Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

הדור של מבנה האשך של פורצין עם הארכיטקטורה הספציפית ביותר באמצעות התרבות של המיקרוגל

Published: October 3, 2019 doi: 10.3791/60387

Summary

לכאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור הדור הניתן להתרבות של אורגנואידים האשך של חזירי עם ארכיטקטורת רקמה ספציפית בראש באמצעות מערכת התרבות הזמינה מסחרית למיקרוגל.

Abstract

אורגנואידים הם שלושה מבנים ממדיים המורכב מסוגי תאים מרובים המסוגלים ללכוד את ארכיטקטורת הרקמה ופונקציות של איברים בvivo. היווצרות אורגנואידים פתחה שדרות שונות של מחקר בסיסי וטרנסלייתי. בשנים האחרונות, אורגנואידים האשכים צברה עניין בתחום ביולוגיה של הגבר הרבייה. אורגנואידים האשכים לאפשר את המחקר של אינטראקציות תא תא, התפתחות רקמות, ואת התא הנבט נישה מיקרואקולוגיה ולהקל על התפוקה הגבוהה של סמים והקרנות רעילות. שיטה נדרשת באופן אמין ומתוכשל ליצור אורגנואידים האשכים עם הרקמה הספציפית של רקמת רקמות. מערכת התרבות של המיקרוגל מכילה מערך צפוף של המיקרוגל בצורת פירמידה. תאים האשכים נגזר מפני האשכים pubertal הם centrifuged לתוך המיקרוגל האלה ותרבותי כדי ליצור אורגנואידים האשכים עם ביקורות-הרקמה הספציפית בדיקות ואגודות תאים. בתהליך זה ניתן ליצור אלפי אורגנואידים אחידים. הפרוטוקול המדווח כאן יהיה עניין נרחב לחוקרים הלומדים רבייה גברית.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בשנים האחרונות, היתה תחייה של עניין באורגנואידים תלת ממדיים. איברים שונים כגון המעי1, בטן2, הלבלב3,4, הכבד5, ואת המוח6 נגזר בהצלחה לתוך 3d מערכות אורגאיד. לאורגנואידים אלה יש דמיון אדריכלי ופונקציונלי לאיברים בvivo והם רלוונטיים יותר ביולוגית לחקר מיקרואקולוגיה של רקמות מאשר מערכות התרבות7. כתוצאה מכך, מארגני האשכים החלו לקבל ריבית כמו גם8,9,10,11,12. רוב השיטות שדווחו עד כה מורכבות, תפוקה שאינה גבוהה10 ודורשות תוספת של חלבונים ecm8,10. מורכבות זו גם מובילה לבעיות עם התוכסות. שיטה פשוטה ומקיימת צורך שמאפשר את הדור של אורגנואידים האשכים עם שיוכי תאים שהם כמו ביקורות של vivo.

לאחרונה דיווחו על מערכת שתפנה לדרישות הללו12. בעזרת החזיר כמודל, העסקנו גישה. לצבירת כפייה גלית במערכת המיקרוגל במערכת המיקרוגל, כל הבאר מכילה מספר רב של מערך המיקרוגל הקטן יותר13. זה מאפשר את הדור של מספר רב של מידות בגודל אחיד. מערכת המיקרוגל אפשרה דור של מספר רב של ממדים אחידים עם ארכיטקטורה ספציפית. המערכת פשוטה ואינה דורשת תוספת של חלבונים מבית ECM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הערה: האשכים מ 1-שבוע החזרזירונים התקבלו מחוות חזיר מסחרית כתוצר לידי מסירוס של חזירים מסחריים. המקור של האשכים אושרה על ידי ועדת הטיפול בעלי חיים באוניברסיטת קלגרי.

1. הכנת פתרונות אנזימים לעיכול רקמות

הערה: יש צורך בשלושה פתרונות אנזימטיים שונים, הכוללים שתי פתרונות לקולגן שונים (פתרון A, B) ופתרון deoxyribonuclease I (DNase I).

  1. כדי להכין את הפתרון A, לפזר 20 מ"ג של הקולגן של העירוי (טבלת חומרים) ו 40 מ"ג של הקולגן של הרביעי W (טבלת חומרים) ב 25 מ ל של בינונית הנשר השונה של Dulbecco של מדיום (dmem). לאחר מכן לסנן לעקר עם מסנן יקרומטר 0.22. הוסף 0.4 mL של סרום העוברי (FBS) כדי פתרון A כדי לעכב טריפסין פעילות.
  2. כדי להכין פתרון B, לפזר 80 מ"ג של הקולגן הרביעי W (לוח חומרים) ב 40 ML של dmem. לאחר מכן לסנן לעקר עם מסנן יקרומטר 0.22.
  3. כדי להכין פתרון DNase I (7 מ"ג/mL), לפזר 70 מ"ג של DNase I ב 10 מ ל של d,. לאחר מכן לסנן לעקר עם מסנן יקרומטר 0.22.
    הערה: ריכוז האנזים לפתרונות הקולגן המתואר כאן, משתנה מהריכוזים (2 מ"ג/mL) המופיעה בסעיף14המקורי. הפרוטוקול הנוכחי מניב תאים עם יכולת קיום מעט גבוהה יותר. עם זאת, תאים מבודדים על ידי שני הפרוטוקולים לייצר אורגנואידים עם ארכיטקטורה זהה רקמה.

2. רקמת עיכול אנזימטית

  1. לאסוף את האשכים לתוך הגביע סטרילי ולשטוף עם מלוחים באגירה פוספט (PBS) המכיל 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S). לאחר כביסה, להעביר את האשכים לצלחת התרבות 100 מ"מ רקמות עם PBS המכיל 1% P/S ולהסיר את הוגיניקה ואת האפידיאמיס באמצעות מספריים בלוק מלקחיים. להעביר את האשכים מבודדים למנה חדשה 100 mm ולשטוף ביסודיות עם PBS המכיל 1% P/S.
  2. כדי לשמור על עקרות, להשתמש בקבוצה אחרת של מספריים סטרילי מלקחיים לקלף את האשך האשכים מתוך אלבומין המנהרה. חותכים את האשכים לאורך ציר האורך ישירות מתחת tunica. לאחר מכן לקלף את האשכים מתוך tunica באמצעות שני מלקחיים ומקום לתוך מנה חדשה 100 mm המכיל 1 mL DMEM זיכרון עם 1% P/S.
  3. האוהב את האשכים קלופות עם מספריים סטרילי לתוך 1-2 מ"מ חתיכות רקמה. לאחר חיתוך, השתמש מלקחיים סטרילי להסיר שברי לבן של רקמת החיבור.
  4. להעביר את חתיכות הרקמה הטחון לתוך פתרון A ולמעלה עד 50 mL עם DMEM כדי לקבל ריכוז של 0.4 mg/mL עבור הקולגן הרביעי (טבלת חומרים) וריכוז של 0.8 Mg/ml עבור הקולגן הרביעי W (טבלת חומרים). פתרון מקום A המכיל את חתיכות הרקמה לתוך אמבטיה מים 37 ° c עבור 30 דקות, בעדינות להפוך את הצינורות כל 5 דקות ולבדוק חזותית עבור שחרורו של ה-DNA.
    1. הוסף 500 μL של DNase I אם ה-DNA צף בחינם הוא נצפתה. לאחר 30 דקות, צנטריפוגה את הצינור ב 90 x g עם בלמים 25 ° צ' עבור 1.5 דקות ולהיפטר supernatant.
      הערה: הדנ א יופיע כחומר מעונן. כאשר הצינורות מזועזעת, את חתיכות הרקמה להתיישב בעוד ה-DNA היה לצוף.
  5. הוסף פתרון B לצינור העליון עד 50 mL עם DMEM כדי לקבל ריכוז של 1.2 mg/mL של הקולגן הרביעי W (טבלת חומרים). מניחים את הצינור לתוך 37 אמבט מים ° c עבור 30 דקות ובעדינות להפוך את הצינור כל 5 דקות. הוסף 500 μL של DNase אני אם ה-DNA צף בחינם הוא נצפתה.
  6. לאחר 30 דקות, צנטריפוגה את הצינור ב 90 x g עם בלמים 25 ° צ' עבור 1.5 דקות. לאחר מכן לבטל את הסופרנטנט ולשטוף פעם אחת עם PBS 1% P/S.
    הערה: הסופרנטטים שנזרקו מהפתרון A ו-B יכילו בעיקר תאים ביניים.
  7. במעלה הצינור עם הערוץ הגבוה עד 50 mL. בזהירות לאסוף את tubules מן החלק העליון ומקום לתוך צינור חדש 50 mL.
    הערה: שברי הרקמה הגדולה והבלתי מתעכל מתפשרים במהירות בתחתית, ואילו tubules מתעכלים יישארו בהשעיה. אין לאסוף שברי רקמות גדולים. הליך זה יכול לחזור מספר פעמים עד הפתרון בצינור המקורי הוא כמעט ברור רק שברי רקמות לא מתעכל נשאר, אשר ניתן להיפטר.
  8. צנטריפוגה את tubules ב 90 x g עם בלמים 25 ° צ' עבור 1.5 דקות ולהיפטר supernatant. הוסיפו שוב את הערוץ החדש והצנטריפוגה. חזור על שלב השטיפה פעמיים.
  9. לאחר השטיפה האחרונה של ה-PBS, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הטוטטוספסים ב-5 מ ל של PBS. לאחר מכן, הוסף 15 מ ל של 0.25% טריפסין-אתילליאדיאמטהחומצה (EDTA) כדי tubules. הניחו את הצינור באמבט המים 37 ° c והיפוך עדין כל 2 דקות. אם הרבה בחינם צף DNA הוא נצפתה, להוסיף 500 μL של DNase I עם 5 מ ל של Dזיכרון.
  10. הערכת העיכול האנזימטי של tubules לתאים בודדים מתחת למיקרוסקופ (הראשון אחרי 5 דקות, ואז כל 2 דקות). אם בעיקר תאים בודדים ניתן לזהות, לעצור את התגובה עם 5 מ ל של fbs ולסנן דרך רשת 70 יקרומטר ולאחר מכן באמצעות רשת 40 יקרומטר.
    הערה: הטיפול צריך להילקח כי הכובעים על הצינורות 50 mL המשמשים לעיכול (פתרון A, B ו 0.25% טריפסין-EDTA) הם התהדקו כראוי. אם זיהום באמבט מים היא דאגה, סרט פרפין עשוי להיות עטוף סביב כובע כדי להבטיח עקרות.
  11. צנטריפוגה את התאים היחידים ב 500 x g עם בלמים 25 ° צ' עבור 5 דקות, להשעות מחדש במדיום העשרה (בינונית הנשר משתנה בינוני F/12 (dmem/F12) המכיל 5% fbs ו 1% P/S) ולספור את מספר תאים קיימא. זוהי אוכלוסיית התא ההתחלתית. תקן 100 x 103 תאים ולבצע האימונולוציטוכימיה עבור תא הנבט סמן UCHL1 (אוביקוויב C-טרמינל הידרוקלז L1) כמתואר12 ולקבוע את אחוז התאים הנבט באוכלוסייה זו מתחיל תא.
    הערה: תא נבט סמן פרוילציטים חלבון לוקמיה האצבע אבץ (PLZF)15 יכול לשמש גם כחלופה מתאימה UCHL1. באוכלוסיית התא ההתחלתי, תפוקת התאים הצפויה היא סביב 700-800 x 109/g של רקמות. אחוז תאי הנבט באוכלוסיית תאים זו צריך להיות 4-5%.
  12. מניחים סביב 20 x 106 של האוכלוסייה ההתחלתית הזאת בשני מצורף נמוך במיוחד 100 מ"מ מנות פטרי (10 x 106 תאים הושעה 10 מ ל/F12 המכיל 1% P/S בכל מנה) עבור 2 ימים בחממה תרבות רקמה (37 ° c , 5% CO2, 21% חמצן). בצע את תא הנבט העשרה עם התאים הנותרים.
    הערה: כדי להבטיח את הכדאיות האופטימלית ואת איכות התאים, בעוד תא הנבט העשרה והקוונפיקציה הבאה מתרחשת, אוכלוסיית התא המתחיל ממוקם בתרבות של מנות מצורף מאוד נמוך ברקמת העור במשך יומיים.

3. העשרה לתאי נבט

הערה: ההליך המתואר לעיל תשואות בעיקר תאים Sertoli ותאי נבט. תכונות הדבקה שונות מאפשרות הפרדת תאי Sertoli ותאי נבט באמצעות ציפוי דיפרנציאלי.

  1. Seed 20-25 x 106 תאים של אוכלוסיית התאים המתחילים לכל 100 מ"מ ממנה התרבות הרקמה בנפח כולל של 8 מ ל של העשרה mL של בינונית (dmem/F12 עם 5% fbs ו 1% P/S) עבור ציפוי דיפרנציאלי. מניחים את התאים לתוך אינקובטור (37 ° c, 5% CO2, 21% O2) ואחרי 1.5 h, לוודא כי רוב התאים sertoli להצמיד לצלחת.
  2. לאסוף ולשלב את supernatant (בעיקר המכיל תאי הנבט) של 2 צלחות לצלחת אחת חדשה 100 mm ולמקם אותו בחזרה לתוך החממה. אחרי 1 h, שוב לשלב את supernatant של 2 צלחות לצלחת 100 mm חדש. מניחים את הצלחות בחזרה. לתוך החממה למשך הלילה
    הערה: הסופרנטנמלים המשולבים יכילו בעיקר תאי נבט. התאים הדוניים שנזרקו יחד עם הלוחות הם בעיקר תאי האשכים הסומטיים כגון Sertoli ו peritubular myoid תאים.
  3. לאסוף את תאי הנבט מועשר בשני שברים כדלקמן.
    הערה: תאי הנבט מועשר לדבוק באופן שונה, שבר לא מחסיד ושבריר דבקה מעט. שני השברים האלה מהווים את אוכלוסיית תאי הנבט המועשרת
    1. שבר לא מחסיד: לאסוף את הסופרנטאנט.
    2. שבר במקצת חסיד: לשטוף את הצלחות בעדינות עם PBS, לטפל עם 2 מ ל של 1:20 דילול של 0.25% טריפסין-EDTA עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, לעצור את התגובה עם 2 מ ל של העשרה מדיום ולאסוף בצינור זהה כמו שבר לא חסיד.
      הערה: 0.25% טריפסין-EDTA צריך להיות מדולל עם PBS כדי לייצר מ1:20 טריפסין פתרון.
  4. לספור את המספר הכולל של תאים באמצעות מונה התא, לתקן 100 x 103 תאים ולבצע החיסונית של תא הנבט סמן UCHL1 כמתואר12 ולקבוע את אחוז תאי הנבט באוכלוסיה זו מועשר תאים.
    הערה: אחוז תאי הנבט באוכלוסיית תאים זו צריך להיות לפחות 60-70%. מאז הכימיה החיסונית לכימות ידרוש יום אחד, את התאים מועשר צריך להיות ממוקם מצורף נמוך במיוחד 100 מ"מ צלחת פטרי עם DMEM/F12 שיושלם עם 1% P/S עבור המשך כדי להבטיח איכות תא אופטימלי ויכולת הכדאיות.

4. הכנת תאים לזריעה

  1. כדי לקצור את הכנת התא ההתחלתי, לאסוף את supernatant בצינור 50 mL מתוך החזקה אולטרה מצורף מנות 100 מ"מ. לשטוף את הצלחות במרץ עם PBS לאסוף את התאים הדבקו. אין צורך בעיכול אנזימטי.
    הערה: חלק מתאי האשכים, בעיקר בתאי Sertoli, יכולים מעט לדבוק לוחיות ההחזקה האולטרה נמוכה.
  2. לשלב את ההכנה התא ההתחלתי ותאי נבט מועשר כדי להשיג הכנה לתא עבודה המכיל 25% תאי הנבט. צנטריפוגה ב 500 x g עם בלמים 25 ° צלזיוס עבור 5 דקות, למחוק את supernatant ולהשעות את התאים בינונית היווצרות אורגאיד (Dמאמ/F12 בתוספת אינסולין 10 μg/ml, העברת 5.5 Μg/ml, סלניום 6.7 Ng/ml, 20 Ng/ml מקדם גידול באפידרמיס , 1% P/S). כוונן את צפיפות התא ל-2.4 x 106 לכל mL.
    הערה: כל באר בלוחות המיקרוגל המשמשים13 בפרוטוקול זה הכילו 1,200 המיקרוגל.
  3. השתמש בנוסחה שלהלן כדי לחשב את מספר התאים בהתאם למפורט להלן.
    מספר התאים בבאר = מספר התאים של המיקרוגל x שניתן לאשכולות עבור כל אורגנואיד.
  4. כדי ליצור אורגנואידים מ 1, 000 תאים כל אחד, זרע כל עם (1,200 x 1,000 תאים כל =) 1.2 x 106 תאים. כוונן את צפיפות התא בתא ההשעיה באופן שבו התאים נזרע בנפח של 0.5 mL של בינוני. עבור אורגנואידים נוצר מ 1,000 תאים כל אחד, להשתמש בצפיפות של 2.4 x 106 תאים לכל mL (1.2 x 106 תאים בשנת 0.5 mL).

5. הכנת המיקרוגל לקבלת תאים

הערה: כדי לוודא שהתאים אינם נצמדים למשטח המיקרוגל, התייחס לפתרון שטיפה הניתן לשטיפה הזמין לרכישה על-ידי היצרן.

  1. הוסף 0.5 mL של פתרון שטיפה לכל טוב. ודא כי אין בועות אוויר לכודים בבאר. כדי להסיר בועות אוויר, אם בכלל, צנטריפוגה את הצלחת ב 2,000 x g עם בלמים 25 ° צ' עבור 2 דקות.
  2. שימו לב לצלחת תחת מיקרוסקופ הפוך נמוך, כדי לוודא כי הבועות הוסרו מן המיקרוגל. אם לכודים בועות הם נצפו, צנטריפוגה שוב ב 2,000 x g עם בלמים 25 ° צ' עבור 2 דקות כדי להסיר את כל הבועות הנותרים.
  3. מכסים את הצלחת עם המכסה ואת הדגירה עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הטיפול הושלם, להסיר את הפתרון שטיפה ומיד לשטוף את הצלחת עם מים סטרילי או PBS. ודא כי הצלחת לא להתייבש לאחר הטיפול עם פתרון שטיפה.

6. דור של אורגנואידים האשכים

  1. הוסף 0.5 mL של היווצרות אורגאיד בינונית (ללא כל התאים) כל היטב צנטריפוגה ב 2,000 x g עם בלמים 25 ° צ' עבור 2 דקות כדי להסיר כל בועות אוויר לכודים. צפו בבאר תחת מיקרוסקופ הפוך נמוך כדי לוודא כי בועות האוויר הוסרו. אם לכודים בועות הם נצפו, צנטריפוגה שוב ב 2,000 x g עם בלמים 25 ° צ' עבור 2 דקות כדי להסיר את כל הבועות הנותרים.
  2. הוסף 0.5 mL של ההשעיה התא עובד בעדינות לערבב על ידי ליטוף למעלה ולמטה. צנטריפוגה ב 500 x g עם בלמים 25 ° צלזיוס עבור 5 דקות. השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי לוודא כי התאים מקובצים בתוך המיקרוגל.
  3. להעביר את הצלחת לתוך החממה תרבות התאים והתרבות עבור 5 ימים. . לשנות חצי מהמדיום בכל יום
    1. כדי לשנות בינונית מבלי לאבד אורגנואידים, גע בעצת הפיפטה לקיר הבאר והנמך בעדינות כדי לגעת במנקוס ולמשוך לאט את המדיום. הקפידו לעקוב אחרי המאנקוס כשהוא נופל. כדי להוסיף בינונית טרייה, גע בעצת הפיפטה לקיר של הבאר באותו צד של הנסיגה הבינונית והוסף בעדינות בינוני טרי לקיר הבאר ומאפשר לו לזרום לאט במורד הקיר.
  4. כדי לשחזר את האורגנואידים, בעדינות למעלה ולמטה באמצעות פיפטה בפה רחב. זה יאפשר לאורגנואידים. לצאת ממיקרוגל
  5. לאסוף את האורגנואידים, לשטוף עם PBS, לתקן ולבצע אימונוציטוכימיה לסמן תא הנבט (בL1), מסמן תא Sertoli (החלבון כריכה מחייב 4-GATA4), peritubular מסמן התא myoid (α-חלקה שריר Actin-αSMA) ו ליידיג סמן תא (ציטוכרום P450-CYP450) כמתואר12 והמחש במיקרוסקופ קונפוקלית וקד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תאים מבודדים מ 1-שבוע האשכים חזירי שהיו מתורבתים במיקרוגל עצמי מאורגן לתוך spheroids (איור 1A, איור 2), עם החיצוני הנבדל ונפרד (אפיתל הרקמות) ותאי פנים ( interstitium) (איור 1ב, איור 2). שני התאים היו מופרדים על ידי קולגןהרביעי וקרום מרתף. L1+ ve תאים נבט ו GATA4+ ve sertoli תאים היו בתא החיצוני על קרום המרתף (איור 1B, איור 2). α-SMA+ ve peritubular בתאי myoid היו מותאמים לאורך החלק הפנימי של קרום המרתף בעוד ציטוכרום P450+ ve ליידיג תאים היו במרכז הinterstitium (איור 1B, איור 2). מבנה זה (איור 2) דומה בתנאים באתרו (איור 1ג), שם ליידיג תאים, תאים peritubular myoid ממוקמים interstitium בתא ביניים; ותאי הנבט, התאים Sertoli ממוקמים האפיתל seminiferous.

Figure 1
איור 1: למיקרוגל-מיצג של האשכים הנגזרים מוצג בארכיטקטורת רקמה ספציפית עם טופוגרפיה הפוכה. (א) כדוריות האשכים הפורצין ב -0, 3, ו -5 ימים של תרבות המיקרוגל. (ב) אימונוoforof הזדקנות תמונות של מארגני האשכים זיהוי סוגי תאים ספציפיים: Sertoli תאים (GATA4), קרום המרתף (קולגן IV); תאי נבט (בL1); peritubular myoid תאים (α-SMA); תאי ליידיג (CYP450). (ג) הופעה היסטולוגית (H & E) וייצוג סכמטי של ביקורות חזיר בן שבוע. סוגי תאים ספציפיים מסומנים בחצים מקבילים. קנה מידה של סרגלים = 50 μm. איור זה שונה מ Sakib et al.12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: ייצוג סכימטי של היווצרות אורגנואיד. התאים הבודדים האשכים הם נזרע ומתורבת במיקרוגל עבור 5 ימים כדי לייצר אורגנואידים האשכים. איור זה שונה מ Sakib et al.12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הקמנו שיטה פשוטה המאפשרת את עקבית, הדור לשחזור של מספר גדול של אורגנואידים האשכים עם אדריכלות רקמות דומה להעיד ב vivo12. בעוד הגישה פותחה באמצעות תאי התפיסה של חזירי, היא ישימה יותר באופן כללי גם על העכבר, הפרימטים הלא אנושיים ו-האדם12. מספר שיטות שונות דווחו להפקת אורגנואידים האשכים8,9,10,11. Baert et אל. שנוצר האשכים האנושיים אורגנואידים ממבוגרים ודגימות טרום pubertal על ידי תאי האשכים culturing עם מטריצה סלולרית נוספת (ECM) המתקבל על ידי decellularization של האשכים האנושיים הבוגרים11. למרות מודל זה לא היו מורפולוגיה האשכים ברורים, אורגנואידים יכול להפריש טסטוסטרון ציטוקינים11. מודל אחר של אורגאיד אנושי דווח על ידי Pendergraft ואח '. באמצעות שיטת שחרור תלוי התרבות כי מנוצל מסיסות חלבונים ECM האשכים ואורגנואידים יכול לייצר טסטוסטרון8. Alves-Lopes ואח ' השתמשו מטריצה ייחודית שלוש שכבות ממברנה קרום (למשל, מטריקס) מערכת הדרגתי כדי ליצור אורגנואידים האשכים מחולדות10. התאים במערכת זו יצרו מבנים צינורי כי היה מכשול באשכים דם. תאי הנבט במבנים כדורית כמו אלה היו קשובים גם גירוי חומצה retinoic10. כל השיטות הללו מורכבות במקצת ומאתגרות לשימוש עבור assays התפוקה הגבוהה. לעומת זאת, מערכת המיקרוגל היא פשוטה, מיופקת, יכולה ליצור אורגאונואידים האשכים אורגונואידים והוא יכול לשמש תרופה תפוקה גבוהה רעילות assays.

למרות בשיטה המפורטים כאן השתמשנו צפיפות תא 1,000 תאים/המיקרוגל (1,000 תאים/אורגאיד), שיטה זו ניתן להשתמש כדי ליצור אורגנואידים עם מעט כמו 125 תאים/למיקרוגל12. זה יכול להיות שימוש מיוחד בעת ניסויים עם דגימות מוגבלות.

אם הצלחת אינה מאוזנת כראוי במהלך צנטריפוגה, התפלגות אחידה של התאים עלולה לגרום ליצירת משתנים עם גודל וצורה משתנה. יש לקחת את הטיפול כדי לאזן כראוי את צלחת המיקרוגל. לאחר שהתאים נזרע, יש לשלם את תשומת הלב כדי לטפל בצלחת במהלך שינויי המדיה. מטלטל את הצלחת יותר מדי כשאתה מוציא אותו מתוך החממה או יוצר מערבולת במהלך שינויי מדיה יכול לגרום לחלק מאורגנואידים לצאת ממיקרוגל ולנתיך עם אחרים13.

הנישה של תא הנבט של היונקים מורכבת ורב-תאיים. התאים השונים בתיבה כגון תאים sertoli, peritubular myoid תאים, תאים ליידיג כל תורמים לתחזוקת תא הנבט ואת הגורל16,17. ניתן להשתמש במערכת הארגונית שלנו לטיפול במסלולי איתות שונים בסוגי תאים ספציפיים. גן של עניין יכול להיות למעלה או להוריד מוסדר בתאי הנבט או תאים אחרים האשכים הסומטיים כגון תאים peritubular myoid, תאי Sertoli. תאים אלה שונה יכול להיות בשילוב עם תאים אחרים האשכים כדי ליצור אורגנואידים שונה האשכים, אשר ניתן להשתמש בו כדי ללמוד את ההשפעות של העריכה על התצהיר ECM, מורפוגנזה, תא התא איתות, ו זרע. שינויים כאלה יכולים להתבצע גם כדי ליצור פנוטיפים מחלה ספציפיים עבור הקרנות התרופות. לעומת שיטות אחרות עבור הדור של מודלים כגון התרבות בטיפות תלויות או נמוך אולטרה מצורף לוחות U-תחתון8, באמצעות מערכת המיקרוגל אפשרה מודל אורגאיד האשכים כי הוא נגיש יותר מאפשר שינויים. לדוגמה, תאים נבט עשוי להיות מהונדסים גנטית או מטופלים עם גורמים ניסיוניים ומניחים על סוג פראי מראש האורגאיד על ידי צנטריפוגה פשוטה ונצפתה על השפעות במורד הזרם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לדוקטור אנגרין יש אינטרס פיננסי. בטכנולוגיית הצובר כממציא

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי NIH/HD091068-01 לד ר רינה דוברינסקי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm ultra low attachment tissue culture dish Corning #CLS3262
100 mm tissue culture dish Corning #353803
Aggrwell 400 Stemcell Technologies #34411
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies #07010
Collagenase type IV from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich #C5138 referred as Collagenase IV S
Collagenase type IV Worthington Worthington-Biochem #LS004189 referred as Collagenase IV W
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich #DN25
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 Gibco #11330-032
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose Sigma-Aldrich #D6429
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich #D8537
Epidermal Growth Factor R&D Systems #236-EG
Falcon Cell Strainers 70 µm FisherScientific #352350
Falcon Cell Strainers 40 µm FisherScientific #352340
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific #12483-020
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco #41400-045
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich #P4333
Porcine testicular tissue Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada)
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore #SCGP00525
Trypsin-EDTA Sigma #T4049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  2. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, (1), 25-36 (2010).
  3. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo Journal. 32, (20), 2708-2721 (2013).
  4. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160, (1-2), 324-338 (2015).
  5. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499, (7459), 481-484 (2013).
  6. Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545, (7652), 48-53 (2017).
  7. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424, (6951), 870-872 (2003).
  8. Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger. Biology of Reproduction. 96, (3), 720-732 (2017).
  9. Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7, (1), 82-82 (2018).
  10. Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
  11. Baert, Y., et al. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8, (1), 30-38 (2017).
  12. Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. (2019).
  13. Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates. Journal of Visualized Experiments. (81), 50665 (2013).
  14. Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100, (6), 1648-1660 (2019).
  15. González, R., Dobrinski, I. Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models. ILAR Journal. 56, (1), 83-98 (2015).
  16. Oatley, J. M., Brinster, R. L. The germline stem cell niche unit in mammalian testes. Physiological Reviews. 92, (2), 577-595 (2012).
  17. Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development. Proceedings of the National Academy of Science USA. 113, (7), 1829-1834 (2016).
הדור של מבנה האשך של פורצין עם הארכיטקטורה הספציפית ביותר באמצעות התרבות של המיקרוגל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sakib, S., Yu, Y., Voigt, A., Ungrin, M., Dobrinski, I. Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture. J. Vis. Exp. (152), e60387, doi:10.3791/60387 (2019).More

Sakib, S., Yu, Y., Voigt, A., Ungrin, M., Dobrinski, I. Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture. J. Vis. Exp. (152), e60387, doi:10.3791/60387 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter