Summary
تعرض هذه المخطوطة البروتوكولات الخاصة بإلحاق إصابات النخاع الشوكي الحاده والحاده المتحكم بها جراحيا إلى قنفذ التجديدي (المكسيكوما المكسيكية).
Abstract
والغرض من هذه الدراسة هو إنشاء نموذج موحده وقابله للتكرار التجدد أصابه الحبل الشوكي حاده في قنفذ (امستوما المكسيكي). معظم إصابات النخاع الشوكي السريرية تحدث كصدمات حاده الطاقة العالية ، ويحفز إصابات كدمه. ومع ذلك ، أجريت معظم الدراسات في الحبل الشوكي قنفذ مع صدمات حاده. التالي ، تهدف هذه الدراسة إلى إنتاج نموذج تجديدي أكثر ملاءمة سريريا. نظرا لقدرتها الرائعة علي تجديد اي نسيج تقريبا ، يتم استخدام axolotls علي نطاق واسع كنماذج في الدراسات التجديدية وقد استخدمت علي نطاق واسع في الدراسات أصابه الحبل الشوكي (SCI). في هذا البروتوكول ، يتم تخدير الaxolotls بالغمر في محلول بنزوكايين. تحت المجهر ، يتم اجراء شق الزاوي ثنائيا علي مستوي الذيليه فقط إلى الأطراف الخلفية. من هذا الشق ، فمن الممكن لتشريح وفضح العمليات الشائكة. باستخدام ملقط ومقص ، يتم اجراء استئصال الصفيحة علي مستويين ، مما يعرض الحبل الشوكي. يتم إنشاء جهاز الصدمات المخصصة التي تتكون من قضيب السقوط في اسطوانه ، ويستخدم هذا الجهاز للحث علي أصابه كدمه في الحبل الشوكي. ثم يتم خياطه الشقوق ، ويتعافى الحيواني من التخدير. النهج الجراحي ناجح في تعريض الحبل الشوكي. يمكن ان تنتج اليه الصدمات إصابات كدمه في النخاع الشوكي ، كما تؤكد ذلك الانسجه ، والتصوير بالرنين المغناطيسي ، والفحص العصبي. وأخيرا ، يجدد الحبل الشوكي من الاصابه. الخطوة الحاسمة في البروتوكول هي أزاله العمليات الشائكة دون إلحاق الضرر بالحبل الشوكي. وتتطلب هذه الخطوة التدريب لضمان اجراء أمن. وعلاوة علي ذلك ، إغلاق الجرح يعتمد إلى حد كبير علي عدم إلحاق اضرار لا لزوم لها علي الجلد اثناء الشق. تم تنفيذ البروتوكول في دراسة معشاه من 12 الحيوانية.
Introduction
وكان الهدف العام لهذه الدراسة لإنشاء طريقه الجراحية الدقيقة التي تسيطر عليها واستنساخها للحاق الخيال العلمي الحاد والحاد إلى قنفذ (امستوما المكسيكي) ، وإنتاج نموذج التجدد أصابه الحبل الشوكي.
الخيال العلمي هو حاله خطيره ان, اعتمادا علي مستوي ومدي, يلحق الاعاقه العصبية إلى الأطراف جنبا إلى جنب مع ضعف المثانة والأمعاء السيطرة1,2,3. معظم الخيال العلمي هي نتيجة لصدمات حاده الطاقة العالية مثل حوادث المرور ويسقط4,5. الإصابات الحاده نادره جدا. ولذلك ، فان النوع الأكثر شيوعا أصابه المجهري هو كدمات.
الجهاز العصبي المركزي الثدييات (CNS) هو نسيج غير التجديدية ، التالي لا استعاده الانسجه العصبية بعد الخيال العلمي وينظر6،7،8. من ناحية أخرى ، بعض الماشية لديها قدره مثيره للاهتمام لتجديد الانسجه ، بما في ذلك الانسجه العصبية. واحده من هذه الكائنات هي axolotl. ويستخدم علي نطاق واسع في دراسات البيولوجيا التجديدية وهو من الفائدة في تجديد الحبل الشوكي ، لأنه هو فقاري9،10،11،12.
يتم اجراء معظم الدراسات العلمية في قنفذ اما بتر الذيل بأكمله أو الاجتثاث من جزء أكبر من الحبل الشوكي9,10,11,12. في الاونه الاخيره ، تم نشر دراسة جديده علي إصابات حاده13 ان يحاكي الحالات السريرية أفضل. في حين ان البتر الزائد الكامل في قنفذ يؤدي إلى التجديد الكامل ، فان بعض الظواهر التجديدية غير القائمة علي البتر تعتمد علي عيب الحجم الحرج (المصلحة العامة)14،15. وهذا يعني ان الإصابات التي تتجاوز عتبه حرجه لا تجدد. لتطوير نموذج التجدد مع القيمة السريرية اعلي الانتقالية ، والتحقيق في هذه الدراسة ما إذا كان 2 مم صدمه حاده تتجاوز الحد الأقصى للجنة التنمية المستدامة.
هذا الأسلوب هو ذات الصلة للباحثين العاملين علي تجديد الحبل الشوكي في نماذج الحيوانية الصغيرة ، وخاصه في axolotl. وعلاوة علي ذلك ، قد يكون من المصلحة العامة ، لأنه يسلك وسيله لاستخدام المعدات المختبرية القياسية لتطوير اليه الصدمات الحاده التي هي مناسبه للاستخدام في الماشية الصغيرة بشكل عام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد اتبعت خلال هذه الدراسة جميع الانظمه المؤسسية والحكومية المعمول بها فيما يتعلق بالاستخدام الأخلاقي للحيوانات. وأجريت الدراسة ببموجب رقم الموافقة: 2015-15-0201-0061 من جانب المفتشيه الدانمركية لتجربه الماشية. وكانت الكائنات المكسيكية axolotls (أمبولي المكسيكوما، ويعني كتله الجسم ± STD: 12.12 غرام ± 1.25 g).
1-الاعداد
-
اعداد قنفذ للتخدير.
- استخدام عاليه الجودة غير المعالجة كيميائيا ماء الصنبور. إذا لم تكن متوفرة ، استخدم 40% Holtfreter الحل.
- ذوب 200 ملغ من ايثيل 4-امينوبنينزواتي (بنزوكايين) في 3 مل من الأسيتون. حل هذا الحل في 1 لتر من مياه الصنبور أو 40% Holtfreter للحل.
- استخدام طبق بيتري القياسية (100 مم في القطر) وضعت تحت مجهر ستيريو كجدول الجراحية. ضع قطعه قماش النسيج الجراحية علي طبق بيتري.
ملاحظه: استخدام طبق بيتري كمنطقه جراحيه تمكن من تحريك ودوران الحيوانية دون لمسها ، وضمان استقرار العمود الفقري اثناء الجراحة. - اعداد جميع الاداات الجراحية المجهرية المعقمة (مثل المقص والملقط التشريحي).
2-التخدير
- ضع قنفذ في وعاء مع محلول البنكوكين لمده 45 دقيقه تقريبا لضمان التخدير العميق والمستقر.
ملاحظه: تركيز معين من البنكوكين سوف يسبب التخدير في جميع الاحجام من axolotls. - البحث عن علامات التخدير العام في غضون 30-45 دقيقه. وتشمل هذه الحالات الافتقار الكامل لحركات الجيل ، والمنعكس اليميني ، أو الاستجابة لمحفزات لمسيه أو مؤلمه (قرص لطيف من اصبع القدم علي شبكه الإنترنت).
- للحفاظ علي التخدير ، والتفاف الكائنات في المناشف الورقية المبللة في محلول التخدير. بلل هذه بانتظام مع هذا الحل خلال العملية الجراحية لضمان الحفاظ علي الجلد والخياشيم رطبه.
- استعاده الحيوانية بعد الجراحة عن طريق وضعها في وعاء يحتوي علي مياه الصنبور الطازجة. لاحظ علامات الانتعاش ، مثل حركه الجيل واستعاده منعكس اليمين ، في غضون 1 ح16.
3. استئصال الصفيحة الجراحية المجهرية
ملاحظه: يتم اجراء استئصال الصفيحة تحت مجسم فراغي.
- وضع الحيوانية في موقف المعرضة علي طبق بيتري. التفاف عليه في المناشف الورقية بحيث يتعرض الذيل.
ملاحظه: المناشف الورقية ممتازة لضمان الاستقرار طوال العملية. -
تحديد الأطراف الخلفية. جعل الشق الأول مجرد الذيليه لهم.
- مع زوج من المقصات الصغيرة ، قم باجراء شق عمودي من العارضة حتى يتم الشعور بالبروز العظمي للعمليات الشائكة.
ملاحظه: كن حذرا جدا عند استيعاب العارضة والجلد مع ملقط ، لان هذه تلحق بسهوله الضرر علي الجلد الحساس. - تمديد قطع أفقيا ، التالي فان الشق يخترق عرض كامل من الذيل.
- فهم عمليه سبينوس مع ملقط لضمان العمق الصحيح.
- توسيع الشقوق العمودية 1 ملم تحت العملية الشائكة علي كلا الجانبين.
- مع زوج من المقصات الصغيرة ، قم باجراء شق عمودي من العارضة حتى يتم الشعور بالبروز العظمي للعمليات الشائكة.
-
ضع الحيوانية علي جانب واحد لاجراء شقوق بطنيه وافقيه كما هو مبين أدناه.
- مع زوج من المقص الصغير ، بدءا من النقطة البطنية لشق عمودي ، وجعل شق أفقي من حوالي 15 ملم للحيوانات 10-20 غرام في الوزن. جعل الشق أطول للحيوانات الكبيرة ، وأقصر للحيوانات الصغيرة.
- باستخدام المقص ، تشريح الوسيط من خلال شق أفقي حتى يشعر العمود الفقري في خط الوسط.
- كرر الخطوات 3.3 ، 3-3-1 ، و 3-3-2 علي الجانب الآخر من الحيوانية.
-
بعد تشريحها في الطائرة الوسطي العميقة من كلا الجانبين ، تشريح من خلال خط الوسط ، التالي ربط الشقين الأفقي.
- تحريك قطعه حره من الذيل وعارضه إلى جانب واحد ، وفضح العمليات سبينوس (الشكل 1).
- Fixate قطعه الذيل باستخدام المناشف الورقية الرطب.
-
وضع الحيوانية في موقف المعرضة مره أخرى مع الراس الذي يواجه الجانب الجراح غير المهيمنة.
- مع زوج من الملقط ، وفهم العمليات سبينوس فقط الذيليه إلى أطرافه الخلفية. تطبيق رفع لطيف علي حد سواء صعودا ونحو راس الحيوانية.
- ضع شفرات زوج من المقص الصغير الأفقي حول العملية واقطعها برفق. الرفع علي العملية يضمن ان يتم الآن ازالته ، وتعريض الحبل الشوكي.
- فهم العملية الشائكة فقط الذيليه إلى واحد التي تم ازالتها فقط وكرر الخطوات 1 ، 3-5 و 3.5.2.
ملاحظه: وهذا ينبغي ان يترك الحبل الشوكي المكشوفة المقابلة لمستويين الفقري. عند اجراء استئصال الصفيحة الفقرية ، غالبا ما يظهر إفراز رغوي ابيض. يتم تحديد الحبل الشوكي بسهوله من خلال تالقه المميز ، إلى جانب السفينة التي تعمل علي طول الخط الأوسط. - اعتمادا علي حجم الحيوانية ، فان المنطقة المعرضة قد لا تكون واسعه بما فيه الكفاية. باستخدام زوجين من الملقط ، وفهم الصفيحة علي جانبي الحبل الشوكي وتطور هذه أفقيا مع حركه لطيف.
4. إدخال أصابه نوع الكدمة (الشكل 2)
- الحفاظ علي الحيوانية في موقف المعرضة.
- استخدام طبق بيتري لنقل الحيوانية إلى وحده الصدمات.
- وقد مساعد تالق مصباح يدوي علي الحبل الشوكي.
- ضع اسطوانه وحده صدمات الكدمة فوق الحبل الشوكي المكشوف باستخدام المتحكمين في الوحدة. الهدف من خلال الاسطوانه.
- خفض الاسطوانه حتى يكون المستوي مع الصفائي.
- نعلق قضيب السقوط علي المغناطيس الكهربائي. ضع اسطوانه تعديل الارتفاع المطلوبة علي وحده الصدمات.
- ضع قضيب السقوط في الاسطوانه.
ملاحظه: لدراسة اعمي ، يجب علي الجراح الآن مغادره الغرفة دون معرفه ما إذا كان سيتم تعيين الحيوانية لأصابه أو مجموعه الجراحة الصورية. - أطفئ المغناطيس الكهربائي يقع القضيب علي الحبل الشوكي المكشوف.
- استخدام المسمار تعديل الارتفاع لرفع قضيب من الحبل الشوكي.
- تاكيد الاصابه من خلال النظر في الحبل الشوكي من خلال المجهر. سيظهر الموقع المصاب أكثر قتامة ، سيكون النزيف من السفينة الوسطي واضحا.
5. إدخال أصابه حاده
ملاحظه: تنفيذ هذه الخطوات بعد 3.5.4.
- مع زوج من مقص صغير قطع الحبل الشوكي في قطع عمودي الكمال.
- كرر قطع 2 مم إلى الجانب الذيليه من الجسم.
ملاحظه: يمكن تعديل طول القطعة المزالة من الحبل الشوكي وفقا لمتطلبات الدراسة. ومع ذلك ، فان قطع 2 مم يكون regenerable10. - تاكد من اكتمال التخفيضات. عند الانتهاء ، ويشعر ريش مقص كشط علي طول الجزء البطني من القناة الشوكية.
- رفع الجزء 2 مم من الحبل الشوكي من القناة الشوكية.
6. إغلاق الجرح الجراحي
- أعاده الحيوانية إلى الجدول الجراحي. في دراسة اعمي ، وأعاده وضع عارضه حتى الحبل الشوكي غير مرئية للجراح.
-
الحفاظ علي الحيوانية في موقف المعرضة.
- بدء وضع الغرز النايلون 10.0 من الجزء الأكثر الذيليه من الشق الأفقي. اغلق الجروح في طبقه واحده.
ملاحظه: لا تفهم الجلد ضيق جدا ، لأنه سوف يسبب نخر. - العمل نحو الجزء العمودي من الشق.
- عند الوصول إلى الزاوية ، قم بتشغيل طبق بيتري وخياطه الشق الأفقي الآخر.
- اضبط الغرز علي الشقوق العمودية.
- لا تضع الغرز في الجزء العلوي من العارضة ، لان الجلد هنا لن تكون قادره علي الاستمرار.
- بدء وضع الغرز النايلون 10.0 من الجزء الأكثر الذيليه من الشق الأفقي. اغلق الجروح في طبقه واحده.
7. أعاده الحيوانية إلى الحل الخالي من المخدرات
- رفع طبق بيتري مع الحيوانية والغمر علي حد سواء برفق جدا في المياه العذبة فقط 5 سم العميق والسماح للحيوان الشريحة قباله.
ملاحظه: عمق المياه الضحلة يضمن ان الحيوانية لن تحاول السباحة إلى السطح للتنفس. - لا تقم بتغيير الماء خلال الأسبوع الأول.
- عند إطعام الماشية ، تاكد من وضع الطعام بالقرب من راس الحيوانية.
ملاحظه: والغرض من هذه التدابير هو تجنب أكبر قدر ممكن من الحركة خلال الأسبوع الأول.
8. الموجات فوق الصوتية بعد الجراحة
- قبل إنهاء التخدير ، استخدم نظام الموجات فوق الصوتية عاليه التردد للحصول علي صور للاصابه التي يمكن استخدامها لبناء صور ثلاثية الابعاد لموقع الخيال العلمي.
- إرفاق محول إلى الجزئية ويفضل ان يحكمها عصا التحكم عن بعد.
- دمج الحيوانية تخدير في موقف المعرضة في وعاء صغير مليئه محلول مخدر.
ملاحظه: إصلاح الحيوانية مع أكياس الرمل مصغره أو غيرها من المعدات لتجنب الحركة اثناء تسلسل المسح الضوئي. - محاذاة غيض من محول مع محور طول الحيوانية وتحت دمجها في محلول بنزوكايين حتى انها ليست سوي بضعة ملليمترات فوق العارضة وراء الأطراف الخلفية للحيوان.
- تحديد موقع الخيال العلمي.
ملاحظه: يمكن التعرف علي موقع الاصابه بسهوله بسبب العمليات الشائكة المفقودة مباشره فوق الخيال العلمي. - تحسين الصورة عن طريق ضبط إعدادات الموجات فوق الصوتية. تاكد من ان موقع الخيال العلمي في وسط الصورة. اضبط مجال العرض (اي عمق الصورة وأزاحه العمق وعرض الصورة) لتغطيه موقع SCI والانسجه الصحية المجاورة. اضبط المكسب ثنائي الابعاد لتحسين تباين الصورة.
- من خلال كنس محول الموجات فوق الصوتية عبر موقع الخيال العلمي مع الاداره الجزئية التي تعمل الكترونيا ، والحصول علي الصور الوضع B تغطي موقع الخيال العلمي في عده مواقع شريحة متعددة القطاعات السهمي ، مع شرائح متتالية مع فاصل بين الشرائح من 50 μm. الحصول علي الصور السينمائية التي تحتوي علي 500 إطارات مع معدل اطار من ~ 50 إطارات/ثانيه وتردد محول من 40 ميغاهيرتز.
ملاحظه: يتطلب هذا الاعداد التفصيلية الكترونيه التي تحكمها عصا التحكم عن بعد (الخطوة 8.2). - بعد الانتهاء من المسح تسلسل العودة إلى الخطوة 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
والغرض من البروتوكول هو إنتاج الخيال العلمي الذي سيشل السيارات والوظائف الحسية الذيليه إلى الاصابه. لان قنفذ هو تجديد-المختصة فانه يستعيد وظيفة في غضون أسابيع ، مما يسمح للباحثين لدراسة التجدد CNS خلال فتره زمنيه قصيرة.
تم توفير التخدير لمده 45 دقيقه لجميع الكائنات ، ولم تشهد اي نوبات من الشفاء قبل الأوان. جميع الحيوانية تعافي في غضون ساعة وأظهرت اي علامات الضرر من التخدير في الأسابيع التالية13,16.
وكان استئصال الصفيحة ناجحا في جميع الكائنات. ومع ذلك ، دعا التباين التشريحي في عرض القناة الشوكية لتوسيع القناة باستخدام ملقط وتطور في بعض الافراد. وعلاوة علي ذلك ، المتبقية الصفيحة في بعض الافراد منعت قضيب السقوط من الوصول إلى هدفها ، التالي جعل من الضروري ان الجراح تنظيف الحقل من العظم المتبقية والبروز.
وقد ارتبط إغلاق الشقوق ببعض الصعوبات ، وخاصه خلال مرحله تجريب الدراسة. الغرز في الجزء العلوي من عارضه لن تعقد وأسفر عن إغلاق غير كافيه. لم يمسك الإغلاق من واحده حيوانيه في الدراسة, ينتج في العارضة يكون يمزق, تلوث لاحقه, وموت. وهذا يؤكد الحاجة إلى الخياطة بعناية علي طول الشقوق بأكملها.
وكانت الإصابات الميكانيكية الاوليه واضحة اثناء العملية. اثناء التطوير النموذجي ، كانت ملطخه المصابين والزائفة الحيوانية مع الهيوكوكسيلين واليوزين للتحقق من صحة الاصابه. وترد النتائج التمثيلية لكل مجموعه في الشكل 3A1وA2 والشكل 3c1,c2. وأكد تجديد المواد النسيجية الاستعدادات التي ادلي بها بعد تسعه أسابيع (الشكل 3B1،B2 والشكل 3D1،D2) ، والتي أظهرت أعاده تاسيس اتصال الحبل الشوكي في العلوم الحيوانية.
يمكن ان يتبع الاصابه والتجدد عن طريق فحص وظيفة عصبيه. تحفيز الذيل مع لمسه خفيفه ومعسر من ملقط سوف تكشف عما إذا تم فقدان اللمس والوظائف الحسية nociceptive ويحتمل أعاده تاسيسها. تم تعريف النتيجة العصبية علي أساس رد فعل الحيوانية: 0 نقطه = لا استجابه ، 1 نقطه = حركه الذيل المحلية ، 2 نقطه = الحركة المبتورة ، 3 نقاط = حركه منسقه للأطراف و/أو الراس إلى جانب حركه الاقتطاع ، 4 نقاط = الحيوانية مع سرعه الحركة المنسقة الفورية. في سته العلوم الحيوانية مقابل خمسه الزائفة الحيوانية تم العثور علي فقدان وظيفة عصبيه ثلاثه أسابيع بعد أصابه ، واستعاده تدريجيه في غضون تسعه أسابيع (الشكل 4 والفيديو التكميلية 1).
ويمكن الحصول علي الصور ultrasonographic من الحبل الشوكي المصاب باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه. وكان تصور موقع الخيال العلمي ممكنا بسبب الافتقار الواضح للعمليات العظمية الشوكية (الشكل 5). وعلاوة علي ذلك ، باستخدام وضع B يمكن تصور الشريان الظهري للعمود الفقري غير المصاب ، مما أسفر عن علامة علي سلامه السفينة.
فمن الممكن لاختبار الحيوانية فورا علي أعاده الصحوة. ومع ذلك ، أعربت بعض الحيوانية المحلية السعه الصغيرة ، والمتكررة ، وحركه الذيل الإيقاعي علي التحفيز مماثله لظواهر القعقعة لوحظ في العلوم البشرية. وقد تمثل هذه الحركات عبئا أو نقصا في القمع المنعكس المركزي ، وقد تتسبب في إلحاق المزيد من الضرر بالحبل الشوكي المصاب حديثا. ولذلك ، فان اختبار الحيوانية لا يوصي قبل الاصابه بعد أسبوع واحد.
من المراقبة النوعية البسيطة للحيوانات ، سيكون من الواضح ان الذيل مشلول ، والسباحة تثبط بشكل كبير ، مما يجعل الكائنات تعتمد تماما علي تحريك أطرافها. ستحقق هذه الملاحظات أيضا نجاح البروتوكول.
أجريت فحوصات التصوير بالرنين المغناطيسي عاليه المجال (9.4 T) مباشره بعد الاصابه لتصور الاصابه في الجسم المجري (الشكل 6). ومع ذلك ، كانت المسح منخفضه عموما في نسبه الاشاره إلى الضوضاء مقارنه بتلك التي لا تعمل الحيوانية ، والمرجح بسبب النزيف والأرقاء. التالي ، استنتج ان التصوير بالرنين المغناطيسي هو طريقه دون الأمثل للتحقق من صحة الاصابه ونجاح البروتوكول.
الشكل 1: رسم تخطيطي لاستئصال الصفيحة الجراحية المجهرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: رسم تخطيطي لليه صدمه الكدمات. (ا) الاعداد بأكمله ، والتي تبين سقوط قضيب فوق الحيوانية. (ب) اليه المفككة ، التي تبين كيفيه قطع القضيب عن المغناطيس الكهربائي. (ج) يرتبط قضيب السقوط بالمغناطيس الكهربائي. يتم تثبيت اسطوانه تعديل ارتفاع السقوط ، والمغناطيس الكهربائي وقضيب تحميلها في الاسطوانه. يتم التحكم في ارتفاع تعديل النظام بأكمله بواسطة عجله تعديل. (د) سيؤدي إيقاف المغناطيس الكهربائي إلى سقوط القضيب دون ان يلمس المشغل النظام. وقد نشر ثيجسن وآخرون13الرقم في الأصل. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: المواد النسيجية الهيلوكسيلين و ايوسين ملطخه علي الفور وتسعه أسابيع بعد الاصابه. (A1) العلوم الحيوانية مباشره بعد الاصابه. (B1) الخيال العلمي الحيوانية في تسعه أسابيع. (جيم1) الشام للجراحة الحيوانية بعد الاصابه مباشره. (د-1) الشام الحيوانية في تسعه أسابيع. المربع الأحمر = علامات أصابه الكائنات الخيال العلمي ، واستئصال الصفيحة من الحيوانية الصورية. الشكل 2(ا ) ، الشكل 2(ب) ، الشكل 2(ج ) هي تكبير هذه المجالات في 5x. السهم الأزرق = الحبل الشوكي غير المصاب. تم نشر هذا الرقم في الأصل من قبل Thygesen et al.13. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: رسم بياني للاستجابة لمحفزات اللمس. استجابه مجموعات الخيال العلمي اقل بعد ثلاثه أسابيع ، بالمقارنة مع مجموعه الشام. WPI = أسابيع بعد الاصابه ، الخط الأسود = SCI ، رمادي اللون = الشام. الشام ن = 5 ، الخيال العلمي = 6. وقد نشر ثيجسن وآخرون13الرقم في الأصل. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: صوره Ultrasonographic تظهر الحبل الشوكي في قسم السهمي. الخطوط الصفراء علامة الحبل الشوكي ، الدائرة الصفراء موقع الاصابه ، والسهام البيضاء علامة الفقرات. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: التصوير بالرنين المغناطيسي في نقاط زمنيه مختلفه بعد الاصابه أو الجراحة الصورية. السائل النخاعي المحيطة بالحبل الشوكي غير موجود ، وخاصه في ثلاثه WPI للحيوان الخيال العلمي ، مما يدل علي تورم في الحبل الشوكي. سواد الحبل الشوكي يشير إلى الوذمه أيضا. لاحظ كيف تختفي هذه التغييرات كما تقدم التجديد. السهم الأصفر = منطقه استئصال الصفيحة الفقرية. وقد نشر ثيجسن وآخرون13الرقم في الأصل. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
فيديو تكميلي 1: فيديو يظهر الوظيفة العصبية بعد محفزات اللمس وفي وقت لاحق التحفيز nociceptive. أولا صحية السيطرة علي الحيوانية ، ومن ثم الحيوانية التي تعاني من الخيال العلمي. الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لان خطر الاصابه بالحبل الشوكي مهم ، فان الخطوات الحاسمة للبروتوكول هي أزاله العمليات الحاده وتوسيع الوصول العظمي إلى القناة الشوكية إذا لزم الأمر. وكما ذكر في البروتوكول ، ينصح بشده بازاله معظم عمليه الجمجمة أولا. وهذا يعني ان العمليات أكثر الذيليه حماية الحبل الشوكي من التعرض للضرب من قبل المقص. فمن المستحسن لضمان الوصول الجراحي بما فيه الكفاية ، وهذا يعني ان لا تجعل صغيره جدا شق الاوليه. أيضا ، عند استيعاب اي شيء مع ملقط ، يجب ان ينظر دائما اتجاه السحب تطبيقها. وتطبيق سحب لطيف بعيدا عن الحبل الشوكي حمايته في حاله فشل فهم وزلة من الصك.
العملية الجراحية في قنفذ لا تختلف عن غيرها من الكائنات. ومع ذلك ، هناك بعض الاختلافات الهامه الموجودة ، ويرجع ذلك في المقام الأول إلى تكوين الانسجه وحجم الحيوانية. الجلد عارضه قنفذ هشه جدا ، ومن المفارقات لا يشفي جيدا علي الاضرار الصغيرة التي لحقت خلال شق. يجب توخي الحذر ، وخاصه عند الشقوق الاوليه ، لان الضرر سيعقد بشكل كبير الخياطة. عظام axolotls الشباب جدا لينه جدا. وهذا يعني ان الملقط التشريحي الأساسي غالبا ما يكون كافيا في أزاله العظام. وهذا يمثل عنصرا آخر من الحذر ، لان معسر العمليات الشائكة يمكن ان تلحق ضررا كبيرا. لا تتوفر طبقات اللفافة تحت الجلد والعضلات للخياطة ، وذلك بسبب تركيباتها النسيجية الهشة. من الضروري ضمان الهدوء بعد الجراحة الأسبوع. قد لا يستريح الماشية بشكل كاف بعد العملية. التالي ، فانها قد تلحق ضررا ثانويا لحبلهم الشوكي بعد الجراحة. تشريحها الصغير لا يسمح للتثبيت الداخلي ولا الشق.
الوزن وارتفاع سقوط نظام قضيب السقوط أمر بالغ الاهميه للحاق أصابه كدمه. اثناء تجريب واسعه لدراسة سابقه, ال قضيب وزن ويسقط ارتفاع يحتاج كان وجدت ان يكون 25 [غ] و 3 [كم]13. وكان هذا كافيا للحث علي الشلل في 12 غرام axolotls دون قطع أو تفكك الحبل الشوكي. قد تكون هناك حاجه إلى الوزن المضافة أو ارتفاع السقوط في الأكبر الحيوانية. وعلاوة علي ذلك ، فان قطر القضيب المتساقط قد يحتاج إلى ان يكون أكبر في حاله الماشية الأكبر وأقصر للحيوانات الصغيرة.
النموذج لديه بعض القيود. لأنه لا يتم استخدام axolotls لدراسات السلوك المستفادة ، لا يمكن للمرء اختبار الوظائف العصبية المعقدة. تم إدخال الاصابه الذيليه إلى الأطراف ، وتجنيب الأطراف الخلفية والأمعاء والمثانة من الشلل. وكان السبب في ذلك الاخلاقيه ، للحد من تاثير علي الحيوانية إلى الحد الأدنى. ومع ذلك ، فانه يحد من الفرصة لدراسة الآثار علي حركات الأطراف ، والتي قد تكون أسهل لوصف وتصنيف. وينبع جزء كبير من الاعتلال المرتبط بالخيال العلمي من فقدان السيطرة علي الأمعاء والمثانة. هذا النموذج لا يسمح للبحوث في المستقبل في هذه المجالات. ومن شان إلحاق الضرر بالأطراف الخلفية ان يكون ممكنا ، ولكنه لم يحاول.
دراسة العلوم العلمية في نموذج التجدد مثل قنفذ يسمح لنهج مختلف في البحوث العلمية. ونظرا لان النموذج الحيواني يمكن ان يتجدد ، فان دراسات الاستبعاد ستكون قادره علي الكشف عن العوامل الحاسمة للتجديد. يتم اجراء الدراسات التقليدية علي الخيال العلمي في نماذج غير التجدد ، وهذا يعني ان المرء سوف تحتاج إلى التدخل علي جميع العوامل الحاسمة للحث علي استجابه التجدد.
هذا النموذج والبروتوكول هي في التوافق مع مبدا Krogh التي تنص علي ان: "لمثل هذا العدد الكبير من المشاكل سيكون هناك بعض الحيوانية الاختيار أو عدد قليل من هذه الكائنات التي يمكن ان تكون أكثر ملائمة درس"17. ويعوق تجدد الثدييات عوامل متعددة. تثبيط هذه في نموذج الثدييات عاده لا يحفز اي اثار. ومع ذلك ، فان زيادة مستويات مثبطات في قنفذ ينبغي القضاء علي التجدد ، التالي الكشف عما إذا كان هذا المثبط حرجه أو لا10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
مايكل بيدرسن ، جامعه ارهوس لخبرته ووقته في تطوير بروتوكولات التصوير بالرنين المغناطيسي واعداد المشروع بأكمله. بيتر اغغر ، جامعه ارهوس لخبرته والوقت في تطوير بروتوكولات التصوير بالرنين المغناطيسي. ستيفن رينغغارد ، جامعه ارهوس لخبرته والوقت في تطوير بروتوكولات التصوير بالرنين المغناطيسي. تم دعم تطوير نموذج الخيال العلمي في قنفذ من قبل مؤسسه A.P. مولر ميرسك ، ومؤسسه رييسفورت ، ومؤسسه linex ، ومؤسسه elro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| Electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Kimwipes | |||
| Microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
- Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).
- Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. Bladder management and quality of life after spinal cord injury. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).
- Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population. Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).
- Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study. Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).
- Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).
- Aguayo, A. J., et al. Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).
- Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum. Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).
- Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. Regeneration of long spinal axons in the rat. Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).
- Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).
- Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat. Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).
- Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl. Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).
- McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres. Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).
- Thygesen, M. M., et al. A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail. Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).
- Goss, R. J. Principles of Regeneration. , Academic Press. New York. (1969).
- Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing. Bone. 40 (1), 45-56 (2007).
- Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
