Generatie van varkens testiculaire Organoïden met testis specifieke architectuur met behulp van micro well Culture
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de reproduceerbare generatie van varkens testiculaire organoïden met testis specifieke weefsel architectuur met behulp van het in de handel verkrijgbare micro well cultuur systeem.
Abstract
Organoïden zijn driedimensionale structuren bestaande uit meerdere celtypen die in staat zijn om weefsel architectuur en functies van organen in vivo te recapituleren. De vorming van organoïden heeft verschillende wegen van fundamenteel en translationeel onderzoek geopend. In de afgelopen jaren, testiculaire organoïden hebben vergaard belang op het gebied van de mannelijke reproductieve biologie. Testiculaire organoïden zorgen voor de studie van celcelinteracties, weefsel ontwikkeling en de niche microomgeving van de kiemcellen en vergemakkelijken de screening van geneesmiddelen en toxiciteit bij hoge doorvoer. Een methode is nodig om op betrouwbare en reproduceerbare wijze testiculaire organoïden te genereren met testis specifieke weefsel architectuur. Het micro well cultuur systeem bevat een dicht assortiment piramidevormige micro putten. Testiculaire cellen afgeleid van de pre-puberale teelballen worden gecentrifugeerd in deze micro putten en gekweekt om testiculaire organoïden te genereren met testis-specifieke weefsel architectuur en celassociaties. Via dit proces kunnen duizenden homogene organoïden worden gegenereerd. Het protocol dat hier wordt gerapporteerd zal van groot belang zijn voor onderzoekers die mannelijke reproductie bestuderen.
Introduction
De laatste jaren is er een opleving van interesse in driedimensionale (3D) organoïden. Verschillende organen zoals darm1, maag2, alvleesklier3,4, lever5en Brain6 zijn met succes afgeleid in 3D organoïde systemen. Deze organoïden hebben architecturale en functionele gelijkenissen met de organen in vivo en zijn meer biologisch relevant voor de studie van weefsel micro dan monolaag cultuur systemen7. Als gevolg daarvan, testiculaire organoïden begonnen te Garner belang als goed8,9,10,11,12. De meeste methoden die tot nu toe zijn gerapporteerd, zijn complex, niet-hoog doorvoer10 en vereisen de toevoeging van ECM-eiwitten8,10. Deze complexiteit leidt ook tot problemen met reproduceerbaarheid. Er is een eenvoudige en reproduceerbare methode nodig die het mogelijk maakt om testiculaire organoïden te genereren met celassociaties die als testis in vivo zijn.
We hebben onlangs een systeem gerapporteerd om deze vereisten op te lossen12. Met behulp van het varken als model, hebben we een centrifugale geforceerde aggregatie benadering in het titer-systeem gebruikt. In het titer-systeem bevat elk putje een groot aantal identieke kleinere microwells13. Dit maakt het mogelijk om talrijke spheroïden van uniforme grootte te genereren. Het titer-systeem heeft het genereren van grote aantallen uniforme organoïden mogelijk gemaakt met een testis-specifieke architectuur. Het systeem is eenvoudig en vereist geen toevoeging van ECM-eiwitten.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben een eenvoudige methode opgezet waarmee de consistente, reproduceerbare generatie van grote aantallen testiculaire organoïden met weefsel architectuur, vergelijkbaar met testis in vivo12, mogelijk is. Hoewel de aanpak werd ontwikkeld met behulp van de cellen van varkens testis, is het breder toepasbaar ook op muis, niet-menselijke primaat en menselijke testis12. Er zijn een aantal verschillende methoden gerapporteerd voor de productie van testiculaire organoïden<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH/NICHD HD091068-01 aan Dr. Ina Dobrinski.
Materials
| 100 mm ultra low attachment tissue culture dish | Corning | #CLS3262 | |
| 100 mm tissue culture dish | Corning | #353803 | |
| Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | #07010 | |
| Collagenase type IV from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | referred as Collagenase IV S |
| Collagenase type IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | referred as Collagenase IV W |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 | Gibco | #11330-032 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | #236-EG | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | FisherScientific | #352350 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | FisherScientific | #352340 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | #41400-045 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| Porcine testicular tissue | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada) | ||
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | #SCGP00525 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Abbott, A. Cell culture: biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
- Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 82-82 (2018).
- Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
- Baert, Y., et al. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. , (2019).
- Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates. Journal of Visualized Experiments. (81), 50665 (2013).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
- González, R., Dobrinski, I. Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models. ILAR Journal. 56 (1), 83-98 (2015).
- Oatley, J. M., Brinster, R. L. The germline stem cell niche unit in mammalian testes. Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).
- Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development. Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).
