Summary
Dette manuskriptet presenterer protokoller for kirurgisk påføre kontrollert sløv og skarp ryggmargsskader på en regenererende Axolotl (Ambystoma mexicanum).
Abstract
Formålet med denne studien er å etablere en standardisert og reproduserbar regenererende stump ryggmargsskade modell i Axolotl (Ambystoma mexicanum). De fleste kliniske ryggmargsskader oppstår som høy energi stump traumer, inducing kontusjon Kader. Men de fleste studier i Axolotl ryggmargen har blitt gjennomført med skarpe traumer. Derfor har denne studien som mål å produsere en mer klinisk relevant regenererende modell. På grunn av sin imponerende evne til å regenerere nesten alle vev, axolotler er mye brukt som modeller i regenererende studier og har blitt brukt mye i ryggmargsskade (SCI) studier. I denne protokollen blir axolotler anesthetized ved å være i en benzocaine løsning. Under mikroskopet er en kantete snitt laget bilateralt på et nivå bare caudal til bakbena. Fra dette snittet, er det mulig å analysere og eksponere spinous prosessene. Ved hjelp av pinsett og saks, en to-nivå laminectomy utføres, utsette ryggmargen. En tilpasset Trauma enhet bestående av en fallende stang i en sylinder er konstruert, og denne enheten brukes til å indusere en kontusjon skade på ryggmargen. Snittene blir så sutured, og dyret gjenoppretter fra anestesi. Den kirurgiske tilnærmingen er vellykket i å utsette ryggmargen. Den traumer mekanismen kan produsere kontusjon skader på ryggmargen, som bekreftes av histologi, MRI, og nevrologisk undersøkelse. Til slutt regenererer ryggmargen fra skaden. Den kritiske trinn i protokollen er å fjerne spinous prosessene uten å påføre skade på ryggmargen. Dette trinnet krever opplæring for å sikre en sikker prosedyre. Videre er sår lukking svært avhengig av ikke å påføre unødig skade på huden undersnitt. Protokollen ble utført i en randomisert studie av 12 dyr.
Introduction
Det overordnede målet med denne studien var å etablere en kontrollert og reproduserbar mikrokirurgisk metode for å påføre sløv og skarp SCI til Axolotl (Ambystoma mexicanum), produsere en regenererende ryggmargsskade modell.
Sci er en alvorlig tilstand som, avhengig av nivå og utstrekning, påfører nevrologiske funksjonshemming til ekstremiteter sammen med nedsatt blære og tarm kontroll1,2,3. De fleste sci er et resultat av høy energi Blunt traumer som trafikkulykker og faller4,5. Skarpe skader er svært sjeldne. Derfor er den vanligste makroskopisk skade typen contusions.
Den pattedyr sentrale nervesystemet (CNS) er en ikke-regenererende vev, derfor ingen restaurering av nevrologiske vev etter sci er sett6,7,8. På den annen side, noen dyr har en spennende evne til å regenerere vev, inkludert CNS vev. En av disse dyrene er Axolotl. Det er mye brukt i studier av regenererende biologi og er av interesse for ryggmargen gjenfødelse, fordi det er en virveldyr9,10,11,12.
De fleste sci studier i Axolotl utføres som enten amputasjon av hele halen eller ablasjon av en større del av ryggmargen9,10,11,12. Nylig ble en ny studie publisert på stump skader13 som etterligner kliniske situasjoner bedre. Mens komplett vedheng amputasjon i Axolotl resulterer i full regenerering, noen ikke-amputasjon-baserte regenererende fenomener er avhengig av den kritiske størrelsen defekt (CSD)14,15. Dette betyr at skader som overskrider en kritisk terskel, ikke genereres på. For å utvikle en regenererende modell med høyere klinisk translational verdi, undersøkte denne studien om en 2 mm Butt traume ville overskride CSD-grensen.
Denne metoden er relevant for forskere som arbeider på ryggmargen regenerering i små dyremodeller, spesielt i Axolotl. Videre kan det være av mer generell interesse, fordi det viser en måte å bruke standard laboratorieutstyr for å utvikle en butt traume mekanisme som er egnet for bruk i små dyr generelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle gjeldende institusjonelle og statlige reguleringer vedrørende etisk bruk av dyr ble fulgt under denne studien. Studien ble utført under godkjenning ID: 2015-15-0201-0061 av den danske Animal Experiment Datatilsynet. Dyr var meksikanske axolotler (Ambystoma mexicanum, gjennomsnittlig kroppsmasse ± STD: 12,12 g ± 1,25 g).
1. forberedelse
-
Forbered Axolotl for anestesi.
- Bruk høykvalitets ikke kjemisk behandlet vann fra springen. Hvis det ikke er tilgjengelig, bruker du 40% Holtfreter løsning.
- Løs opp 200 mg av etanol 4-aminobenzoate (benzocaine) i 3 mL aceton. Oppløse denne løsningen i 1 L av vann fra springen eller 40% Holtfreter ' s løsning.
- Bruk en standard Petri parabol (100 mm i diameter) plassert under et stereo mikroskop som et kirurgisk bord. Plasser en kirurgisk tekstil klut på Petri parabolen.
Merk: Ved hjelp av en Petri parabolen som et kirurgisk område muliggjør flytting og rotasjon av dyret uten å berøre den, noe som sikrer spinal stabilitet under operasjonen. - Klargjør alle sterile mikrokirurgisk instrumenter (dvs. saks og anatomisk tang).
2. anestesi
- Plasser Axolotl i en beholder med benzocaine oppløsning i ca 45 min for å sikre dyp og stabil anestesi.
Merk: Den gitte konsentrasjonen av benzocaine vil forårsake anestesi i alle størrelser av axolotler. - Sjekk for tegn på narkose innen 30-45 min. Disse inkluderer en fullstendig mangel på gill bevegelser, rettende refleks, eller svar på enten taktile eller smertefulle stimuli (milde knipe av toe Web).
- For å opprettholde anestesi, Pakk dyrene i papirhåndklær fuktet i bedøvelse løsning. Fukt disse regelmessig med denne løsningen under den kirurgiske prosedyren for å sikre at huden og gjellene holdes fuktig.
- Gjenopprette dyret etter operasjonen ved å plassere den i en container som inneholder ferskvann fra springen. Observere tegn på utvinning, for eksempel Gill bevegelse og gjenvunnet rettende refleks, innen 1 t16.
3. mikrokirurgisk laminectomy
Merk: Laminectomy utføres under en stereomikroskopet.
- Plasser dyret i liggende posisjon på Petri parabolen. Pakk den i papirhåndklær slik at halen er eksponert.
Merk: Papiret håndklær er utmerket for å sikre stabilitet gjennom hele prosedyren. -
Identifiser bakbena. Gjør det første snittet bare caudal til dem.
- Med et par microscissors, utføre en vertikal snitt fra kjøl til bein prominence av spinous prosessene er filt.
Merk: Vær svært forsiktig når fatte kjøl og hud med pinsett, fordi disse lett påføre skade på sart hud. - Forlenge kuttet sideveis, slik at snittet passerer hele bredden av halen.
- Ta tak i spinous prosessen med tang for å sikre riktig dybde.
- Strekk den vertikale snitt 1 mm under spinous prosessen på begge sider.
- Med et par microscissors, utføre en vertikal snitt fra kjøl til bein prominence av spinous prosessene er filt.
-
Plasser dyret på den ene siden for å utføre ventrale og horisontale snitt som angitt nedenfor.
- Med et par microscissors, fra ventrale punktet av vertikal snitt, lage en horisontal snitt på ca 15 mm for dyr 10-20 g i vekt. Gjør snittet lenger for større dyr, og kortere for mindre dyr.
- Benytter saksen, analysere anteriort igjennom det horisontal innsnitt til vertebrale søylen er filt inne det midtlinjen.
- Gjenta trinn 3,3, 3.3.1 og 3.3.2 på den andre siden av dyret.
-
Etter å ha dissekert i den dype midtre planet fra begge sider, analysere gjennom midtlinjen, og dermed forbinder de to horisontale snitt.
- Flytt den frie delen av halen og kjøl til den ene siden, utsette spinous prosesser (figur 1).
- Fixate halen stykke med vått papirhåndklær.
-
Plasser dyret i liggende posisjon igjen med hodet vendt mot kirurgen ikke-dominerende side.
- Med et par tang, ta tak i spinous prosessene bare caudal til bakbena. Påfør en mild løft både opp og mot hodet av dyret.
- Plasser bladene på et par microscissors horisontalt rundt prosessen og skjær den forsiktig. Heisen på prosessen sikrer at den nå er fjernet, utsette ryggmargen.
- Ta tak i spinous prosessen bare caudal til en som nettopp ble fjernet og gjenta trinn 3.5.1 og 3.5.2.
Merk: Dette bør forlate en eksponert ryggmargen som tilsvarer to vertebrale nivåer. Når du utfører laminectomy, en hvit skummende sekresjon vises ofte. Ryggmargen er lett identifiseres ved sin karakteristiske glans, sammen med et fartøy som kjører langs midtlinjen. - Avhengig av størrelsen på dyret, kan det utsatte området ikke være bred nok. Bruk to par tang, ta tak i laminae på begge sider av ryggmargen og vri disse sidelengs med en skånsom bevegelse.
4. innføring av en Kontusjon type skade (figur 2)
- Hold dyret i liggende stilling.
- Bruk Petri parabolen å overføre dyret til traumer enheten.
- Ha en assistent skinne en lommelykt på ryggmargen.
- Plasser den kontusjon traume enhetens sylinder over den eksponerte ryggmargen ved hjelp av microadjusters på enheten. Sikt gjennom sylinderen.
- Senk sylinderen til den er Plant med laminae.
- Fest den fallende stangen til elektromagnet. Plasser den ønskede fallhøyde justeringssylinderen på traume enheten.
- Plasser den fallende stangen i sylinderen.
Merk: For en blindet studie, skal kirurgen nå forlate rommet uten å vite om dyret vil bli tildelt en skade eller humbug kirurgi gruppe. - Slå av elektromagnet. Stangen faller til den eksponerte ryggmargen.
- Bruk justeringsskruen for høyde for å løfte stangen fra ryggmargen.
- Bekreft skaden ved å se på ryggmargen gjennom mikroskopet. Den skadde området vil vises mørkere, og blødning fra midtlinjen fartøyet vil være tydelig.
5. innføring av en skarp skade
Merk: Utfør disse trinnene etter 3.5.4.
- Med et par microscissors kutte ryggmargen i en perfekt vertikal kutt.
- Gjenta kuttet 2 mm til den caudal siden av kroppen.
Merk: Lengden på den fjernede stykke ryggmargen kan justeres i henhold til studiet kravet. Men en 2 mm kutt vil være regenerable10. - Sørg for at kuttene er ferdige. Ved ferdigstillelse, føler bladene av saksen skraping langs den ventrale delen av spinal kanalen.
- Løft den 2 mm tykke ryggmargen fra rygg kanalen.
6. lukke Operasjonssåret
- Returner dyret til operasjonsbordet. I en blindet studie, Omplasser kjøl slik at ryggmargen er ikke synlig for kirurgen.
-
Hold dyret i liggende stilling.
- Begynn å plassere 10,0 nylon sting fra den mest caudal delen av horisontal snitt. Lukk sårene i ett lag.
Merk: Ikke ta tak i huden for stramt, fordi det vil påføre nekrose. - Arbeid mot den vertikale delen av snittet.
- Når du når vinkelen, snu Petri parabolen og Sutur den andre horisontale snitt.
- Sett sting på den vertikale snitt.
- Ikke plasser sting i den øverste delen av kjøl, fordi huden her ikke vil være i stand til å holde.
- Begynn å plassere 10,0 nylon sting fra den mest caudal delen av horisontal snitt. Lukk sårene i ett lag.
7. retur av dyret til bedøvelse-gratis løsning
- Løft Petri parabolen med dyret og senk begge svært forsiktig inn i ferskvann bare 5 cm dyp og la dyret gli av.
Merk: Den grunne vanndybden sikrer at dyret ikke vil forsøke å svømme til overflaten for å puste. - Ikke endre vann i løpet av den første uken.
- Når du mater dyrene, må du sørge for at maten er plassert i nærheten av dyrets hode.
Merk: Formålet med disse tiltakene er å unngå så mye bevegelse som mulig i løpet av den første uken.
8. postoperativ ultralyd
- Før avslutningen av anestesi, bruk en høyfrekvent ultralydsystem for å tilegne seg bilder av skaden som kan brukes til bygging av tredimensjonale bilder av SCI området.
- Fest svingeren til en micromanipulator som fortrinnsvis styres av en ekstern joystick.
- Senk anesthetized dyret i liggende posisjon i en liten container fylt med bedøvelse løsning.
Merk: Fest dyret med miniatyr sandsekker eller annet utstyr for å unngå bevegelse under skanne sekvensen. - Juster tuppen av svingeren med dyrets lengde akse, og senk den inn i den benzocaine oppløsningen til den bare er noen få millimeter over kjøl-enden bakbena på dyret.
- Identifiser SCI området.
Merk: Skaden nettstedet er lett gjenkjennelig på grunn av den manglende spinous prosessene rett over SCI. - Optimaliser bildet ved å justere ultralyds innstillingene. Kontroller at SCI området er i midten av bildet. Juster synsfeltet (dvs. bildedybde, Dybdeforskyvning og bildebredde) for å dekke SCI-området og tilstøtende friskt vev. Juster den todimensjonale forsterkningen for å optimalisere bildekontrasten.
- Ved å feie ultralyd svingeren over SCI området med en elektronisk operert micromanipulator, anskaffe B-modus bilder som dekker SCI området på flere sagittal tverrsnitt skive steder, med påfølgende skiver med en interslice intervall på 50 μm. Skaff deg Cine-bilder som inneholder 500 bilder med en bildefrekvens på ~ 50 frames/s og en svinger frekvens på 40 MHz.
Merk: Dette oppsettet krever en elektronisk micromanipulator styrt av en ekstern joystick (trinn 8,2). - Når du har fullført skannings sekvensen, går du tilbake til trinn 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Formålet med protokollen er å produsere en SCI som vil lamme motoren og sensoriske funksjoner caudal til skaden. Fordi Axolotl er regenerering-kompetent det gjenoppretter funksjon i løpet av uker, slik at forskere til å studere CNS regenerering i løpet av et kort tidsrom.
Anestesi ble gitt for 45 min til alle dyr, og ingen episoder av premature utvinning var erfarne. Alle dyrene utvinnes innen en time og viste ingen tegn til skade fra anestesi i de følgende ukene13,16.
Laminectomy var vellykket i alle dyr. Men anatomiske variasjoner i bredden av spinal kanalen oppfordret til utvidelse av kanalen ved hjelp av tang og en vri på noen individer. Videre hindret resterende laminae i noen individer den fallende stangen fra å nå sitt mål, og dermed gjør det viktig at kirurgen rense feltet fra den gjenværende ben og prominences.
Å stenge snittene var forbundet med noen vanskeligheter, spesielt under pilot fasen av studien. Sting i den øverste delen av kjøl ville ikke holde og resulterte i utilstrekkelig nedleggelser. Nedleggelsen av ett dyr i studien ikke holde, noe som resulterer i kjøl blir revet, påfølgende smitte, og død. Dette understreker behovet for forsiktig suturing langs hele snittene.
De første mekaniske skadene var åpenbare under inngrepet. Undermodell utvikling, skadde og humbug dyr ble farget med hematoksylin og eosin å validere skaden. Representative resultater fra hver gruppe er vist i Figur 3a1,a2 og Figur 3C1,C2. Regenerering ble bekreftet av histologiske seksjoner forberedelser etter ni uker (Figur 3B1,B2 og Figur 3D1,D2), som viste en gjenopprettet ryggmarg tilkobling i sci dyrene.
Skade og regenerering kan følges ved å undersøke nevrologisk funksjon. Å stimulere halen med en lett berøring og knipe fra pinsett vil avdekke om taktile og nociceptive sensoriske funksjoner har gått tapt og potensielt gjenopprettet. En nevrologisk poengsum ble definert basert på reaksjonen til dyret: 0 punkt = ingen respons, 1 poeng = lokal hale bevegelse, 2 poeng = koordinasjonen bevegelse, 3 poeng = koordinert bevegelse av lemmer og/eller hode sammen med koordinasjonen bevegelse, 4 poeng = dyr med umiddelbar koordinert rask bevegelse. I seks SCI dyr versus fem humbug dyr tap av nevrologisk funksjon tre uker etter skaden ble funnet, og en gradvis restaurering innen ni uker (Figur 4 og supplerende video 1).
Ultrasonografisk bilder av den skadde ryggmargen kan fås ved hjelp av protokollen ovenfor. Visualisering av SCI området var mulig på grunn av den åpenbare mangelen på bein spinous prosesser (figur 5). Videre kan det å bruke B-modus rygg arterien i uskadet ryggmarg være i en visning, noe som gir en markør av fartøyets integritet.
Det er mulig å teste dyrene umiddelbart etter gjenoppvåkning. Men noen dyr uttrykt lokal liten amplitude, repeterende og rytmisk hale bevegelse ved stimulering sammenlignes med klonus fenomener observert i menneskelig SCI. Disse bevegelsene kan representere klonus eller mangel på sentral refleks undertrykkelse og kan potensielt forårsake mer skade på den nylig skadde ryggmargen. Derfor testing dyrene er ikke anbefale før en uke etter skade.
Fra enkle kvalitative observasjon av dyrene, vil det være tydelig at halen er lammet, og svømming er betydelig hemmet, noe som gjør dyrene helt avhengig av å flytte sine lemmer. Disse observasjonene vil også validere suksessen til protokollen.
Høy-Field Mr-skanninger (9,4 T) ble utført umiddelbart etter skade for å visualisere skaden i vivo (figur 6). Imidlertid, det avsøker var vanligvis lav inne signal-å-bråk forhold sammenlignet med dem av ingen-operert dyrene, sikkert på grunn av blø og hemosiderin. Derfor ble det konkludert med at MRI var en suboptimal metode for å validere skaden og suksessen til protokollen.
Figur 1: skjematisk tegning av mikrokirurgisk laminectomy. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: skjematisk tegning av kontusjon traume mekanisme. (A) hele oppsettet, viser den fallende stangen over dyret. (B) demontert mekanisme, som viser hvordan stangen er koblet fra elektromagnet. (C) den fallende stangen er koblet til elektromagnet. Den fallende høyde justeringssylinderen er montert, og elektromagnet og stangen er lastet inn i sylinderen. Høydejustering av hele systemet styres av et justeringshjul. (D) å slå av elektromagnet vil føre til at stangen faller uten at operatøren berører systemet. Figur ble opprinnelig utgitt av Thygesen et al.13. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: histologiske seksjoner hematoksylin og eosin beiset umiddelbart og ni uker etter skade. (A1) SCI dyr umiddelbart etter skade. (B1) SCI dyr på ni uker. (C1) Humbug kirurgi dyr umiddelbart etter skade. (D1) Sham dyr på ni uker. Rød firkant = markerer skaden på SCI dyrene, og laminectomy av humbug dyret. Figur2A, figur 2B, figur 2C er forstørrelser av disse områdene på 5x. Blå pil = uskadet ryggmarg. Dette tallet ble opprinnelig utgitt av Thygesen et al.13. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Graf av respons på taktile stimuli. Responsen av SCI gruppene er lavere etter tre uker, sammenlignet med humbug gruppen. WPI = uker etter skade, svart linje = SCI, Grey Color = humbug. Humbug n = 5, SCI n = 6. Figur ble opprinnelig utgitt av Thygesen et al.13. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: ultrasonografisk bilde som viser ryggmargen i en sagittal seksjon. Gule streker markerer ryggmargen, gul sirkel skaden området, og hvite piler markere ryggsøylen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Mr skanner på ulike tidspunkt poeng etter skade eller humbug kirurgi. CSF rundt ryggmargen mangler, spesielt ved tre WPI for SCI dyret, indikerer hevelse i ryggmargen. Mørkere i ryggmargen indikerer ødem også. Legg merke til hvordan disse endringene forsvinner etter hvert som regenerering pågår. Gul pil = laminectomy område. Figur ble opprinnelig utgitt av Thygesen et al.13. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tilleggs video 1: Video som viser nevrologisk funksjon etter taktile stimuli og senere en nociceptive stimulans. Først en sunn kontroll dyr, og deretter et dyr som lider av SCI. please Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordi risikoen for skade på ryggmargen er betydelig, de kritiske trinnene i protokollen er å fjerne spinous prosesser og utvidelse av bein tilgang til spinal kanalen hvis nødvendig. Som nevnt i protokollen, å fjerne den mest skallen prosessen første er sterkt anbefalt. Dette vil bety at de mer caudal prosessene beskytte ryggmargen fra å bli truffet av saksen. Det anbefales å sikre nok kirurgisk tilgang, noe som betyr å ikke gjøre for lite en primær snitt. Også, når du griper noe med pinsett, må retningen på pull påføres alltid vurderes. Påføring av en skånsom trekke vekk fra ryggmargen vil beskytte den i tilfelle av grep sviktende og en slip av instrumentet.
Den kirurgiske prosedyren i Axolotl er ikke forskjellig fra andre dyr. Imidlertid finnes det visse viktige forskjeller, hovedsakelig knyttet til vevs sammensetningen og størrelsen på dyret. Den Axolotl kjøl huden er svært skjør, og paradoksalt ikke leges ikke godt på små skader påført undersnitt. Forsiktighet bør utvises, spesielt på den primære snitt, fordi skaden vil vesentlig komplisere suturing. Beina til svært unge axolotler er veldig myke. Dette betyr at ofte grunnleggende anatomiske tang kan være nok i bein fjerning. Dette gir et annet element av forsiktighet, fordi knipe de spinous prosessene kan påføre betydelige skader. Subkutan og muskel konseptkjedene lag er ikke tilgjengelig for suturing, på grunn av deres skjøre vev komposisjoner. Det er viktig å sikre en rolig postoperativ uke. Dyrene kan ikke hvile tilstrekkelig etter operasjonen. Dermed kan de påføre sekundær skade på ryggmargen postoperativt. Deres lille anatomi tillater ikke verken intern eller spline-fiksering.
Vekt og fallende høyde på fallende stang systemet er avgjørende for å påføre en kontusjon Kader. Under omfattende pilot for en tidligere studie var stang vekten og den fallende høyden som var nødvendig, funnet å være 25 g og 3 cm13. Dette var nok til å indusere lammelse i 12 g axolotler uten å skjære eller oppløsning ryggmargen. Lagt vekt eller fallende høyde kan være nødvendig i større dyr. Videre kan diameteren på fallende stang må være større i tilfelle av større dyr og kortere for mindre dyr.
Modellen har noen begrensninger. Fordi axolotler ikke brukes for lærde atferds studier, kan man ikke teste komplekse nevrologiske funksjoner. Skaden ble innført caudal til lemmer, sparsom bakbena og tarm og blære fra å bli lammet. Grunnen til dette var etisk, for å redusere innvirkningen på dyret til et minimum. Men begrenser det muligheten til å studere virkningene på lem bevegelser, som kan være lettere å beskrive og kategorisere. En stor del av SCI-Associated sykelighet stammer fra tap av kontroll av tarm og blære. Denne modellen tillater ikke fremtidig forskning på disse feltene. Påføre skade rostral til bakbena ville være mulig, men det ble ikke forsøkt.
Studere SCI i en regenererende modell som Axolotl gjør det mulig for en annen tilnærming i SCI forskning. Fordi dyret modellen kan regenerere, eliminering studier vil være i stand til å avdekke kritiske faktorer for regenerering. Konvensjonelle studier på SCI er utført i ikke-regenererende modeller, noe som betyr at man må gripe inn på alle kritiske faktorer for å indusere en regenererende respons.
Denne modellen og protokollen er i overensstemmelse med Krogh prinsipp som sier at: "for et så stort antall problemer vil det være noen dyr av valget eller noen få slike dyr som det kan være mest praktisk studert"17. Pattedyr regenerering er hemmet av flere faktorer. Hemme disse i en pattedyr modell vanligvis ikke induserer noen effekter. Imidlertid bør økende nivåer av hemmere i Axolotl eliminere regenerering, og dermed avdekke om at inhibitor er kritisk eller ikke10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Michael Pedersen, Aarhus University for sin ekspertise og tid på å utvikle MRI-protokoller og sette opp hele prosjektet. Peter Agger, Aarhus University for sin ekspertise og tid på å utvikle MRI-protokollene. Steffen Ringgard, Aarhus universitet for sin ekspertise og tid på å utvikle MRI-protokollene. Utviklingen av SCI-modellen i Axolotl var vennlig støttet av The A.P. Møller Maersk Foundation, The Riisfort Foundation, The linex Foundation, og The ELRO Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| Electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Kimwipes | |||
| Microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
- Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).
- Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. Bladder management and quality of life after spinal cord injury. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).
- Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population. Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).
- Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study. Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).
- Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).
- Aguayo, A. J., et al. Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).
- Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum. Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).
- Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. Regeneration of long spinal axons in the rat. Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).
- Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).
- Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat. Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).
- Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl. Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).
- McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres. Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).
- Thygesen, M. M., et al. A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail. Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).
- Goss, R. J. Principles of Regeneration. , Academic Press. New York. (1969).
- Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing. Bone. 40 (1), 45-56 (2007).
- Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
