Summary
Curcumin er en ideell fluoroforen for merking og bildebehandling av amyloid beta protein plaketter i hjernevevet på grunn av sin fortrinnsrett binding til amyloid beta protein så vel som dens strukturelle likheter med andre tradisjonelle amyloid bindende fargestoffer. Den kan brukes til å merke og bilde amyloid beta protein plaketter mer effektivt og rimelig enn tradisjonelle metoder.
Abstract
Deponering av amyloid beta protein (Aβ) i ekstra-og intracellulære områder er en av de kjennetegn patologi av Alzheimers sykdom (AD). Derfor er påvisning av tilstedeværelsen av Aβ i AD hjernevev et verdifullt verktøy for å utvikle nye behandlinger for å hindre progresjon av AD. Flere klassiske amyloid bindende fargestoffer, fluorokromkonjugert, Imaging sonder og Aβ-spesifikke antistoffer har blitt brukt til å oppdage Aβ histochemically i AD hjernevev. Bruk av disse forbindelsene for Aβ deteksjon er kostbart og tidkrevende. Men på grunn av sin intense fluorescerende aktivitet, høy affinitet, og spesifisitet for Aβ, samt strukturelle likheter med tradisjonelle amyloid bindende fargestoffer, curcumin (cur) er en lovende kandidat for merking og bildebehandling av Aβ plaketter i postmortem hjernevevet. Det er en naturlig polyphenol fra urten curcuma Longa. I denne studien, ble cur brukt til å histochemically etiketten Aβ plaketter fra både en genetisk mus modell av 5x familiær Alzheimers sykdom (5xFAD) og fra menneskelige AD vev i løpet av et minutt. Merkingen evne til cur ble sammenlignet med konvensjonelle amyloid bindende fargestoffer, slik som thioflavin-S (Alkyltiokarbamid-S), Kongo rød (CR), og fluoro-Jade C (FJC), samt Aβ-spesifikke antistoffer (6E10 og A11). Vi observerte at cur er den rimeligste og raskeste måten å merke og bilde Aβ plaketter i forhold til disse konvensjonelle fargestoffer og kan sammenlignes med Aβ-spesifikke antistoffer. I tillegg binder cur seg til de fleste Aβ arter, som oligomers og fibrils. Derfor kan cur brukes som den mest kostnadseffektive, enkle og raske fluorokromkonjugert Detection agent for Aβ plaketter.
Introduction
Alzheimers sykdom (AD) er en av de vanligste, alder-relaterte, progressive nevrologiske lidelser og en av de viktigste årsakene til dødsfall over hele verden1,2. Læring, hukommelse, og kognisjon svekkelse, sammen med nevropsykiatriske lidelser, er de vanligste symptomene manifestert i AD3. Selv om etiologi av AD ikke har blitt fullstendig belyst, kan de tilgjengelige genetiske, biokjemiske og eksperimentelle bevisene indikere at gradvis deponering av Aβ er en definitiv biomarkør for AD4. Denne misfolded protein akkumuleres i intracellulære og ekstracellulære områder og antas å være involvert i Synaptic tap, økt nevroinflammasjon, og neurodegeneration i kortikale og hippocampus områder i hjernen berørt av AD5. Derfor er histochemical deteksjon av Aβ i AD vev et avgjørende første skritt i å utvikle ikke-giftig, anti-amyloid medikamenter for å hindre AD progresjon.
I løpet av de siste ti årene, flere fargestoffer og antistoffer har blitt brukt av mange forskningslaboratorier for å merke og bilde Aβ plaketter i hjernevevet, men noen av disse metodene er tidkrevende og fargestoffer eller antistoffer som brukes er dyre, krever flere tilbehør Kjemikalier. Derfor vil utviklingen av et billig middel for påvisning av Aβ plaketter i AD hjernen være en velkommen nytt verktøy. Mange laboratorier begynte å bruke CUR, en lovende anti-amyloid naturlig polyphenol, for merking og bildebehandling Aβ, samt en terapeutisk agent for ad6,7,8,9. Dens hydrofobisiteten og lypophilic natur, strukturelle likheter med klassisk amyloid bindende fargestoffer, sterk fluorescerende aktivitet, samt sterk affinitet til å binde med Aβ gjør det til et ideelt fluoroforen for merking og bildebehandling av Aβ plaketter i AD tissue10 . Cur binder med Aβ-plaketter og oligomers og dens tilstedeværelse er også oppdaget i intracellulære mellomrom7,11,12,13. I tillegg har det vist seg at minimale beløp (1 − 10 nM) av cur kan merke Aβ plaketter i 5x familiær Alzheimers sykdom (5xFAD) hjernevev7. Selv om 1 nM konsentrasjonen ikke gir den optimale fluorescens intensitet for telling av Aβ plaketter, en 10 nM eller høyere konsentrasjon av cur gjør. Ran og kolleger14 rapporterte at doser så lavt som 0,2 nM av difluoroboron-derivatized cur kan oppdage in vivo Aβ innskudd nesten så vel som en infrarød sonde. Hvorvidt denne dosen er tilstrekkelig til å merke Aβ plaketter i vev er fortsatt ikke klart. De fleste tidligere studier har brukt 20 − 30 min for farging av Aβ plaketter med CUR, men optimale flekker kan kreve mye kortere tid.
Den nåværende studien ble utviklet for å teste den minste tiden som kreves av cur å merke Aβ plaketter i AD hjernevev og å sammenligne følsomheten for merking og bildebehandling av Aβ plaketter i hjernevev fra 5xFAD mus etter farging med cur med andre konvensjonelle Aβ-bindende fargestoffer, slik som Thioflavin-S (Alkyltiokarbamid-S), Kongo rød (CR), og fluoro-Jade C (FJC). Den Aβ merking evne til disse klassiske amyloid bindende fargestoffer ble sammenlignet med cur farging i parafin-embedded og kryostaten koronale hjernen seksjoner fra 5xFAD mus og fra alderen matchet menneskelig AD og kontroll hjernen vev. Funnene tyder på at cur etiketter Aβ plaketter på en måte som ligner på Aβ-spesifikke antistoffer (6E10) og moderat bedre enn Alkyltiokarbamid-S, CR, eller FJC. I tillegg, når intraperitoneal injeksjoner av cur til 5xFAD mus ble administrert for 2 − 5 dager, krysset den blod-hjerne-barrieren og bundet med Aβ plaketter7. Interessant, nanomolar konsentrasjoner av cur har blitt brukt til å merke og bilde Aβ plaketter i 5xFAD hjernevev7,14. Videre kan morfologisk distinkte Aβ plaketter, slik som kjerne, nevrittiske, diffuse, og utbrent plakk merkes av cur mer effektivt enn med noen av de andre konvensjonelle amyloid bindende fargestoffer7. Samlet sett kan cur brukes til å merke og bilde Aβ plaketter i postmortem hjernevev fra AD dyremodeller og/eller menneskelig AD vev på en enkel og rimelig måte, som et pålitelig alternativ til Aβ-spesifikke antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder som er beskrevet her er godkjent av Animal Care og use Committee (ACUC) av Saginaw Valley State University. Den menneskelige vev ble innhentet fra en etablert hjerne bank på banneret søndag helse instituttet i Arizona15,16.
1. av dyrene
- Klargjør bindemiddel og
- Forbered 0,1 M natrium fosfat buffer ved å tilsette 80 g natriumklorid (NaCl), 2 g kalium klorid (KCl), 21,7 g Disodium hydrogen fosfat (na2HPO4· 7H2O), 2,59 g kalium natriumdihydrogenfosfatmonohydrat fosfat (KH2PO4 ), og dobbelt destillert vann for å lage totalt 1 L.
- Forbered 4% paraformaldehyde (PFA).
- Tilsett 40 g paraformaldehyde til 1 L av PBS (0,1 M, pH 7,4).
- Varm opp PFA-løsningen til 60 − 65 ° c og bland med en magnetisk rører.
Merk: temperaturen bør ikke overstige 65 ° c. - Tilsett noen dråper NaOH (1 N) med en dropper for å oppløse PFA helt.
- Filtrer PFA-løsningen med middels til fint filter papir og oppbevares ved 4 ° c.
Merk: løsningen er god for en måned.
- Utføre dyr anestesi og.
Merk: tolv måneder gamle B6SJL-TG APP SwFlLon, PSEN1 * M146L * L286V, 1136799Vas/J (5 × FAD) alder-matchet kontroll mus (n = 6 per gruppe) ble kjøpt fra leverandører og oppdrettet i dyret huset til Saginaw Valley State University. Genotyperingteknologi ble bekreftet av polymerase kjedere reaksjon (PCR) som beskrevet tidligere7. Human AD hjernevev inkluderer postmortem AD hjernevev og alder-matchet kontroll vev.- Bedøve dyret med en hensiktsmessig anestesi middel, slik som natrium pentobarbital (390 mg/kg kroppsvekt), eller en ketamin/xylazine blanding (opp til 80 mg/kg kroppsvekt ketamin og 10 mg/kg kroppsvekt xylazine) ved intraperitoneal injeksjon (27 G nål og 1 mL sprøyte). Sjekk nivået av anestesi ved å knipe en tå. Hvis dyret ikke svarer, er det klart for kirurgi.
- Plasser anesthetized dyr i liggende posisjon på en type kirurgi skuffen og bruke små Iris saks gjøre et snitt til bakre enden av venstre ventrikkel.
- Sett en 22 G-nål i venstre ventrikkel og lag et lite snitt på høyre auricle for å fjerne væske fra kroppen. Bruk et-system for å la iskald væske (0,1 M PBS, pH 7,4) flyte i 5 − 6 min (strømningshastighet 20 − 25 ml/min).
Merk: en klar lever er indikatoren for optimal - Bytt buffer ventilen til en iskald 4% paraformaldehyde løsning for festing og la den flyte i 8 − 10 min.
Merk: tremor etterfulgt av herdet eller stive lemmer er indikatorer på god fiksering. - Fjern hjernen fra skallen ved hjelp av saks. Bruk en slikkepott, samle hjernen og legg den i et hetteglass med 4% PFA (minst 10x volumet av hjernen volum) og lagre ved 4 ° c til videre bruk.
2. vevs behandling
- Skjær kryostaten seksjoner.
- Overfør hjernen til gradert sukrose løsninger (10%, 20% og 30%) og oppbevares ved 4 ° c i 24 timer hver, til bruk.
- Ved hjelp av en kryostaten ved-22 ° c, kutt 40 μm-tykke seksjoner. Samle 10 − 20 seksjoner per brønn i en 6 brønn plate fylt med PBS og natrium Natriumazid (0,02%).
- Parafin legge inn seksjoner for mus og menneskelig hjernevev.
- For para fin seksjoner, tørke perfusert og 24 h post-fast hjernevev med gradert alkoholer (50%, 70%, 90%) for 2 timer hver, etterfulgt av 100% alkohol 2x for 1 time hver), og deretter med xylen 2x for 1 time hver) ved romtemperatur.
- Trenge inn i vevet med xylen-parafin (1:1) 2x for 1 time ved 56 ° c i et glass konisk kolbe dekket med aluminiumsfolie.
- Dypp vevet i smeltet parafin (56 ° c) for 4 − 6 timer.
- Skjær 5 μm-tykke seksjoner ved hjelp av en roterende mikrotomen ved romtemperatur og legg dem i et vannbad ved 45 ° c.
- Histochemically merke Aβ plaketter i kryostaten seksjoner med cur.
- Skyll delene fra trinn 2.1.2 med PBS (pH 7,4) 3x i 5 minutter hver.
- Dypp seksjonene i 70% etanol i 2 min ved romtemperatur.
- Oppløse lager cur (1 mM) i metanol og fortynnes med 70% etanol for å oppnå en endelig arbeids konsentrasjon på 10 μM.
- Senk seksjonene med den fungerende gjeldende løsningen for 1 − 5 min ved romtemperatur på en shaker ved 150 RPM.
- Kast cur løsning og vask med 70% etanol 3x for 2 min hver.
- Sett seksjonene på Poly-L-lysin belagt glass lysbilder og Monter med en dekkglass ved hjelp av organiske montering medier, for eksempel distyrene mykner xylen (DPX).
- Se under et fluorescens mikroskop med 480/550 NM eksitasjon/utslipps filtre.
- Histochemically merke Aβ plaketter i parafin-embedded mus og menneskelige hjerne seksjoner med cur.
- Deparaffinize vevs delene fra trinn 2.2.4 med xylen 2x i 5 minutter hver ved romtemperatur.
- Rehydrate med gradert alkohol løsninger (100%, 80%, 70%, 50% for 1 min hver) og med destillert vann 2x for 5 min hver ved romtemperatur.
- Beis seksjoner med cur (10 μM) i 10 min ved romtemperatur i mørket, risting ved 150 RPM. Vask med 70%, 90%, og 100% alkohol i 2 min hver.
- Klar med xylen 2x for 5 min hver og deksel slip med DPX.
- Visualiser under et fluorescens mikroskop som nevnt i trinn 2.3.7.
- Colocalize cur med Aβ-antistoff i Aβ plaketter og oligomers.
- Vask kryostaten seksjoner fra trinn 2.1.2 med PBS 3x i en 12 brønn plate.
- Blokker seksjonene med 10% normal geit serum (NGS) oppløst i PBS med 0,5% Triton-X-100 ved romtemperatur for 1 time.
- Forkast blokkerings løsningen. Ruge delene med Aβ-spesifikke antistoffer (6E10 eller A11, fortynnet 1:200) oppløst i frisk blokkerings løsning som inneholder 10% NGS og 0,5% Triton-X100 over natten ved 4 ° c i en shaker ved 150 o/min.
- Kast antistoff oppløsningen og vask seksjonene med PBS 3x i 10 minutter hver.
- Ruge med den sekundære antistoff-taggen med røde fluoroforen (f.eks. Alexa 594) for 1 time ved romtemperatur i mørket.
- Vask med PBS 3x i 10 minutter hver.
- Vask med 70% alkohol 1x.
- Ruge avsnittene med cur (10 μM) i 5 minutter ved romtemperatur.
- Vask med 70% alkohol 3x i 1 min hver.
- Tørke med 90% og 100% alkohol i 1 min hver, klar med xylen 2x for 5 min hver, og montere på lysbilder ved hjelp av DPX.
- Visualiser ved hjelp av et fluorescens mikroskop med egnede eksitasjon/utslipps filtre for de røde og grønne signalene.
- For intracellulære Aβ colocalization, beis seksjonene ved hjelp av Aβ-antistoff (6E10), restain med cur ved romtemperatur i mørket med risting ved 150 RPM, og counterstain med enten Hoechst-33342 (1 mg/ml) og/eller DAPI (1ug/ml) i 10 min ved romtemperatur i mørket med risting ved 150 RPM. Vask med PBS 3x.
- Ta bilder med de røde, grønne og blå filtrene med et 100-mål (total forstørrelse 1, 000x).
- Label Aβ plaketter med Alkyltiokarbamid-S, CR og FJC.
Merk: detaljerte protokoller for Alkyltiokarbamid-S og CR merking ble tidligere rapportert7.- For FJC farging, vask den frie-flytende seksjoner innhentet fra trinn 2.1.2 med PBS 3x for 5 min hver.
- Plasser seksjonene i en 12 brønn plate og beis med FJC (0,001%) i 10 minutter i mørket ved romtemperatur.
- Kast FJC løsning og vask med PBS 3x i 5 minutter hver.
- Ruge med ammonium klorid (NH4Cl, 50 mm OPPLØST i PBS) i 10 min ved romtemperatur.
- Kast NH4CL-løsningen og vask med PBS 3x i 5 minutter hver.
- Følg trinnene i avsnitt 2,4, tørke med graderte alkohol løsninger, klare, Monter og Vis under et fluorescens mikroskop med 450/520 NM eksitasjon/utslipps filtre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Curcumin etiketter Aβ plaketter i løpet av et minutt. Når vi beiset 5xFAD vev med CUR, fant vi at cur etiketten Aβ plaketter innen 1 min. Selv om økt inkubasjonstid med cur økte den fluorescens intensiteten til Aβ plaketter, var antallet observerte Aβ plaketter ikke signifikant forskjellig mellom 1 min og 5 min farge tid (figur 1).
Cur kan merke Aβ plaketter i kryostaten, parafin-embedded mus og menneskelig AD vev som colocalizes med Aβ-spesifikke antistoffer i mus AD hjernevev. Når vi beiset cryosection, parafin-embedded seksjoner (figur 2A) og Human ad vev (figur 2B), observerte vi cur-merket Aβ plaketter i alle typer vev seksjoner. I tillegg, for å bekrefte at cur er bindende for Aβ plaketter, vi først merket plaketter med 6E10, etterfulgt av cur farging. Vi observerte at cur var helt Co-lokalisert med Aβ på samme plakk som bandt 6E10 (figur 2C).
Cur merket Aβ oligomers og intracellulære Aβ aggregater. For å sjekke om cur kunne merke Aβ oligomers, var 5xFAD muse seksjoner farget med et Aβ oligomer-spesifikt antistoff (A11), etterfulgt av cur farging. Vi observerte at cur colocalized med A11 i Aβ plaketter (Figur 3A). Tilsvarende colocalized også med 6E10-antistoff i intracellulære områder (Figur 3B), noe som indikerer at det kan merke intracellulære Aβ.
Cur merket Aβ mer fremtredende enn klassisk amyloid bindende fargestoffer. Aβ merking av cur ble sammenlignet med kommersielt tilgjengelige amyloid bindende fargestoffer Alkyltiokarbamid-S, CR, FJC. Det Aβ antistoff 6E10 ble brukt som standardkontroll. Vi observerte at cur merket Aβ mer fremtredende enn de konvensjonelle amyloid bindende fargestoffer (Figur 4).
Cur derivater BIS-demethoxycurcumin (BDMC) og demethoxycurcumin (DMC), også til stede i gurkemeie ekstrakt, Label Aβ plaketter relativt til cur i 5xFAD hjernevev. To andre viktige komponenter, slik som BDMC og DMC, er til stede i gurkemeie ekstrakt. Vi testet om disse to forbindelsene også etiketten Aβ plaketter ligner cur. Når 5xFAD mus hjerne seksjoner ble farget med disse derivater, både BDMC og DMC også merket Aβ plaketter, parallelling cur (figur 5A). Ulike monterings medier ble undersøkt for å kontrollere for interferens med Aβ-Imaging etter farging med cur. Det fluorescerende signalet var intakt i både vandige og organiske monterings medier, for eksempel DPX (figur 5B). Den farging av Aβ plaketter med cur var hensiktsmessig etter immunofluorescent merking og etterfulgt av counterstaining med Hoechst 33342 løsning (1 mg/ml) eller 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1μg/ml). Immunofluorescent signaler og counterstaining intensitet ble opprettholdt etter gjeldende farging (figur 5C).
Figur 1: curcumin etiketter Aβ plaketter i løpet av et minutt. (A). Brain seksjoner fra 5xFAD mus eller menneskelig kontroll og ad kortikale vev ble farget med cur (10 μM) for 1 − 5 min og antall synlige plaketter ble telt. (B). ingen forskjell ble observert i antall Aβ-plakk teller mellom 1 min og 5 min farging ganger. Data representeres som gjennomsnittet ± standard feil av gjennomsnittlig (SEM). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Colocalization av cur med Aβ antistoff i Aβ plaketter. Cur kan merke Aβ plaketter i kryostaten, parafin-embedded seksjoner (A) og Human ad vev (B). Aβ merking parallelle merkingen med Aβ-spesifikt antistoff (6E10, DAB farging). (C). 5xFAD-seksjonene ble først merket med Aβ-antistoff (6E10), etterfulgt av farging med cur. Rød = 6E10 bundet av et sekundært antistoff merket med Alexa fluoroforen 594. Grønn = cur. Cur fullstendig colocalized med Aβ på samme plakk som bundet til 6E10. Piler angir Aβ plaketter. Scale-linjen indikerer 50 μm (total forstørrelse = 400x) i alle tre bildene til venstre, og 10 μm (total forstørrelse = 400x). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: curcumin etiketter Aβ oligomers og intracellulære Aβ. (A) Aβ-oligomer ble oppdaget immunohistochemically ved hjelp av et Aβ-spesifikt antistoff (A11), etterfulgt av farging med cur. Cur er fullstendig colocalized med Aβ, på samme oligomer der A11 binder. Scale bar = 250 μm og total forstørrelse = 100 a. (B) på samme måte ble intracellulære Aβ oppdaget immunohistochemically ved hjelp av et Aβ-spesifikt antistoff (6E10), etterfulgt av farging med cur. Merk at cur fullstendig colocalized med Aβ i de samme områdene bundet til 6E10. Scale bar = 50 μm og total forstørrelse = 1, 000x. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: sammenligning av ulike amyloid bindende fargestoffer med cur for å merke Aβ plaketter. Kryostaten seksjoner (40 μm) fra cortex av 12 måneder gamle 5xFAD mus ble farget med CUR, Thioflavin-S, Kongo rød, fluoro-Jade C, og med 6E10 antistoff. Cur merket Aβ plaketter mer fremtredende enn Alkyltiokarbamid-S, CR og FJC. Piler angir Aβ plaketter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: cur-derivater BIS-demethoxy curcumin og demethoxy curcumin også etiketten Aβ på samme måte som cur. (A) både kryostaten og parafin-embedded 5xFAD seksjoner ble farget med cur-derivater BIS-demethoxy curcumin og demethoxy curcumin. Begge disse derivater etiketten Aβ plaketter på en måte som ligner på cur. (B) både vandige og organiske monterings medier (dpx) ble brukt til å montere vevs deler etter merking av Aβ plaketter med cur. (C) Immunolabeled seksjoner ble brukt til Aβ merking med cur. De hvite pilene indikerer Aβ plaketter, den grønne pilen indikerer aktivert astrocytt (GFAP), og den gule pilen indikerer kjernefysisk beis (DAPI). Skala bars = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Funksjoner | Aβ-antistoff | Curcumin | Alkyltiokarbamid-S | Kongo rød | Fluoro-Jade C |
| Varighet av farging | ~ 24-48 h | ~ 1-5 min | ~ 10 min | ~ 60 min | ~ 30 min |
| Kjemikalier til tilbehør | Sekundære antistoffer, flere kjemikalier for å gjøre buffer, normal geit serum | Metanol | Etanol | NaOH og etanol | NaOH og etanol, kalium kaliumpermanganat |
| Kostnad | Kostbart: et Aβ antistoff hetteglass krever ~ $200-300 | Kostnadseffektiv: ~ $5-10/1 g cur og kan brukes for mange vev | Kostnadseffektiv: ~ $5/1 g, kan anvendes for noen vev | Kostnadseffektiv: > $5/1 g Kongo rød, og kan brukes for flere vev | Kostbart: ~ $15.500/1 g FJC pulver |
| Spesifisitet | Ulike antistoffer er nødvendige for Aβ oligomers og fibrils | Curcumin binder seg til Aβ oligomers og fibrils | Kan binde bare fibrils, ikke monomerer, eller oligomers | Kan bare binde med Aβ-protofibrils og fibrils16, 17 | Kan bare binde med Aβ-fibrils og utartet neurons |
| Stabilitet | Avhengig av fargestoff festet til sekundær antistoff | Veldig stabil, selv ved romtemperatur når den er bundet med Aβ | Stabil i metanol | Stabil i etanol | Ikke stabil |
| Care etter farging | Trenger ekstra forsiktighet etter farging, som blir holdt i mørket og frosset hele tiden | Ikke så lett følsom og mer stabil ved romtemperatur | Lysfølsom | Ikke lysfølsom | Lysfølsom |
| Mikroskop kreves | Sammensatt lys eller fluorescerende (avhengig av bruk av sekundær antistoff) | Fluorescerende | Fluorescerende | Lett mikroskop eller polarisert mikroskop eller polariserer filter | Fluorescerende |
| Farging av bakgrunn | Vanligvis ingen bakgrunn | Svært lav bakgrunn | Høy bakgrunn på grunn av binding med lipid membran eller lipid forbindelser i celle | Lav bakgrunn | Høy bakgrunn |
| In vivo Aβ-Imaging | Gjelder kanskje ikke | Svært aktuelt | Gjelder kanskje ikke | Gjelder kanskje ikke | Gjelder kanskje ikke |
Tabell 1: sammenligning av Aβ merking med forskjellige amyloid bindende fargestoffer og cur7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår hypotese var at cur kunne brukes som den raskeste, enkleste og minst kostbare måten å merke og bilde Aβ plaketter i postmortem AD hjernevevet sammenlignet med andre klassiske amyloid bindende fargestoffer, samt Aβ-spesifikke antistoffer. Målet med denne studien var å bestemme den minste tiden som kreves for å merke og bilde Aβ plaketter av cur i postmortem AD hjernevev og avgjøre om cur kan brukes som et alternativ til Aβ antistoff for merking Aβ plaketter. For dette formål ble den Aβ-merking evne til cur observert på ulike tidspunkt poeng. Cur kunne merke Aβ innen ett minutt. I tillegg var merkingen av Aβ ved cur større enn andre konvensjonelle amyloid bindings fargestoffer, slik som Alkyltiokarbamid-S (0,1%), CR (1%) og FJC (0,001%).
Cur regnes som en unik og ideell fluoroforen for Aβ merking, fordi den har de fleste egenskaper besatt av de fleste av de konvensjonelle amyloid bindende fargestoffer, inkludert strukturelle, fysiske, kjemiske og biologiske egenskaper10. I tillegg, på grunn av rimelig, de fleste forskere er interessert i å bruke denne naturlige polyphenol. For å vise det spesielle ved gjeldende binding til Aβ plaketter og oligomers, brukte vi 6E10 og A11 (Aβ-oligomer-spesifikt antistoff). Cur viste nesten komplett colocalization med alle de forskjellige artene av Aβ til stede i vevet, noe som tyder på at cur er svært spesifikk for Aβ7,17,18,19,20. I tillegg er cur merket Aβ oligomers (Figur 3A) og intracellulære Aβ aggregater (Figur 3b) og colocalized med Aβ antistoffer (figur 2b), noe som tyder på at cur kan merke ikke bare ekstracellulære Aβ plaketter, men også Aβ avsatt i intracellulære mellomrom7.
I løpet av de siste ti årene har flere fluorophores og antistoffer blitt utviklet for å merke og bilde Aβ plaketter histochemically. Utvilsomt, de fleste av dem er svært spesifikke for målrettede Aβ arter og for å oppdage Aβ plaketter, men disse er mye dyrere og bruken er mer tidkrevende enn å bruke cur. For eksempel sammenlignet vi Aβ plakk binding av cur, med andre amyloid bindings fargestoffer, slik som Alkyltiokarbamid-S, CR og FJC, der Aβ-spesifikt antistoff (6E10) ble brukt som referanse kontroll. Disse resultatene tyder på at cur etiketter Aβ plaketter sterkere enn noen av de andre fluorophores. Viktigst, i forhold til CUR, noen av de mer brukte fluorophores har distinkte ulemper når det gjelder merking og Imaging Aβ. For eksempel, Alkyltiokarbamid-S kan produsere en distraherende, høy bakgrunn fordi det binder med lipid membraner eller lipid forbindelser i cellen21. Tilsvarende, CR, som vanligvis brukes til å merke Aβ, produserer Eple grønn birefringence (Figur 4) under et polarisert mikroskop. CR ikke Label Aβ-plaketter så lett som gjør cur eller alkyltiokarbamid-S, merking betydelig færre Aβ plaketter enn de som er oppdaget av cur7,22,23. Gutierrez et al. rapporterte at FJC, som kan binde med Aβ og med utartet neurons, etiketter på en lavere frekvens enn enten cur eller Alkyltiokarbamid-S24. Disse resultatene tyder på at disse brukte klassiske markører har mindre affinitet for binding til Aβ plaketter enn cur.
I tillegg kan merking av ulike typer Aβ (kjerne, nevrittiske, diffuse, utbrent) optimaliseres med CUR, i stedet for andre amyloid bindende fluorophores, fordi cur kan bidra til å visualisere og skille morfologisk forskjellige Aβ plaketter, mens andre teknikker ikke klarer å skille disse morfologiske under typer7. På samme måte er bruken av Aβ-spesifikke antistoffer, som er svært spesifikke for ulike arter av Aβ, svært kostbart og tidkrevende, og tar minst 24 − 48h via immunhistokjemi. Videre oppdager ulike arter av Aβ krever ulike antistoffer, samt flere tilbehør kjemikalier, som i betydelig grad legger til den totale kostnaden. Klart, CUR er mindre kostbart, lettere tilgjengelig, og produserer høyere fluorescens intensitet når det binder seg til Aβ plaketter. Selv CR er også en relativt kostnadseffektiv teknikk for merking og bildebehandling av Aβ plaketter, CUR kan binde og merke flere av Aβ arter, for eksempel oligomers25 (Figur 3 og Figur 4), mens CR bare binder seg til protofibrils og fibrils23. Derfor kan Aβ merking med cur oppnås mer effektivt og kostnadseffektivt enn ved Alkyltiokarbamid-S, CR eller FJC (tabell 1).
Oppsummert kan cur oppdage Aβ plaketter og oligomers fra AD hjernevev effektivt, raskt og rimelig. I tillegg er cur binding til Aβ svært spesifikk og dens fluorescerende aktivitet er svært stabil. Det krever minimale beløp (1-10 nM) for å merke Aβ. Videre er cur også svært spesifikk for ulike Aβ arter, slik som fibrils eller plaketter, samt oligomers7. Tilsvarende, CUR derivater demethoxycurcumin og bisdemethoxycurcumin også Harbor amyloid bindende egenskaper og c Label Aβ tilsvarende til cur10 (figur 5A). Derfor er cur en ideell fluoroforen for merking og bildebehandling av Aβ plaketter i postmortem hjernevev. Den kan brukes som en hastig og lett alternativ å merker Aβ plakk belaste etter anti-amyloid terapi inne eksperimentelle dyr modeller av annonse. Våre funn bekrefter rapporter om høy affinitet av cur til Aβ, forsterke dens potensielle bruk for overvåking Aβ-plaketter i postmortem hjernen og i levende vev.
For optimal gjeldende merking anbefales det ikke å merke Aβ med cur i unperfused vev og for å unngå langvarig vevs lagring, da det kan gi en større mengde bakgrunn, selv når perfusert. For colabeling anbefales det å fullføre immunhistokjemi først med det spesifikke antistoff som brukes før farging med cur og deretter følge dette med mot flekker ved hjelp av DAPI eller Hoechst.
Mulige modifikasjoner på denne metoden inkluderer å øke inkubasjonstiden av cur med vevet i opptil 30 min, noe som ikke vil forstyrre signal intensiteten, selv om det kan øke bakgrunnen mens bildebehandling. Redusert konsentrasjon av cur til mindre enn 10 μM forstyrrer ikke Aβ merking til et betydelig nivå. For å redusere bakgrunnen for humant hjernevev, kan en alternativ Forberedelses metode anvendes. Hjerne deler kan for eksempel i utgangspunktet behandles med 0,3% (w/v) Sudan Black B i 70% etanol (v/v) i 10 minutter ved romtemperatur. Deretter kan seksjonen bli farget med cur i 10 min ved romtemperatur, og vasket med PBS 3x i 15 min, counterstained, og montert med antifading Media13. Kryostaten snitt tykkelser kan også reduseres til 20 − 25 μm.
Potensielle begrensninger på denne metoden inkluderer cur bindende med Aβ tilstede i blodkarene, som er forskjellig fra ekstracellulære Aβ plaketter. Dermed bør etterforsker være klar over morfologi av Aβ plaketter og oligomers fra Aβ i blodkar. Etterforsker bør være oppmerksom på Auto-fluorescerende signaler. Overflødig grønn bakgrunn kan sees innimellom etter cur farging, men dette kan reduseres ved å redusere farging tid eller ved å redusere konsentrasjonen av cur. Til slutt kan signalet for colabeling med andre markører reduseres på grunn av gjentatte behandlinger med clearing agenten (for eksempel xylen).
Viktige begrensninger inkluderer manglende evne til å colabel med noen markør protein med sekundært antistoff merket med grønt fluorescerende fargestoff, for eksempel fluorescerende isothiocyanate (FITC). Disse kan ikke brukes på grunn av tilsvarende eksitasjon/utslipp av cur. Også i de tidlige stadiene av AD, kan bare begrensede mengder Aβ merkes av cur. Til slutt er det behov for å gjøre arbeid i mørke omgivelser som noen fluorescerende fargestoff.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Støtte for denne studien kom fra Field Neurosciences Institute på Ascension of St. Mary ' s.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | IHC world, Woodstock, MD | ||
| Aanimal model of Alzheimer's disease | Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME | ||
| Absolute alcohol | VWR,Radnor, PA | ||
| Alexa 594 | Santacruz Biotech, Dallas, TX | ||
| Antibody 6E10 | Biolegend, San Diego, CA | ||
| Antibody A11 | Millipore, Burlington, MA | ||
| Compound light microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus BX51 | |
| Congo red | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Cryostat | GMI, Ramsey, MN | LeicaCM1800 | |
| Curcumin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Dystyrene plasticizer xylene | BDH, Dawsonville, GA | ||
| Filter papers | Fisher scientific, Pittsburgh, PA | ||
| Hoechst-33342 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Inverted fluorescent microscope | Leica, Buffalo Grove, IL | Leica DMI 6000B | |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus 1x70 | |
| Normal goat serum | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraffin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Ploy-lysine coated charged glass slide | Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ | ||
| Potassium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium azide | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium hydroxide | EMD Millipore, Burlington, MA | ||
| Sodium pentobarbital | Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI | ||
| Thioflavin-S | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Triton-X-100 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Xylene | VWR,Radnor, PA |
References
- Cummings, J. L. Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 351 (1), 56-67 (2004).
- Jack, C. R., Holtzman, D. M. Biomarker modeling of Alzheimer's disease. Neuron. 80 (6), 1347-1358 (2013).
- Tarawneh, R., Holtzman, D. M. The clinical problem of symptomatic Alzheimer disease and mild cognitive impairment. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (5), (2012).
- Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer's and Parkinson's diseases. Nature Cell Biology. 6 (11), 1054-1061 (2004).
- Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer's disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
- Chen, M., et al. Use of curcumin in diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer's disease. Neural Regeneration Research. 13 (4), 742-752 (2018).
- Maiti, P., et al. A comparative study of dietary curcumin, nanocurcumin, and other classical amyloid-binding dyes for labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue of 5x-familial Alzheimer's disease mice. Histochemistry and Cell Biology. 146 (5), 609-625 (2016).
- Maiti, P., Dunbar, G. L. Use of Curcumin, a Natural Polyphenol for Targeting Molecular Pathways in Treating Age-Related Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2017).
- Maiti, P., Dunbar, G. L. Comparative Neuroprotective Effects of Dietary Curcumin and Solid Lipid Curcumin Particles in Cultured Mouse Neuroblastoma Cells after Exposure to Abeta42. International Journal of Alzheimer's Disease. , (2017).
- den Haan, J., Morrema, T. H. J., Rozemuller, A. J., Bouwman, F. H., Hoozemans, J. J. M. Different curcumin forms selectively bind fibrillar amyloid beta in post mortem Alzheimer's disease brains: Implications for in-vivo diagnostics. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 75 (2018).
- Koronyo, Y., et al. Retinal amyloid pathology and proof-of-concept imaging trial in Alzheimer's disease. JCI Insight. 2 (16), (2017).
- Koronyo, Y., Salumbides, B. C., Black, K. L., Koronyo-Hamaoui, M. Alzheimer's disease in the retina: imaging retinal abeta plaques for early diagnosis and therapy assessment. Neurodegenerative Diseases. 10 (1-4), 285-293 (2012).
- Koronyo-Hamaoui, M., et al. Identification of amyloid plaques in retinas from Alzheimer's patients and noninvasive in vivo optical imaging of retinal plaques in a mouse model. NeuroImage. 54 (Suppl 1), S204-S217 (2011).
- Ran, C., et al. Design, synthesis, and testing of difluoroboron-derivatized curcumins as near-infrared probes for in vivo detection of amyloid-beta deposits. Journal of the American Chemical Society. 131 (42), 15257-15261 (2009).
- Beach, T. G. The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: Description and Experience, 1987-2007. Cell Tissue Bank. 9 (3), 229-245 (2008).
- Green, S. J., Killiany, R. J. Subregions of the inferior parietal lobule are affected in the progression to AD. Neurobiology of Aging. 31 (8), 1304-1311 (2010).
- Ono, K., Hasegawa, K., Naiki, H., Yamada, M. Curcumin has potent anti-amyloidogenic effects for Alzheimer's beta-amyloid fibrils in vitro. Journal of Neuroscience Research. 75 (6), 742-750 (2004).
- Garcia-Alloza, M., Borrelli, L. A., Rozkalne, A., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. Curcumin labels amyloid pathology in vivo, disrupts existing plaques, and partially restores distorted neurites in an Alzheimer mouse model. Journal of Neurochemistry. 102 (4), 1095-1104 (2007).
- Mutsuga, M., et al. Binding of curcumin to senile plaques and cerebral amyloid angiopathy in the aged brain of various animals and to neurofibrillary tangles in Alzheimer's brain. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (1), 51-57 (2012).
- Tei, M., Uchida, K., Mutsuga, M., Chambers, J. K., Nakayama, H. The binding of curcumin to various types of canine amyloid proteins. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (4), 481-483 (2012).
- Liu, L., Komatsu, H., Murray, I. V., Axelsen, P. H. Promotion of amyloid beta protein misfolding and fibrillogenesis by a lipid oxidation product. Journal of Molecular Biology. 377 (4), 1236-1250 (2008).
- Wu, C., Scott, J., Shea, J. E. Binding of Congo red to amyloid protofibrils of the Alzheimer Abeta(9-40) peptide probed by molecular dynamics simulations. Biophysical Journal. 103 (3), 550-557 (2012).
- Wu, C., Wang, Z., Lei, H., Zhang, W., Duan, Y. Dual binding modes of Congo red to amyloid protofibril surface observed in molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 129 (5), 1225-1232 (2007).
- Gutierrez, I. L., et al. Alternative Method to Detect Neuronal Degeneration and Amyloid beta Accumulation in Free-Floating Brain Sections With Fluoro-Jade. ASN Neuro Methods. 10, 1-7 (2018).
- Yang, F., et al. Curcumin inhibits formation of amyloid beta oligomers and fibrils, binds plaques, and reduces amyloid in vivo. Journal of Biological Chemistry. 280 (7), 5892-5901 (2005).
