Generering av porcin testikulär Organoider med testis specifik arkitektur med hjälp av Microwell kultur
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för reproducerbar generering av porcin testikulär organoider med testiklarna specifik vävnad arkitektur med hjälp av kommersiellt tillgängliga mikrobrunn kultur system.
Abstract
Organoider är tredimensionella strukturer som består av flera celltyper som kan rekapitulera vävnad arkitektur och funktioner av organ in vivo. Bildandet av organoider har öppnat upp olika vägar för grundläggande och translationell forskning. Under de senaste åren, testikulär organoider har samlat intresse inom området för manlig reproduktionsbiologi. Testikulär organoider möjliggöra studiet av cell-cell interaktioner, vävnad utveckling, och könsceller nisch mikromiljö och underlätta hög genomströmning Drug och toxicitet screening. En metod behövs för att tillförlitligt och reproducerbart generera testikelorganoider med testiklarna specifika vävnads arkitektur. Mikrobrunn kultur system innehåller ett tätt utbud av Pyramid-formade mikrobrunnar. Testikelceller som härrör från pre-pubertal testiklarna centrifugeras i dessa mikrobrunnar och odlas för att generera testikulär organoider med testis-specifik vävnad arkitektur och cell associationer. Tusentals homogena organoider kan genereras via denna process. Det protokoll som rapporteras här kommer att vara av stort intresse för forskare som studerar manlig reproduktion.
Introduction
Under de senaste åren har det varit ett återuppvaknande av intresset för tredimensionella (3D) organoider. Olika organ såsom tarmen1, mage2, bukspottkörteln3,4, lever5, och hjärna6 har framgångsrikt erhållits i 3D Organoid system. Dessa organoider har arkitektoniska och funktionella likheter med organen in vivo och är mer biologiskt relevanta för studier av vävnad mikromiljö än enskiktslager kultur system7. Som ett resultat, testikulär organoider har börjat Garner intresse också8,9,10,11,12. De flesta metoder som hittills rapporterats är komplexa, icke-hög genomströmning10 och kräver tillsats av ECM-proteiner8,10. Denna komplexitet leder också till problem med reproducerbarhet. En enkel och reproducerbar metod behövs som gör det möjligt för generering av testikulär organoider med cell-föreningar som är som testiklarna in vivo.
Vi har nyligen rapporterat ett system för att hantera dessa krav12. Med hjälp av grisen som modell använde vi en centrifugaltvingad aggregerings metod i mikrobrunn-systemet. I mikrobrunn-systemet innehåller varje brunn ett stort antal identiska mindre mikrobrunnar13. Detta möjliggör generering av många spheroids av enhetlig storlek. Mikrobrunn-systemet möjliggjorde generering av ett stort antal enhetliga organoider med en testis-specifik arkitektur. Systemet är enkelt och kräver inte tillsats av ECM-proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har etablerat en enkel metod som möjliggör en konsekvent, repeterbar generation av stora mängder testikelorganoider med vävnads arkitektur som liknar testiklarna in vivo12. Medan tillvägagångssättet utvecklades med hjälp av svin testiklarna celler, det är mer allmänt tillämplig även på mus, icke-mänskliga primater och mänskliga testiklarna12. Ett antal olika metoder har rapporterats för framställning av testikelorganoider8,</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH/NICHD HD091068-01 till Dr Ina Dobrinski.
Materials
| 100 mm ultra low attachment tissue culture dish | Corning | #CLS3262 | |
| 100 mm tissue culture dish | Corning | #353803 | |
| Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | #07010 | |
| Collagenase type IV from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | referred as Collagenase IV S |
| Collagenase type IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | referred as Collagenase IV W |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 | Gibco | #11330-032 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
| Epidermal Growth Factor | R&D Systems | #236-EG | |
| Falcon Cell Strainers 70 µm | FisherScientific | #352350 | |
| Falcon Cell Strainers 40 µm | FisherScientific | #352340 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | #41400-045 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
| Porcine testicular tissue | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada) | ||
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | #SCGP00525 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Abbott, A. Cell culture: biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
- Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 82-82 (2018).
- Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
- Baert, Y., et al. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. , (2019).
- Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates. Journal of Visualized Experiments. (81), 50665 (2013).
- Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
- González, R., Dobrinski, I. Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models. ILAR Journal. 56 (1), 83-98 (2015).
- Oatley, J. M., Brinster, R. L. The germline stem cell niche unit in mammalian testes. Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).
- Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development. Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).
