Burada, ticari olarak mevcut mikrokuyu kültür sistemini kullanarak testis spesifik doku mimarisi ile domuz testis organoidlerinin tekrarlanabilir üretimi için bir protokol sıyoruz.
Organoidler, doku mimarisini ve organların işlevlerini in vivo olarak özetleyebilen birden fazla hücre tipinden oluşan üç boyutlu yapılardır. Organoidlerin oluşumu temel ve çevirisel araştırmaların farklı yollarını açmıştır. Son yıllarda, testis organoidler erkek üreme biyolojisi alanında ilgi topladı. Testis organoidleri hücre-hücre etkileşimleri, doku gelişimi ve germ hücre niş mikroortamda çalışma için izin ve yüksek iş yapımı ilaç ve toksisite tarama kolaylaştırmak. Testis spesifik doku mimarisine sahip testis organoidlerinin güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde üretilmesi için bir yöntem gereklidir. Microwell kültür sistemi piramit şeklinde mikrowelller yoğun bir dizi içerir. Ergenlik öncesi testislerden elde edilen testis hücreleri bu mikrowelllere santrifüj edilir ve testis-spesifik doku mimarisi ve hücre çağrışımları ile testis organı oluşturmak için kültürlenir. Bu süreç le binlerce homojen organoid üretilebilir. Burada bildirilen protokol, erkek üremesi üzerinde araştırma yapmak ta bir araştırmacının ilgisini çekebilir.
Son yıllarda, üç boyutlu (3D) organoidler ilgi bir canlanma olmuştur. Bağırsak gibi farklı organlar1, mide2, pankreas3,4, karaciğer5, ve beyin6 başarıyla 3D organoid sistemlere türetilmiştir. Bu organoidler in vivo organlara mimari ve fonksiyonel benzerlikler var ve daha biyolojik olarak monolayer kültürsistemleri7 daha doku mikroçevre çalışması için ilgilidir. Sonuç olarak, testis organoidler de ilgi toplamaya başlamıştır8,9,10,11,12. Şimdiye kadar bildirilen yöntemlerin çoğunluğu karmaşık, non-yüksek iş10 ve ECM proteinleri8,10eklenmesini gerektirir. Bu karmaşıklık aynı zamanda tekrarlanabilirlik ile ilgili sorunlara yol açar. Testis in vivo gibi hücre çağrışımları olan testis organoidlerinin oluşumuna olanak tanıyan basit ve tekrarlanabilir bir yöntem gereklidir.
Biz son zamanlarda bu gereksinimleri12adresine bir sistem bildirdiniz. Domuzu model olarak kullanarak microwell sisteminde santrifüj zorunlu toplama yaklaşımını kullandık. Microwell sisteminde, her kuyu aynı küçük microwells13çok sayıda içerir. Bu üniforma boyutu çok sayıda küresel nesil sağlar. Microwell sistemi, testislere özgü bir mimariye sahip çok sayıda tek tip organoidin üretilebini sağladı. Sistem basittir ve ECM proteinlerinin eklenmesini gerektirmez.
Biz in vivo12testis benzer doku mimarisi ile testis organoidlerin çok sayıda tutarlı, tekrarlanabilir nesil sağlayan basit bir yöntem kurduk. Yaklaşım domuz testis hücreleri kullanılarak geliştirilmiş olsa da, daha geniş fare, insan olmayan primat ve insan testis12için de geçerlidir. Testis organoidleri 8 ,9,10,11 üretmek için farklı yöntemler<sup class…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NIH/NICHD HD091068-01 tarafından Dr. Ina Dobrinski tarafından desteklenmiştir.
100 mm ultra low attachment tissue culture dish | Corning | #CLS3262 | |
100 mm tissue culture dish | Corning | #353803 | |
Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | #07010 | |
Collagenase type IV from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | referred as Collagenase IV S |
Collagenase type IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | referred as Collagenase IV W |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 | Gibco | #11330-032 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
Epidermal Growth Factor | R&D Systems | #236-EG | |
Falcon Cell Strainers 70 µm | FisherScientific | #352350 | |
Falcon Cell Strainers 40 µm | FisherScientific | #352340 | |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | #41400-045 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
Porcine testicular tissue | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada) | ||
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | #SCGP00525 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |