Summary
Curcumin은 아밀로이드 베타 단백질에 우선적으로 결합하고 다른 전통적인 아밀로이드 결합 염료와의 구조적 유사성으로 인해 뇌 조직에서 아밀로이드 베타 단백질 플라크의 라벨링 및 이미징에 이상적인 플루오로폴링입니다. 아밀로이드 베타 단백질 플라크를 기존의 방법보다 더 효율적이고 저렴하게 라벨을 부착하고 이미지화하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
아밀로이드 베타 단백질 (Aβ)의 증착은 엑스트라 및 세포 내 공간에서 알츠하이머 병 (AD)의 특징적인 병리학 중 하나입니다. 따라서 AD 뇌 조직에서 Aβ의 존재를 검출하는 것은 AD의 진행을 방지하기 위한 새로운 치료법을 개발하기 위한 유용한 도구이다. 몇몇 고전적인 아밀로이드 결합 염료, 형광질, 화상 진찰 프로브 및 Aβ 특이적 항체는 AD 뇌 조직에서 Aβ 조직화학적으로 검출하기 위하여 이용되었습니다. Aβ 검출을 위해 이러한 화합물을 사용하는 것은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸립니다. 그러나, 그것의 강렬한 형광 활동 때문에, 높은 친화성, 및 Aβ를 위한 특이성, 전통적인 아밀로이드 결합 염료를 가진 구조적인 유사성, curcumin (Cur) 사후 에 Aβ 패의 표지 그리고 화상 진찰을 위한 유망한 후보입니다 뇌 조직. 허브 쿠르쿠마 롱가에서천연 폴리페놀입니다. 본 연구에서, Cur는 5x 가족 성 알츠하이머 병 (5xFAD)의 유전 마우스 모델과 1 분 이내에 인간 AD 조직모두에서 조직 화학적으로 Aβ 플라크를 라벨로 지정하는 데 사용되었습니다. 큐어의 라벨링 능력은 티오플라빈-S(Thio-S), 콩고 레드(CR), 플루오로옥 C(FJC) 뿐만 아니라 Aβ 특이적 항체(6E10 및 A11)와 같은 기존의 아밀로이드 결합 염료와 비교되었다. 우리는 Cur가 이러한 기존 염료와 비교할 때 Aβ 플라크에 라벨을 부착하고 이미지화하는 가장 저렴하고 가장 빠른 방법이며 Aβ 특이적 항체와 비교할 수 있다는 것을 관찰했습니다. 또한, Cur는 올리고머 및 피브릴과 같은 대부분의 Aβ 종과 결합합니다. 따라서 Cur는 Aβ 플라크에 대한 가장 비용 효율적이고 간단하며 빠른 형광크롬 검출제로 사용될 수 있습니다.
Introduction
알츠하이머병(AD)은 가장 흔한, 연령과 관련된 진행성 신경 질환 중 하나이며 전 세계적으로 사망의 주요 원인 중하나인 1,2. 학습, 기억, 인식 장애, 신경 정신 장애와 함께,AD에명시 된 일반적인 증상 3 . AD의 병인학이 완전히 해명되지는 않았지만, 사용 가능한 유전적, 생화학적 및 실험적 증거는 Aβ의 점진적증착이 AD4에대한 최종 바이오마커임을 나타낸다. 이 잘못 접힌된 단백질세포 내 및 세포 외 공간에 축적 하 고 시 냅 스 손실에 관여 하는 것으로 생각 됩니다., 증가 neuroinflammation, 그리고 AD에 의해 영향을 받는 뇌의 피 질과 해 마 영역에서 신경 변성5. 따라서 AD 조직에서 Aβ의 조직화학적 검출은 AD 진행을 방지하기 위한 무독성, 항아밀로이드 약물을 개발하는 데 있어 중요한 첫 번째 단계이다.
지난 수십 년 동안, 몇몇 염료 및 항체는 두뇌 조직에 있는 Aβ 패를 표지하고 심상하기 위하여 많은 연구 실험실에 의해 이용되었습니다, 그러나 이 방법의 몇몇은 시간이 소모되고 사용된 염료 또는 항체는 고가, 몇몇 부속을 요구합니다 화학 물질. 따라서 AD 뇌에서 Aβ 플라크를 저렴한 검출 수단으로 개발하면 환영받을 수 있는 새로운 도구가 될 것입니다. 많은실험실은 AD6,7,8,9의치료제뿐만 아니라 라벨링 및 이미징을 위한 유망한 항 아밀로이드 천연 폴리페놀인 Cur를 사용하기 시작했습니다. 그것의 소수성 및 lypophilic 성격, 고전적인 아밀로이드 결합 염료와 구조적 유사성, 강한 형광 활동, Aβ와 결합하는 강한 친화력은 AD 조직 10에 있는 Aβ 플라크의 표지 그리고 화상 진찰을 위한 이상적인 형광포를 만듭니다10 . Aβ 플라크와 올리고머와 의 큐바인드의 존재는 또한 세포 내 공간7,11,12,13에서검출된다. 또한, 5xFAD(5xFAD) 뇌조직에서Aβ 플라크를 5x로 라벨을 붙일 수 있는 최소량(1-10 nM)이 7로 나타났다. 1 nM 농도가 Aβ 플라크의 계수를 위한 최적의 형광 강도를 제공하지는 않지만, 10 nM 이상의 Cur 농도가 그렇습니다. Ran 및 동료14는 디플루오로보론 유도물의 0.2 nM의 낮은 용량이 적외선 프로브뿐만 아니라 생체 내 Aβ 침전물을 거의 검출할 수 있다고 보고했다. 이 복용량은 조직에 Aβ 플라크를 라벨에 충분 여부는 아직 명확 하지 않다. 대부분의 이전 연구는 Cur를 사용하여 Aβ 플라크염색에 20-30분 동안 사용했지만, 최적의 염색은 훨씬 적은 시간이 필요할 수 있습니다.
본 연구는 AD 뇌 조직에 Aβ 플라크를 라벨링하기 위해 Cur가 요구하는 최소 시간을 테스트하고 다른 기존 마우스와 함께 Cur로 염색한 후 5xFAD 마우스에서 뇌 조직의 Aβ 플라크의 라벨링 및 이미징에 대한 민감도를 비교하도록 설계되었습니다. Aβ 결합 염료, 예컨대 티오플라빈-S (티오-S), 콩고 레드 (CR), 및 플루오로 옥 C (FJC). 이러한 고전적인 아밀로이드 결합 염료의 Aβ 라벨링 능력은 5xFAD 마우스및 노화된 인간 AD 및 대조뇌 조직으로부터 파라핀 내장 및 저온 코로나 뇌 섹션에서 의 Cur 염색과 비교되었다. 연구 결과는 Cur 가 Aβ 특이적 항체(6E10)와 유사한 방식으로 Aβ 플라크를 분류하고 티오-S, CR 또는 FJC보다 적당히 더 우수하다고 제안합니다. 또한, 5xFAD 마우스에 대한 경막내 주사를 2-5일 동안 투여했을 때, 혈액-뇌 장벽을 교차시키고 Aβ 플라크7과결합하였다. 흥미롭게도, Cur의 나노몰 농도는 5xFAD 뇌 조직에서 Aβ 플라크를 표지하고 이미지화하는 데 사용되어 왔으며7,14. 더욱이, 코어, 신경염, 확산 및 연소플라크와 같은 형태학적으로 구별되는 Aβ 플라크는 다른 종래의 아밀로이드 결합 염료7보다더 효율적으로 Cur에 의해 표지될 수 있다. 전반적으로, Cur는 Aβ 특이적 항체에 대한 신뢰할 수 있는 대안으로서 AD 동물 모델 및/또는 인간 AD 조직에서 의 사후 뇌 조직에 라벨 및 이미지 Aβ 플라크를 쉽고 저렴한 방법으로 적용할 수 있다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 방법은 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다 (ACUC) 새기너 밸리 주립 대학의. 인간 조직은 애리조나에 있는 배너 선 건강 연구소에 있는 확립된 두뇌 은행에서 장악되었습니다15,16.
1. 동물의 관류
- 고정 및 관류 버퍼를 준비합니다.
- 염화나트륨 80g(NaCl), 염화칼륨 2g(KCl), 21.7 g의 디소듐 수소 인산염(Na2HPO4·7H2O),디수소 인산화칼륨 2.59g(KH2 PO4)을 첨가하여 0.1M 인산나트륨 완충액을 준비합니다. ) 및 이중 증류수를 사용하여 총 1L을 만듭니다.
- 4% 파라포름알데히드(PFA)를 준비합니다.
- 파라포름알데히드 40 g을 PBS 1L(0.1M, pH 7.4)에 넣습니다.
- PFA 용액을 60-65°C로 가열하고 마그네틱 교반기를 사용하여 혼합합니다.
참고: 온도가 65°C를 초과해서는 안 됩니다. - PA를 완전히 용해시키기 위해 드롭퍼와 함께 NaOH (1 N) 몇 방울을 넣습니다.
- 중간 에서 미세 필터 용지로 PFA 용액을 걸과 4 °C에서 보관하십시오.
참고 : 솔루션은 한 달 동안 좋습니다.
- 동물 마취와 관류를 수행합니다.
참고: 12개월 된 B6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J (5×FAD) 연령일치 대조군 마우스(그룹당 n = 6)는 공급업체에서 구입하여 새기노 밸리 주립 대학의 동물 집에서 사육되었습니다. 게노티핑은 앞서7일설명한 바와 같이 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 확인되었다. 인간 AD 뇌 조직은 사후 AD 뇌 조직 및 연령 일치 대조 조직을 포함한다.- 펜토바르비탈 나트륨(체중 390 mg/kg 체중) 또는 케타민/자일라진 혼합물(최대 80 mg/kg 체중 케타민 및 10 mg/kg 체중 자일라진)과 같은 적절한 마취제로 동물을 심상 주사(27 G 바늘 및 1)로 마취시 mL 주사기). 발가락을 꼬집어 마취 수준을 확인하십시오. 동물이 반응하지 않으면 관류 수술을 받을 준비가 됩니다.
- 관류 수술 트레이에 척추 위치에 마취 된 동물을 놓고 작은 홍채 가위를 사용하여 좌심실의 후부 끝을 절개합니다.
- 좌심실에 22G 관류 바늘을 삽입하고 바디에서 관류 액체를 제거하기 위하여 우측 귀덮개에 작은 절개를 합니다. 중력 공급 관류 시스템을 사용하여 얼음 차가운 관류 유체 (0.1 M PBS, pH 7.4)가 5-6 분 (유량 20-25 ml / 분)동안 흐를 수 있도록하십시오.
참고: 명확한 간은 최적의 관류의 지표입니다. - 버퍼 밸브를 얼음으로 차가운 4% 파라포름알데히드 용액으로 전환하여 고정하고 8-10분 동안 흐르게 하십시오.
참고 : 경화 또는 뻣뻣한 사지 뒤에 떨림은 좋은 고정의 지표입니다. - 가위를 사용하여 두개골에서 뇌를 제거합니다. 주걱을 사용하여, 뇌를 수집하고 4 % PFA의 바이알에 배치 (적어도 10 배 의 뇌 볼륨의 부피) 및 추가 사용 될 때까지 4 °C에서 저장.
2. 조직 처리
- 저온 절편을 잘라냅니다.
- 등급이 매겨진 자당 솔루션으로 뇌를 전달(10%, 20%, 30%) 사용 전까지 각각 24시간 동안 4°C에서 보관하십시오.
- -22°C에서 저온 저온 을 사용하여 40 μm 두께의 단면을 절단하였다. PBS와 나트륨 아지드 (0.02 %)로 채워진 6 개의 웰 플레이트에서 우물 당 10-20 섹션을 수집하십시오.
- 파라핀은 마우스와 인간의 뇌 조직에 대한 섹션을 포함.
- 파라핀 섹션의 경우, 등급이 매겨진 알코올로 퍼퓨던트와 24 시간 후 고정 된 뇌 조직을 탈수 (50 %, 70 %, 90 %) 각각 2시간씩, 100% 알코올 2x를 각각 1시간씩, 실온에서 자일렌 2x씩 1회)
- 알루미늄 호일로 덮인 유리 원추형 플라스크에서 56 °C에서 1 시간 동안 자일렌 파라핀 (1 :1) 2 x로 조직에 침투합니다.
- 4-6 시간 동안 녹은 파라핀 (56 °C)에 조직을 담그다.
- 실온에서 회전 마이크로토메를 사용하여 5 μm 두께의 섹션을 잘라 45 °C의 조직 수조에 놓습니다.
- 치료와 저온 섹션에서 Aβ 플라크를 화학적으로 라벨.
- PBS(pH 7.4)를 각각 5분동안 3x로 2.1.2단계에서 섹션을 헹구세요.
- 단면을 70% 에탄올로 실온에서 2분 동안 담그면 됩니다.
- 스톡 큐(1 mM)를 메탄올에 녹이고 70% 에탄올로 희석하여 최종 작업 농도가 10 μM입니다.
- 150 rpm의 셰이커에서 실온에서 1-5 분 동안 작동 Cur 솔루션으로 섹션을 담그면 됩니다.
- 큐어 용액을 버리고 각각 2 분 동안 70 % 에탄올 3 x로 씻으십시오.
- 폴리-L-리신 코팅 유리 슬라이드에 섹션을 놓고 디스티렌 가소제 자일렌 (DPX)과 같은 유기 장착 매체를 사용하여 커버 슬립으로 마운트합니다.
- 480/550 nm 여기/방출 필터를 사용하여 형광 현미경으로 볼 수 있습니다.
- 치료비로 파라핀이 내장된 마우스와 인간의 뇌 섹션에 Aβ 플라크를 Cur로 표기합니다.
- 실온에서 각각 5분 동안 자일렌 2x로 2.2.4단계에서 조직 절편을 분리합니다.
- 등급이 매겨진 알코올 용액 (각각 1 00 %, 80 %, 70 %, 50 % 각 1 분)과 실온에서 5 분 동안 증류수 2 x로 수화하십시오.
- 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 Cur (10 μM)로 얼룩 섹션을 150 rpm에서 흔들어. 각각 70%, 90%, 100% 알코올로 2분 동안 씻으시다.
- 자일렌 2x로 5분 동안 클리어하고 DPX로 커버슬립합니다.
- 단계 2.3.7에서 언급한 바와 같이 형광 현미경하에서 시각화한다.
- Aβ 플라크 및 올리고머에서 Aβ 항체로 큐어를 동경화합니다.
- 12 웰 플레이트에 PBS 3x로 단계 2.1.2에서 저온 절편을 세척하십시오.
- 10% 정상 염소 혈청 (NGS)으로 단면을 PBS에 용해0.5% 트리톤-X-100실온에서 1 시간 동안 차단합니다.
- 차단 솔루션을 폐기합니다. Aβ 특이적 항체(6E10 또는 A11, 희석 1:200)로 절편을 150 rpm에서 쉐이커에서 4°C에서 10% NGS 및 0.5% 트리톤-X100을 포함하는 신선한 차단 용액에 용해시켰습니다.
- 항체 용액을 버리고 각각 10 분 동안 PBS 3x로 섹션을 씻습니다.
- 이차 항체 태그를 적색 형광단(예를 들어, 알렉사 594)으로 배양하여 어둠 속에서 실온에서 1시간 동안 배양한다.
- 각각 10분 동안 PBS 3x로 씻으소서.
- 70% 알코올 1x로 씻으소서.
- 단면을 단면온도에서 5분 동안 Cur(10 μM)로 배양합니다.
- 70% 알코올 3x로 1분동안 씻으소서.
- 각각 90%와 100% 알코올로 탈수하고, 자일렌 2x로 5분동안 맑게 하고, DPX를 사용하여 슬라이드에 장착합니다.
- 적색 및 녹색 신호에 적합한 여기/방출 필터를 사용하여 형광 현미경을 사용하여 시각화합니다.
- 세포내 Aβ 공동국소화의 경우, Aβ-항체(6E10)를 사용하여 단면도를 염색하고, 어둠 속에서 150rpm에서 흔들림으로 치료와 함께 재입고하고, 호흐스트-33342(1 mg/ml) 및/또는 DAPI(1ug/ml)로 반점염색하여 실온에서 10분 동안 150 rpm에서 흔들리는 어둠. PBS 3x로 씻으소서.
- 빨간색, 녹색 및 파란색 필터가 100x 목표(총 배율 1,000x)로 이미지를 가져간다.
- 티오-S, CR 및 FJC로 Aβ 플라크에 라벨을 붙입니다.
참고 : Thio-S 및 CR 라벨링에 대한 자세한 프로토콜은 이전에7.- FJC 염색의 경우, 2.1.2단계에서 얻은 자유 부동 부분을 각각 5분 동안 PBS 3x로 세척합니다.
- 섹션을 12 웰 플레이트에 놓고 FJC (0.001 %)로 얼룩을 실온에서 어둠 속에서 10 분 동안.
- FJC 용액을 버리고 PBS 3x로 각각 5분 동안 세척하십시오.
- 염화암모늄(NH4Cl, PBS에 용해된 50 mM)을 실온에서 10분 동안 배양합니다.
- NH4Cl 용액을 버리고 PBS 3x로 각각 5 분 동안 씻으십시오.
- 섹션 2.4의 단계에 따라, 450/520 nm 여기/방출 필터를 사용하여 형광 현미경으로 등급이 매겨진 알코올 용액으로 탈수하고, 투명하고, 마운트하고, 볼 수 있습니다.
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Representative Results
커큐민은 1분 이내에 Aβ 플라크를 라벨로 표시합니다. 5xFAD 조직을 Cur로 염색했을 때, 우리는 1분 이내에 Aβ 플라크를 치료라벨로 표시한다는 것을 발견했습니다. Cur를 가진 증가된 배양 시간은 Aβ 플라크의 형광 강도를 약간 증가시켰지만, 관찰된 Aβ 플라크의 수는 1 분 및 5 분 염색 시간 사이에서 유의하게 다르지 않았다(그림 1).
Cur는 마우스 AD 뇌 조직에서 Aβ 특이적 항체와 동Local화하는 저온 극저온 제조, 파라핀 내장 마우스 및 인간 AD 조직에서 Aβ 플라크를 라벨링할 수 있습니다. 우리는 냉동 균, 파라핀 내장 섹션(그림 2A)및 인간 AD 조직(그림 2B)를염색 할 때, 우리는 조직 섹션의 모든 유형에서 치료 라벨 Aβ 플라크를 관찰했다. 추가적으로, Cur가 Aβ 플라크에 결합한다는 것을 확인하기 위하여, 우리는 먼저 6E10로 플라크를 표지하고, Cur 염색에 선행했습니다. 우리는 6E10(도2C)을결합하는 동일한 플라크에서 Cur가 Aβ와 완전히 동국화되었다는 것을 관찰하였다.
Aβ 올리고머 및 세포내 Aβ 응집체를 표지한 치료. Cur가 Aβ 올리고머에 라벨을 붙일 수 있는지 확인하기 위해, 5xFAD 마우스 섹션은 Aβ 올리고머 특이적 항체(A11)로 염색한 다음, Cur 염색을 했다. 우리는 Aβ 플라크에서 A11과 함께 커시컬화된 것을 관찰하였다(도3A). 유사하게, Cur는 또한 세포내 공간 내 6E10 항체와 동국화(도3B)세포내 Aβ에 라벨링할 수 있음을 나타낸다.
고전 아밀로이드 결합 염료보다 Aβ를 더 두드러지게 표지한 치료. Cur에 의한 Aβ 라벨링은 시판되는 아밀로이드 결합 염료 Thio-S, CR, FJC와 비교되었다. Aβ 특이적 항체 6E10을 표준 대조군으로 사용하였다. 우리는 Cur가 기존의 아밀로이드 결합 염료보다 더 두드러지게 Aβ를 표지하는 것을 관찰하였다(도4).
큐에이유도비스-데메톡시쿠르쿠민(BDMC)과 데메톡시쿠르쿠민(DMC)은 심황 추출물에도 존재하며, Aβ 플라크는 5xFAD 뇌 조직에서 비교적 치료에 비해 라벨이 붙는다. 두 가지 다른 주요 구성 요소, BDMC와 DMC 등, 심 황 추출 물에서 존재. 우리는 이 두 화합물이 또한 Cur와 유사한 Aβ 패를 표지하는지 여부를 시험했습니다. 5xFAD 마우스 뇌 섹션이 이들 유도체로 염색되었을 때, BDMC 와 DMC 는 또한 Aβ 플라크, 병렬Cur(도 5A)로표기하였다. 다른 마운팅 매체는 Cur로 염색한 후 Aβ-이미징과의 간섭을 확인하기 위해 조사되었다. 형광 신호는 DPX(도5B)와같은 수성 및 유기 마운팅 매체 모두에서 손상되지 않았다. Cur를 가진 Aβ 패의 염색은 면역 형광 표지 후에 적법하고 Hoechst 33342 용액 (1 mg/ml) 또는 4′,6-diamidino-2-페닐린돌 (DAPI, 1μg/ml)로 역염색이어서. 면역형광 신호 및 역염색 강도는 Cur 염색 후 유지되었다(도5C).
그림 1: 커큐민은 1분 이내에 Aβ 플라크를 라벨로 표시합니다. (A).5xFAD 마우스 또는 인간 대조군 및 AD 피질 조직에서 뇌 절편을 1-5 분 동안 Cur (10 μM)로 염색하고 눈에 보이는 플라크수를 계산하였다. (B).1분 내지 5분 염색 시간 사이의 Aβ-플라크 카운트의 수에서 차이가 관찰되지 않았다. 데이터는 평균 ± 표준 오차(SEM)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Aβ 플라크에서 Aβ 항체를 가진 큐어의 동국화. Cur는 저온 극저온 제조, 파라핀 내장 절편(A)및 인간 AD 조직(B)에Aβ 플라크를 라벨링할 수 있다. Aβ 표지는 Aβ 특이적 항체(6E10, DAB 염색)와 라벨링을 평행화시켰다. (C).5xFAD 절편을 먼저 Aβ 항체(6E10)로 표지하고, 그 다음에 Cur로 염색하였다. 적색 =6E10은 알렉사 플루오로포어(594)로 태그된 이차 항체에 의해 결합한다. 녹색 = 치료. 6E10에 결합된 동일한 플라크에서 Aβ와 완전히 동국화된 치료. 화살표는 Aβ 플라크를 나타냅니다. 배율 막대는 왼쪽의 세 이미지 모두에서 50 μm(총 배율 = 400x)을 나타내고 10μm(총 배율 = 400x)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 커큐민 은 Aβ 올리고머 및 세포내 Aβ를 분류한다. (a)Aβ-올리고머는 Aβ 특이적 항체(A11)를 이용하여 면역성 면역성 화학적으로 검출되었고, 이어서 Cur로 염색하였다. A11이 결합하는 동일한 올리고머에서 Aβ와 완전히 동국화된 큐어. 배율 막대 = 250 μm 및 총 배율 = 100x. (b)유사하게, 세포내 Aβ는 Aβ 특이적 항체(6E10)를 이용하여 면역조직화학적으로 검출되었고, 이어서 Cur로 염색하였다. Cur는 6E10에 바인딩된 동일한 영역에서 Aβ와 완전히 동지역화됩니다. 배율 막대 = 50 μm 및 총 배율 = 1,000x. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 다른 아밀로이드 결합 염료와 Cur의 비교를 Aβ 플라크에 라벨을 붙이도록 한다. 12개월 된 5xFAD 마우스의 피질로부터 저온 극저온 절편(40 μm)을 Cur, Thioflavin-S, 콩고 레드, 플루오로 옥 C, 및 6E10 항체로 염색하였다. 티오-S, CR 및 FJC보다 더 눈에 띄게 Aβ 플라크를 표지한 치료. 화살표는 Aβ 플라크를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 큐-유도체 비스-데메톡시 커큐민 및 데메톡시 커큐민또한 Aβ를 Cur와 유사하게 라벨을 붙인다. (A)저온 및 파라핀 함유 5xFAD 절편을 모두 큐유도체 비스-데메톡시 커큐민 및 데메톡시 커큐민으로 염색하였다. 이들 유도체 모두 Cur와 유사한 방식으로 Aβ 플라크를 라벨링한다. (b)Aβ 플라크를 Cur로 라벨링한 후 수성 및 유기 마운팅 매질(DPX)을 모두 사용하여 조직 단면을 장착하였다. (C)면역 표지된 절편을 Cur를 이용한 Aβ 라벨링에 사용하였다. 흰색 화살표는 Aβ 플라크를 나타내고 녹색 화살표는 활성화된 성상 세포(GFAP)를 나타내고 노란색 화살표는 핵 얼룩(DAPI)을 나타냅니다. 배율 막대 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 기능 | Aβ 항체 | Curcumin | 티오-S | 콩고 레드 | 플루오로 제이드 C |
| 염색 기간 | ~24-48 h | ~1-5분 | ~10분 | ~60분 | ~30분 |
| 액세서리 화학 물질 | 이차 항체, 버퍼, 정상 염소 혈청을 만들기 위해 여러 화학 물질 | 메탄올 | 에탄올 | NaOH와 에탄올 | NaOH 및 에탄올, 과망가네이트 칼륨 |
| 비용 | 비용이 많이 드는: 1개의 Aβ 특정 항체 유리병은 ~$200-300를 요구합니다 | 비용 효과: ~$5-10/1 g 의 치료및 많은 조직에 적용될 수 있습니다 | 비용 효과: ~ $ 5/1 g, 몇 가지 조직에 적용 할 수 있습니다 | 비용 효과: >$5/1 g 콩고 레드, 여러 조직에 적용할 수 있습니다. | 비용이 많이 드는: ~ $ 15.500 / 1 g FJC 분말 |
| 특이성 | Aβ 올리고머와 피브릴에 다른 항체가 필요합니다. | 커큐민은 Aβ 올리고머와 피브릴로 결합합니다. | 단량체 또는 올리고머가 아닌 피브릴만 바인딩할 수 있습니다. | Aβ-프로토피브릴및피브릴16,17과만 결합할 수 있습니다. | Aβ-피브릴 및 퇴화된 뉴런과만 결합할 수 있습니다. |
| 안정성 | 이차 항체에 부착된 염료에 따라 다름 | Aβ와 결합된 실온에서도 매우 안정적입니다. | 메탄올의 안정 | 에탄올안정 | 안정적이지 않음 |
| 염색 후 관리 | 염색 후, 어둠 속에서 보관하고 항상 얼어 붙는 등 각별한 주의가 필요합니다. | 가벼운 민감성 및 실온에서 더 안정적이지 않음 | 빛에 민감한 | 빛에 민감하지 않음 | 빛에 민감한 |
| 현미경 필요 | 복합 광 또는 형광 (이차 항체의 사용에 따라 다름) | 형광 | 형광 | 가벼운 현미경 또는 편광 현미경 또는 편광 필터 | 형광 |
| 배경 얼룩 | 일반적으로 배경이 없습니다. | 매우 낮은 배경 | 세포에 있는 지질 막 또는 지질 화합물과 결합 때문에 높은 배경 | 낮은 배경 | 높은 배경 |
| 생체 내 Aβ 이미징 | 해당되지 않을 수 있습니다. | 적용 가능성이 높지 않음 | 해당되지 않을 수 있습니다. | 해당되지 않을 수 있습니다. | 해당되지 않을 수 있습니다. |
표 1: 상이한 아밀로이드 결합 염료및 Cur 7을 가진 Aβ 라벨링의 비교.
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Discussion
우리의 가설은 Cur가 다른 고전적인 아밀로이드 결합 염료뿐만 아니라 Aβ 특이적 항체와 비교했을 때 사후 AD 뇌 조직에서 Aβ 플라크를 라벨화하고 이미지화하는 가장 빠르고, 쉽고, 가장 저렴한 방법으로 사용될 수 있다는 것이었습니다. 본 연구의 목적은 사후 AD 뇌 조직에서 Cur에 의해 Aβ 플라크에 라벨을 부착하고 이미지화하는 데 필요한 최소 시간을 결정하고 Cur가 Aβ 플라크 라벨링을 위한 Aβ 항체의 대안으로 사용될 수 있는지 여부를 결정하는 것입니다. 이를 위해, Cur의 Aβ 라벨링 능력은 상이한 시점에서 관찰되었다. Cur는 1분 이내에 Aβ에 라벨을 붙일 수 있었다. 또한, Cur에 의한 Aβ의 표지는 티오-S(0.1%), CR(1%), FJC(0.001%)와 같은 다른 종래의 아밀로이드 결합 염료보다 컸다.
Cur는 구조적, 물리적, 화학적 및 생물학적성질(10)을포함하는 통상적인 아밀로이드 결합 염료의 대부분에 의해 소유되는 대부분의 특성을 가지기 때문에 Aβ 라벨링에 대한 독특하고 이상적인 형광단으로 간주된다. 또한, 경제성으로 인해 대부분의 연구자들은이 천연 폴리 페놀을 사용하는 데 관심이 있습니다. Aβ 플라크 및 올리고머에 대한 큐어 결합의 특이성을 나타내기 위해, 우리는 6E10 및 A11(Aβ-올리고머 특이적 항체)을 사용했다. Cur는 조직에 존재하는 모든 상이한 Aβ 종과 거의 완전한 동국화를 보였으며, 이는 Cur가 Aβ7,17,18,19,20에매우 특이적임을 시사한다. 또한, Aβ 올리고머(그림3A)및 세포내 Aβ 응집체(그림3B)및 Aβ 항체와 동국화된 Aβ 항체(그림2B)를표지한 Cur는 물론, 세포 외 Aβ 플라크뿐만 아니라 세포 내 공간에 증착 된 Aβ7.
지난 수십 년 동안, 몇몇 형광단 및 항체는 Aβ 플라크를 화학적으로 표지하고 심상하기 위하여 개발되었습니다. 의심 할 여지없이, 그들 대부분은 표적 Aβ 종과 Aβ 플라크검출에 매우 구체적이지만, 이들은 훨씬 더 비싸고 그 사용은 Cur를 사용하는 것보다 더 많은 시간이 소요됩니다. 예를 들어, 우리는 Cur에 의한 Aβ 플라크 결합을, 티오-S, CR 및 FJC와 같은 다른 아밀로이드 결합 염료와 비교하여, 여기서 Aβ 특이적 항체(6E10)가 기준 대조군으로서 사용되었다. 이러한 결과는 Cur 라벨 Aβ 플라크가 다른 형광단보다 더 강하게 나타났다는 것을 시사한다. 가장 중요한 것은, Cur에 비해, 더 일반적으로 사용되는 형광단중 일부는 라벨링 및 이미징 Aβ 측면에서 뚜렷한 단점을 갖는다. 예를 들어, 티오-S는세포(21)에서지질막 또는 지질 화합물과 결합하기 때문에 산만하고 높은 배경을 생성할 수 있다. 유사하게, 일반적으로 Aβ를 표지하기 위하여 이용되는 CR은, 편광한 현미경의 밑에 사과 녹색 birefringence(그림 4)를일으킵니다. CR은 Cur 또는 Thio-S와 같이 Aβ-플라크에 쉽게 라벨을 붙이지 않으며, Cur7,22,23에의해 검출된 것보다 훨씬 적은 Aβ 플라크를 라벨링합니다. Gutierrez 등은 Aβ와 퇴화된 뉴런과 결합할 수 있는 FJC가 Cur 또는 Thio-S24보다낮은 주파수로 라벨을 붙일 수 있다고 보고했습니다. 이러한 결과는 일반적으로 사용되는 이러한 고전 마커가 Cur보다 Aβ 플라크에 결합하기 위한 선호도가 낮다는 것을 시사한다.
또한, 다른 Aβ-플라크 유형(코어, 신경염, 확산, 연소)의 라벨링은 다른 아밀로이드 결합 형광보다 Cur로 최적화될 수 있습니다. 다른 기술은 이러한 형태 학적 하위 유형을 구별하지 못합니다7. 유사하게, Aβ의 다른 종에 아주 특이적인 Aβ 특이적 항체의 사용은 면역성 화학을 통해 적어도 24-48h를 취하는, 매우 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요된다. 더욱이, Aβ의 다른 종을 검출하는 것은 다른 항체, 뿐만 아니라 몇몇 부속 화학물질을 요구합니다, 이는 총 비용에 현저하게 추가합니다. 분명히 Cur는 비용이 적게 들고 더 쉽게 사용할 수 있으며 Aβ 플라크에 결합할 때 더 높은 형광 강도를 생성합니다. CR은 또한 Aβ 플라크의 표지 및 이미징을 위한 비교적 비용 효율적인 기술이지만, Cur는 올리고머25(그림 3 및 그림 4)와같은 Aβ 종을 더 많이 결합하고 라벨링할 수 있는 반면 CR은 프로토피브릴과 피브릴23. 따라서, Cur를 가진 Aβ 라벨링은 티오-S, CR, 또는 FJC(표1)에의해보다 보다 효율적이고 비용 효율적으로 달성될 수 있다.
요약하자면, Cur는 AD 뇌 조직에서 Aβ 플라크와 올리고머를 효과적이고, 신속하고, 저렴하게 검출할 수 있습니다. 또한, Aβ에 대한 치료 결합은 매우 특이적이며, 그의 형광 활성은 매우 안정적이다. Aβ를 라벨에 붙이기 위해서는 최소한의 양(1-10 nM)이 필요합니다. 더욱이, Cur는 또한 피브릴 또는 플라크뿐만 아니라 올리고머7과같은 상이한 Aβ 종에 매우 특이적이다. 유사하게, Cur 유도체 데메톡시쿠르쿠민 및 비스데메톡시쿠르쿠민은 또한 아밀로이드 결합 특성 및 C 라벨 Aβ를 Cur10과 유사하게 함유한다(도5A). 따라서, Cur는 사후 뇌 조직에서 Aβ 플라크의 표지 및 이미징에 이상적인 형광공이다. AD의 실험 동물 모델에서 항 아밀로이드 치료 후 Aβ 플라크 하중을 검출하는 빠르고 쉬운 대안으로 사용될 수 있다. 우리의 사실 인정은 Aβ에 Cur의 높은 친화력의 보고를 확인합니다, 사후 두뇌와 살아있는 조직에서 Aβ 패를 감시를 위한 그것의 잠재적인 사용을 강화하.
최적의 치료 라벨링을 위해 Perfused 조직에서 Cur로 Aβ에 라벨을 붙이지 말고 장기간 조직 저장을 피하는 것이 좋습니다. 공동 라벨링을 위해, 먼저 Cur로 염색하기 전에 사용되는 특정 항체와 면역 막화학을 완료한 다음 DAPI 또는 Hoechst를 사용하여 역 염색으로 이것을 따르는 것이 좋습니다.
이 방법에 대한 가능한 수정은 최대 30 분 동안 조직과 큐배의 인큐베이션 시간을 증가 포함, 이는 신호 강도를 방해하지 않습니다, 그것은 이미징하는 동안 배경을 증가 시킬 수 있지만. Cur의 농도를 10 μM 미만으로 감소시키는 것은 Aβ 라벨링에서 유의한 수준으로 방해하지 않는다. 인간의 뇌 조직에 대 한 배경을 줄이기 위해, 대체 준비 방법을 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 뇌 절편은 처음에는 실온에서 10분 동안 70% 에탄올(v/v)에서 0.3%(w/v) 수단 블랙 B로 치료할 수 있습니다. 그런 다음 섹션은 실온에서 10 분 동안 Cur로 염색 하고, PBS 3x로 15 분 동안 세척하고, 카운터 스테인드하고, 안티 페이드 미디어(13)로장착 할 수 있습니다. 저온 극저온 단면 두께도 20-25 μm로 줄일 수 있습니다.
이 방법에 대한 잠재적인 주의 사항은 세포외 Aβ 플라크와 다른 혈관에 존재하는 Aβ와 의 한큐배착을 포함한다. 따라서, 조사원은 혈관에 있는 Aβ에서 Aβ 플라크 및 올리고머의 형태에 유의해야 한다. 조사자는 자동 형광 신호에 주의해야 합니다. 과도한 녹색 배경은 Cur 염색 후 가끔 볼 수 있지만 염색 시간을 줄이거나 Cur 농도를 줄임으로써 줄일 수 있습니다. 마지막으로, 다른 마커와의 공동 라벨링신호는 클리어링 제(예를 들어, 자일렌)를 가진 반복적인 처리로 인해 감소될 수 있다.
중요한 한계는 형광 이소티오티야네이트 (FITC)와 같은 녹색 형광 염료로 표지된 이차 항체를 사용하여 어떤 마커 단백질든지와 공동 표지하는 무능력을 포함합니다. 이 것들은 Cur의 유사한 여기/방출 때문에 사용할 수 없습니다. 또한, AD의 초기 단계에서, 제한된 양의 Aβ만이 Cur에 의해 표지될 수 있다. 마지막으로, 어떤 형광 염료 같이 어두운 환경에서 일을 할 필요가 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 연구 결과에 대한 지원은 세인트 메리의 승천에 필드 신경 과학 연구소에서 왔다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | IHC world, Woodstock, MD | ||
| Aanimal model of Alzheimer's disease | Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME | ||
| Absolute alcohol | VWR,Radnor, PA | ||
| Alexa 594 | Santacruz Biotech, Dallas, TX | ||
| Antibody 6E10 | Biolegend, San Diego, CA | ||
| Antibody A11 | Millipore, Burlington, MA | ||
| Compound light microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus BX51 | |
| Congo red | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Cryostat | GMI, Ramsey, MN | LeicaCM1800 | |
| Curcumin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Dystyrene plasticizer xylene | BDH, Dawsonville, GA | ||
| Filter papers | Fisher scientific, Pittsburgh, PA | ||
| Hoechst-33342 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Inverted fluorescent microscope | Leica, Buffalo Grove, IL | Leica DMI 6000B | |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus 1x70 | |
| Normal goat serum | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraffin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Ploy-lysine coated charged glass slide | Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ | ||
| Potassium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium azide | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium hydroxide | EMD Millipore, Burlington, MA | ||
| Sodium pentobarbital | Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI | ||
| Thioflavin-S | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Triton-X-100 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Xylene | VWR,Radnor, PA |
References
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