in tubi separati sotto vuoto per 30 min.
- Per ogni coverslip a motivi geometrici, preparare una coverslip "bottom" attivata con glutaraldeide con un distanziale (18 mm di diametro esterno, 14 mm di diametro interno) posto sulla parte superiore.
- Dopo il degassamento, sonicare brevemente le microsfere e aggiungere il volume appropriato alla soluzione di poliacrilammide. Mescolare pipetting su e giù, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria. Sonicare brevemente.
- Aggiungere il volume appropriato di SPA alla soluzione di poliacrilammide. Pipette su e giù per mescolare la soluzione, facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria.
NOTA: Dopo aver aggiunto PPS, lavorare rapidamente per completare i passaggi da 5.2.6 a 5.2.11 prima che la poliacrilammide venga polimerizzata. - Pipetta 75-150L (a seconda dello spessore del distanziale) al centro di ogni coverslip attivato dalla glutaraldeide.
- Utilizzando pinze, posizionare un coperchio a motivi geometrici su ogni coverslip attivato dalla glutaraldeide con poliacrilammide e distanziale, in modo che il ligando modellato si trovi di fronte alla soluzione poliacritilmide. Se è stata aggiunta una soluzione di poliacrilammide sufficiente, la tensione superficiale insidia la poliacrilammide tra i due copricapi e non saranno presenti bolle d'aria.
- Raccogliere ogni "sandwich" poliacrilammide e toccare con attenzione il lato per una delicata pulizia compito per evitare la soluzione poliacrilammide in eccesso.
- Posizionare con cura ogni "sandwich" poliacrilamide in un portatappo con fili compatibili con tubi conicali da 15 mL. L'orientamento dovrebbe essere tale che il fondo della ghiarfine a forma di glutaraldeide è in contatto con il fondo del supporto del tappo, e il coperchio modellato è in cima.
- Avvitare un tubo conico-basso da 15 mL in ogni porta tappo per tenere in posizione i "panini" di poliacrilammide. I tubi dovrebbero essere stretti per evitare perdite, ma attenzione a non stringere eccessivamente e rompere i copricopro.
- Centrifugare i "sandwich" poliacrilamiti nei tubi in altalena a 200 x g per 10 min a temperatura ambiente. Rimuovere i tubi dalla centrifuga e metterli in rack tubo per mantenere l'orientamento per un ulteriore 50 min per garantire la piena polimerizzazione. Tenere coperto di pellicola per evitare lo sbiancamento delle microsfere fluorescenti.
NOTA: la centrifugazione è fondamentale quando si utilizza questo metodo per eseguire la TFM. La forza centrifuga sposta tutte le microsfere su un unico piano, che alla fine sarà appena sotto la superficie dell'idrogel. Questo è l'ideale per l'imaging di spostamenti della microsfera che vengono utilizzati per calcolare le sollecitazioni di trazione generate dalla cellula. Se non esegue La TFM, le microsfere possono essere lasciate fuori dalla soluzione di poliacrilammide e la polimerizzazione può verificarsi in cima senza centrifugazione. - Rimuovere i "sandwich" poliacriti polimerizzati dai tubi e immergersi in PBS in un piatto da 100 mm. Avvolgere in pellicola da laboratorio e incubare per 3 h a temperatura ambiente o pernottamento a 4 gradi centigradi.
- Preparare la soluzione poliacrilammide per ottenere l'elasticità dell'idrogel desiderata (Tabella 2). Mescolare tutti i componenti ad eccezione delle microsfere fluorescenti e del persulfato di potassio (PPS).
- Preparazione di gel modellati per le cellule di semina
- Utilizzare un bisturi e pinze per rimuovere con attenzione il coverslip a motivi geometrici e il distanziale dal "sandwich" poliamcrita mentre rimane immerso nella PBS. Il ligando modellato sarà trasferito alla poliacrilammide durante la polimerizzazione e rimarrà dopo aver rimosso il coperchio. Il gel di poliacrilammide rimarrà attaccato al coperchio attivato dalla glutaraldeide.
NOTA: Questo è un passo fondamentale! La poliacrilammide deve essere sommersa in PBS mentre si rimuove il coperchio o i modelli di ligando saranno distrutti. - Posizionare ogni coverslip con poliacrilammide a motivi geometrici in un supporto per tappo. Posizionare una guarnizione (18 mm di diametro esterno, 14 mm di diametro interno) sopra il coperchio e intorno alla poliacrilammide, dove si trovava il distanziale. Avvitare un tubo a fondo conico segato da 15 mm nel supporto del tappo, formando un pozzo con la poliacrilammide modellata nella parte inferiore. Questi assiemi si inseriscono nei pozze di una piastra standard da 12 pozze per una facile maneggevolezza.
- Lavare ogni gel aggiungendo 500 luna di PBS all'assemblaggio del pozzo. Incubare per 10 min a temperatura ambiente con agitazione delicata. Rimuovere PBS e ripetere due volte per un totale di tre lavamenti.
- Dopo il lavaggio finale del PBS, aggiungere 500 -L di supporto knockout-DMEM ai gel e incubare a 37 gradi durante la notte. I gel possono essere tenuti a 37 gradi centigradi con supporti per un massimo di 5 giorni prima di seminare le cellule.
- Il giorno prima della semina delle cellule, sostituire il knockout-DMEM per i supporti KSR completi e incubare a 37 gradi centigradi durante la notte.
- Utilizzare un bisturi e pinze per rimuovere con attenzione il coverslip a motivi geometrici e il distanziale dal "sandwich" poliamcrita mentre rimane immerso nella PBS. Il ligando modellato sarà trasferito alla poliacrilammide durante la polimerizzazione e rimarrà dopo aver rimosso il coperchio. Il gel di poliacrilammide rimarrà attaccato al coperchio attivato dalla glutaraldeide.
6. Coltura di hESC su gel a motivi geometrici
NOTA: Se si pianifica la correzione di campioni per l'immunostaining dopo la TFM, scattare immagini di posizioni di microsfera non accentate prima di seminare le cellule. In questo caso, il ligando marcato fluorescente deve essere utilizzato nel passaggio 4.3.1 in modo che le posizioni eventuali delle cellule siano conosciute prima che la semina e le microsfere possano essere imagete in tali regioni.
- Mantenere le colture stock hESC e le colture secondarie prive di alimentatore preparate su piastre rivestite di matrigel in supporti KSR condizionati prima della seeding su gel di poliacrilammide modellati come descritto in precedenza9.
NOTA: Generare supporti KSR condizionati colticce fibroblasti embrionali di topo irradiati in supporti KSR integrati con 4 fattore di crescita del fibroblasto di base ng/mL (bFGF). Raccogliere e sostituire i supporti ogni 24 ore. - Aspirati i media da hESC. Lavare brevemente con supporti knockout-DMEM. Aggiungere lo 0,05% di tripsina-EDTA integrato con 10 s S Y27632 (inibitore della chinasi di Rho) e incubare a 37 gradi centigradi per 5-10 min.
- Aggiungere supporti con siero per inibire la trypsin. Aspirare delicatamente i supporti e la pipetta sul piatto per rimuovere le cellule. Continuare a pipettare delicatamente per rimuovere tutte le cellule e dissociare gli ammassi di cellule a singole celle.
- Raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare a 200 x g per 3 min.
- Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in un volume equivalente di supporti KSR per lavare. Centrifuga a 200 x g per 3 min.
- Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in supporti KSR condizionati integrati con 10 ng/mL bFGF e 10 Y27632.
- Contare le cellule con un emocitometro e regolare la sospensione cellulare ad una concentrazione di 300.000 cellule per mL. Pipette 500 -L della sospensione cellulare su ogni gel a motivi geometrici (150.000 cellule per gel).
- 3 h dopo la seeding, utilizzare una pipetta per aspirare con attenzione il supporto da ogni gel e sostituire con supporti KSR con condizioni fresche integrati con 10 ng/mL bFGF e 10 Y27632. Questo rimuove le cellule in eccesso che non hanno aderito alle regioni modellate della poliacrilammide.
NOTA: Questo è un passo fondamentale! In questa fase le cellule saranno vagamente aderenti al ligando modellato. Fare molta attenzione quando si scambiano supporti per non staccare le cellule. La parità di attenzione dovrebbe essere presa con ciascuno degli scambi di media nelle fasi successive. - 24 h dopo la seeding, utilizzare una pipetta per aspirare con attenzione il supporto e lo scambio di supporti KSR condizionati integrati con 10 ng/mL bFGF e 5 Y27632.
- 48 h dopo la seeding, utilizzare una pipetta per aspirare con attenzione il supporto e lo scambio di supporti KSR condizionati integrati con 10 ng/mL bFGF. Questo rimuove l'inibitore della chinasi Rho dai media e gli esperimenti possono iniziare il giorno successivo, 72 h dopo la seeding.
7. Esecuzione di TFM
- Se lo si desidera, eseguire il TFM come descritto in precedenza9 nelle condizioni sperimentali desiderate.
- Se le posizioni della microsfera non in difficoltà sono state imagete prima della semina delle cellule, fissare le cellule dopo aver assunto posizioni della microsfera stressata ed eseguire l'immunostaining per determinare la localizzazione delle proteine di interesse rispetto alle regioni di forze ad alta e bassa trazione.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La sfida principale da superare nel tentativo di coltura hESC in colonie di geometria controllata su substrati conformi è quello di generare un modello omogeneo di ECM-ligand ondoso sulla superficie del substrato. La strategia presentata in questo metodo prevede prima la generazione del modello desiderato sulla superficie di un vetrino e successivamente il trasferimento di tale modello sulla superficie di un idrogel di policrilmide durante la polimerizzazione del gel (Figura 1 RPertanto, è importante assicurarsi che il modello desiderato venga creato con successo sulla superficie della vetrina di vetro prima di procedere alla polimerizzazione dell'idrogel e al trasferimento del modello (Figura 1B). Sulla base dell'imaging di modelli di ligando fluorescente trasferiti in poliacrilammide, il ligando sembra essere presente solo in un singolo piano sulla superficie della poliacrilammide, anche se non abbiamo caratterizzato con precisione lo spessore di questo strato. Ci sono due tipi comuni di difetti osservati dopo la generazione del modello sulla vetrina di vetro, ognuno con la propria fonte di errore. Il primo è la comparsa di ligando fluorescente che si estende oltre i margini del modello desiderato (Figura 1C, in alto), che deriva da perdite della soluzione di ligando fluorescente a causa di una piccola lacerazione nello stencil o insufficiente sigillazione del stencil al coperchio di vetro. Il secondo è l'aspetto di un modello incompleto (Figura 1C, fondo), che è in genere dovuto a una bolla d'aria intrappolata nell'interfaccia coverslip che impedisce l'assorbimento del ligando fluorescente.
La misura finale del successo per questo metodo è la capacità di coltura hESCs nelle geometrie desiderate sugli idrogel modellati (Figura 2). Per raggiungere questo obiettivo, gli HESC vengono seminati ad una densità relativamente elevata (300.000 cellule/mL) in presenza di un inibitore della chinasi del Rho (Y27632) e incubati per 3 h per facilitare l'adesione ai modelli di ligando. I supporti vengono quindi sostituiti per rimuovere le cellule non aderenti. Nel corso di 72 h, la Y27632 viene gradualmente diluita dai media da una serie di scambi mediatici a 24 e 48 h post-seeding. Tipicamente, gli hESC proliferano per completare le geometrie modellate di 48-72 h, in modo che gli esperimenti possano iniziare a 72 h post-seeding, una volta che il Y27632 è completamente rimosso dal supporto.
La coltura di colonie hESC in geometrie confinate su idrogel di poliacrilofe permette la misurazione delle forze di trazione generate dalle cellule utilizzando TFM. Queste misurazioni vengono effettuate incorporando microsfere fluorescenti nell'idrogel e immaginando le posizioni di queste perle prima e dopo la seeding di hESC (Figura 3A). Lo spostamento delle perline che segue la semina cellulare è una funzione delle forze generate dalle cellule e l'elasticità dell'idrogel, quindi le immagini delle posizioni del tallone possono essere utilizzate per generare mappe di spostamenti di perline e successivamente utilizzati per calcolare il sottostante sollecitazioni di trazione. Nelle colonie circolari di hESC, le più grandi sollecitazioni di trazione si trovano vicino al bordo periferico delle colonie, mentre il centro delle colonie mostra sollecitazioni di trazione uniformemente basse (Figura 3B). È interessante notare che le più alte sollecitazioni di trazione si trovano negli ammassi vicino al bordo delle colonie, piuttosto che formare un anello continuo di massima sollecitazione. Ciò implica che, sebbene la geometria delle colonia svolga un ruolo chiave nel determinare la distribuzione delle sollecitazioni di trazione, una regolazione e un feedback più localizzati determinano le posizioni precise della massima sollecitazione. Inoltre, finché l'immagine delle posizioni della microsfera senza cellule aderenti viene presa prima della semina cellulare, le colonie hESC possono essere fissate per l'immunostaining delle proteine di interesse dopo le misurazioni della forza di trazione. Nonostante le distribuzioni non uniformi osservate delle sollecitazioni di trazione, gli HESC coltivati come cerchi modellati in condizioni di manutenzione mostrano un'espressione uniforme del marcatore di pluripotenza Oct3/4 e della molecola di adesione cellulare E-cadherin(Figura 3C ).
Il metodo presentato per l'utilizzo di stencil per generare modelli di ligando è dimostrabilmente superiore alla tecnica comune di stampa a microcontatto per le geometrie relativamente grandi utilizzate in questo metodo (cioè, per le colonie circolari di 1 mm di diametro e triangoli e quadrati dell'area equivalente). Modelli di stampa di microcontatto di ligando a questa scala di lunghezza si traduce in trasferimento eterogeneo ai bordi dei modelli, con pochissimo ligando depositato nelle regioni centrali dei modelli (Figura 4A). Questo è chiaramente insufficiente per produrre costantemente colonie hESC di geometrie specifiche. Ridurre la densità di semina delle cellule porta anche a incoerenza nel raggiungimento di colonie completate. Le cellule semitate a 200.000 cellule/mL, anziché 300.000 cellule/mL, non sono in grado di generare sufficienti contatti cellulari per sopravvivere alla ridotta concentrazione di Y27632 a 24 h dopo la semina (Figura 4B). Potrebbe essere possibile generare modelli completi con densità di cellule inferiori estendendo il periodo di diluizione Y27632; tuttavia, nel complesso è più efficiente per il seedoro alla più alta densità di 300.000 cellule / mL. Occasionalmente, gli errori nella generazione di modelli che non vengono rilevati in precedenza nel protocollo diventano evidenti al seeding di hESC. Uno di questi errori è la perdita di soluzione di ligando sotto lo stencil a causa di scarso contatto con la coverslip. Ciò comporta il trasferimento del ligando in regioni della poliacrilammide al di fuori delle geometrie desiderate e la crescita inlimitata di hESC al momento del seeding (Figura 4C).
Figura 1: Modellazione del ligando ECM su coversliplava con acido e trasferimento agli idrogel di poliacrilammide. (A) Rappresentazione schematica del protocollo per l'esidimento del ligando ECM su cerchi lavati acidi e il trasferimento del ligando modellato agli idrogel di poliacrilammide. (B) Immagini immunofluorescenti di ligando ECM a motivi geometrici su coverlips lavati con acido (a sinistra) e in seguito al trasferimento all'idrogel poliacrilammide (a destra). Il matrigel con etichettatura biotina è stato modellato sul vetritta ed etichettato con Alexa Fluor 555 streptavidin prima del trasferimento alla poliacrilammide. Gli inset mostrano una visualizzazione ingrandita dei modelli completi generati. (C) Immagini fluorescenti rappresentative che dimostrano difetti di glassazione sulla vetrina di vetro. Questi sono il risultato di errori comuni nel protocollo, come la perdita della soluzione di ligando all'esterno della geometria modellata (in alto, freccia indica il sito di perdita) e l'abbondanza di bolle d'aria all'interno delle geometrie modellate dello stencil dopo l'aggiunta della soluzione di ligando ( inferiore, la freccia indica il sito della bolla d'aria). Tutte le barre della scala - 500 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Seeding di hESC su idrogel di poliacrilofica modellata. Immagini luminose rappresentative che dimostrano il successo della semina di hESC su idrogel poliacrilamina con ligando modellato. La linea temporale in alto indica la serie di modifiche multimediali utilizzate per rimuovere le celle non attaccate e diluire il Y27632. Si noti che dopo la semina iniziale, le celle aderiscono in modo stochastically alle varie regioni all'interno del ligando modellato e quindi proliferano per riempire le regioni modellate nel corso di 72 h. Barra della scala - 500 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: localizzazione regionale delle sollecitazioni di trazione e immunostazione delle colonie hESC confinate. (A) Immagini fluorescenti di microsfere all'interno dell'idrogel poliacrilammide prima e dopo la seeding di hESC. (B) Il grafico PIV (Representative particle image velocimetry) raffigura lo spostamento delle microsfere a causa delle sollecitazioni di trazione (a sinistra) e delle corrispondenti sollecitazioni di trazione ricostruite (a destra). (C) Immunostaining delle colonie hESC confinate su idrogel di poliacrilammide modellati, dimostrando la capacità di confrontare la localizzazione delle proteine di interesse alle sollecitazioni di trazione. Tutte le barre della scala - 200 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Risultati non ideali ottenuti da metodi ed errori alternativi. (A) Immagini fluorescenti rappresentative del ligando ECM modellate su coverlip lavati con acido tramite la stampa di microcontatti. (B) Immagini di RESC che non riescono a formare colonie completate a causa dell'insufficiente aderenza delle cellule. Grandi lacune rimanenti nelle colonie a 24 h post-seeding (frecce) sono un indicatore precoce di questo problema. (C) Immagini di HESC che non formano colonie confinate a causa di errori nel patterning che hanno portato alla presenza di ligando al di fuori delle geometrie desiderate. Tutte le barre della scala - 500 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Esempio DI fabbricazione SU8 Wafer | |
| 1. Spin wafer cappotto con SU8-3050 | Rotazione a 1.000 giri/min per 30 s |
| 2. Morbido forno wafer su piastra calda | i. 3 min a 65 gradi centigradi |
| ii. 45 min a 95 gradi centigradi | |
| iii. 3 min a 65 gradi centigradi | |
| iv. Raffreddare a temperatura ambiente | |
| 3. Esporre nell'aligner maschera | i.Align wafer e fotomaschera in aligner maschera |
| Ⅱ. Esporre con energia di 250 mJ/cm2 | |
| Ad esempio per la lampada con intensità di 11 mW/cm2,esponi per 23 s | |
| 4. Post-esposizione cuocere su piastra calda | i. 1 min a 65 gradi centigradi |
| ii.15 min a 95 gradi centigradi | |
| iii. 1 min a 65 gradi centigradi | |
| Iv. Raffreddare a temperatura ambiente | |
| 5. Sviluppare | i. Agitate in SU8 Developer, circa 5-10 min |
| Ⅱ. Controllare lo sviluppo con l'alcol isopropile (IPA) | |
| Se sottosviluppato, il risciacquo IPA produrrà un residuo bianco | |
| 6. Cuocere duro su piastra calda (opzionale) | 1-2 h a 150 gradi centigradi |
Tabella 1: Esempio di protocollo di fabbricazione del wafer SU8. I wafer di silicio utilizzati per generare francobolli PDMS e gli stencil successivi sono stati fabbricati seguendo i passaggi descritti in questa tabella. Questo protocollo è stato generato utilizzando la scheda tecnica SU8 3000 con l'obiettivo di creare uno spessore della pellicola di circa 100-250 m.
| Formulazioni di gel di poliacrilammide | |||||||||
| Volumi per una soluzione completa da 1 mL | |||||||||
| Modulo elastico (Pa) | % acrilammide finale | % finale Bis-acrilammide | ddH2O (L) | 40% di acrilammide | 2% Bis-acrilammide | 10x PBS (L) | 1% TEMED in ddH2O (L) | Microsfere 0,5% solidi in ddH2O (L) | 1% PPS in ddH2O (L) |
| 1050 | 3 | 0.1 | 565 | 75 | 50 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 2700 | 7.5 | 0.035 | 485 | 187.5 | 17.5 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 4000 | 7.5 | 0.05 | 477.5 | 187.5 | 25 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 6000 | 7.5 | 0.07 | 467.5 | 187.5 | 35 | 100 | 75 | 60 | 75 |
Tabella 2: Formulazioni di gel di poliacrilammide. Volumi di componenti per la generazione di idrogel di poliacrilammide di varie moduli elastici con microsfere fluorescenti per TFM. I volumi possono essere scalati verso l'alto o verso il basso in base alla quantità di soluzione poliacrilammide necessaria. Tutti i componenti, ad eccezione delle microsfere fluorescenti e degli SPP, vengono mescolati prima del degassamento. PBS - salina tampone di fosfato, TEMED , tetrametilelelenediamina, PPS e persulfato di potassio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Per semplificare un protocollo lungo e dettagliato, questo metodo consiste in tre fasi critiche: 1) la generazione di modelli di ligando ECM su coperchi in vetro, 2) trasferendo i modelli agli idrogel di polimembrana metà durante la polimerizzazione del gel, e 3) seeding hESC sul idrogel a motivi geometrici. Ci sono passi critici che devono essere considerati in ciascuna di queste tre fasi. Per generare modelli ad alta fedeltà sui coperchi di vetro, lo stencil deve essere saldamente premuto sul coperchio per evitare perdite della soluzione di ligando e tutte le bolle d'aria devono essere rimosse dopo l'aggiunta di soluzione di ligando alla superficie dello stencil ( Figura 1C). Se la soluzione di ligando perde attraverso lo stencil a causa dello scarso contatto con lo scenografico, il ligando sarà trasferito sull'intera superficie dell'idrogel e degli hESC di poliacrilammide non sarà limitato alla geometria della colonia desiderata (Figura 4C). Il passo più importante nel trasferimento del ligando modellato alla poliacrilammide è separare delicatamente il coperchio superiore dall'idrogel mentre tutti i componenti rimangono sommersi in PBS. Se l'idrogel non rimane sommerso durante la separazione, i modelli possono essere completamente distrutti. Inoltre, se la separazione avviene troppo rapidamente, la superficie dell'idrogel può strappare o essere altrimenti danneggiata. Più morbido è l'idrogel, più è a rischio di danni durante la separazione. Infine, l'utente deve pipette con molta attenzione quando si scambiano i media durante la seeding e la cultura degli hESC sugli idrogel modellati. Gli HESC rimangono vagamente aderenti per tutto il protocollo e le colonie modellate possono essere facilmente interrotte da pipettature imprudenti o affrettate.
Oltre ai passaggi critici descritti in precedenza, sono disponibili numerosi altri passaggi che potrebbero richiedere modifiche e risoluzione dei problemi durante l'adattamento di questo protocollo per applicazioni diverse. Mentre i modelli qui mostrati sono sulla scala di lunghezza di centinaia di micron a un millimetro, la generazione di caratteristiche modellate su wafer di silicio con fotomaschere di trasparenza e fotoresist negativo consente dimensioni delle caratteristiche fino a 7-10 m. Pertanto, questo protocollo potrebbe essere adattato per limitare la geometria di singole cellule o colonie più piccole di poche cellule su substrati conformi.
Due parametri che probabilmente richiederanno l'ottimizzazione durante l'adattamento di questo protocollo per diversi tipi di cellule sono il tipo di ligando ECM utilizzato e la concentrazione del ligando in soluzione durante l'adsorbimento al coperchio di vetro attraverso gli stencil. Una concentrazione totale di ligando di 250 g/mL è stata sufficiente per produrre modelli omogenei di matrigel e facilitare l'attaccamento di hESC(Figura 1B e Figura 2), anche se è possibile ottenere risultati simili con risultati più bassi Concentrazioni. D'altra parte, potrebbe essere necessario aumentare ulteriormente la concentrazione di legamento per i tipi di cellule che sono meno aderenti o per applicazioni che richiedono tempi di incubazione più brevi. Una maggiore concentrazione di ligando può essere necessaria anche per diversi ligando ECM, come fibronectina o collagene, che sono meno idrofobici di matrigel e quindi non possono adsorgarsi al gelo come fortemente. Poiché il trasferimento del ligando da coverslip all'idrogel avviene durante la polimerizzazione dell'idrogel, le tecniche comunemente utilizzate per il collegamento robusto del ligando ECM alla superficie dell'idrogel (come il trattamento solforo-SANPAH) sono impossibili. L'utilizzo di ligandi ECM con etichetta fluorescente per consentire la visualizzazione dei modelli in ogni fase del protocollo è estremamente utile durante l'ottimizzazione e la risoluzione di questi parametri.
Inoltre, il protocollo per il seeding delle celle può richiedere l'ottimizzazione a seconda del tipo di cella e delle condizioni multimediali utilizzate. Per le cellule che aderiscono in modo più rapido ed efficiente, potrebbe essere necessaria una densità di semina inferiore per evitare aderenze delle cellule cellulari che si estendono tra i modelli e si traducono in aggregazioni piuttosto che colonie monostrato modellate. Per le celle che mostrano un attaccamento molto scarso, può essere necessaria una maggiore densità di semina o un periodo di tempo maggiore prima dello scambio iniziale dei supporti per facilitare la formazione completa delle colonie confinate (Figura 4B).
La limitazione chiave di questo metodo è la sua complessità tecnica, che si traduce in risultati relativamente bassi rispetto a metodi simili che coinvolgono cellule di coltura su substrati di vetro modellati8. Tuttavia, questo inconveniente è di gran lunga superiore alla rilevanza fisiologica ottenuta coltivano le colonie hESC confinate su substrati conformi. Riassumendo efficacemente le proprietà meccaniche dell'embrione precoce, siamo in grado di modellare e comprendere meglio i processi che portano all'auto-organizzazione degli strati germinali primari.
Un ulteriore vantaggio delle colonie di hESC confinanti sugli idrogel di poliacrilammide è che consente all'uso di TFM di esaminare il legame tra l'organizzazione di una colonia hESC, come modello dell'embrione precoce, e la distribuzione di forze generate dalle cellule che possono alla base della morfogenesi e delle specifiche del destino cellulare. Confinando le colonie di hESC si traduce in distribuzioni di sollecitazioni di trazione che dipendono dalla geometria della colonia (Figura 3B). Nonostante la non uniformità di queste sollecitazioni di trazione, le cellule in tutte le colonie rimangono pluripotenti in condizioni di manutenzione (Figura 3C). Tuttavia, ipotizziamo che le distribuzioni di stress da trazione possano essere coinvolte nella regolazione dei modelli di specifica del destino cellulare regolando la risposta ai segnali di induzione, come i morfogeni solubili. Prevediamo che questo metodo permetterà a noi e ad altri gruppi di modellare meglio il primo embrione umano con gli HESC, portando a una comprensione più completa dei processi fondamentali alla base dell'embriogenesi umana.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo riconoscere i finanziamenti della sovvenzione CIRM RB5-07409. J.M.M. ringrazia FuiBoon Kai, Dhruv Thakar e Roger Oria per varie discussioni che hanno guidato la generazione e la risoluzione dei problemi di questo metodo. J.M.M. ringrazia anche la UCSF Discovery Fellowship per il continuo supporto del suo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
References
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
- Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).
- Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mace, K., Braun, K. 916, Humana Press. Totowa, NJ. 317-350 (2012).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
- Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
- Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).
