هنا ، نقدم بروتوكولا للجيل القابل للاستنساخ من الخصية الوركية مع بنيه نسيجيه خاصه بالخصية باستخدام نظام الاستزراع المجهري المتوفر تجاريا.
Organoids هي ثلاثه هياكل الابعاد تتالف من أنواع الخلايا المتعددة التي هي قادره علي تلخيص هندسه الانسجه ووظائف الأعضاء في الجسم المجري. وقد فتحت تشكيل الهيكل التنظيمي سبلا مختلفه للبحوث الاساسيه والانتقالية. في السنوات الاخيره ، وقد حصلت organoids الخصية الاهتمام في مجال البيولوجيا الانجابيه الذكور. الخصية العضوية تسمح للدراسة من التفاعلات خليه الخلية ، وتطوير الانسجه ، والخلية الجرثومية البيئة الدقيقة المتخصصة وتسهيل الانتاجيه العالية المخدرات والسمية الفرز. وهناك حاجه إلى طريقه موثوق بها والتكرار توليد العضوية الخصية مع الهيكل الانسجه المحددة الخصية. يحتوي نظام الثقافة microwell علي مجموعه كثيفه من ميكروويلس علي شكل هرم. خلايا الخصية المستمدة من الخصيتين قبل البلوغ طرد في هذه الميكروويلس ومثقف لتوليد organoids الخصية مع البنية الانسجه الخاصة بالخصية والجمعيات الخلية. يمكن توليد آلاف من العضويات المتجانسة عبر هذه العملية. سيكون البروتوكول المذكور هنا موضع اهتمام واسع للباحثين الذين يدرسون تكاثر الذكور.
في السنوات الاخيره ، كان هناك تجدد الاهتمام في ثلاثي الابعاد (3D) الهيكل التنظيمي. وقد تم اشتقاق أجهزه مختلفه مثل الأمعاء1، المعدة2، البنكرياس3،4، الكبد5، والدماغ6 بنجاح إلى أنظمه organoid 3d. هذه العضوية لديها أوجه التشابه المعمارية والوظيفية للأعضاء في الجسم الحيوي وأكثر اهميه بيولوجيا لدراسة البيئة المجهرية الانسجه من النظم الثقافية أحاديه الطبقة7. ونتيجة لذلك ، وقد بدات organoids الخصية لكسب الفائدة كذلك8،9،10،11،12. معظم الطرق المبلغ عنها حتى الآن هي معقده, غير عاليه الانتاجيه10 وتتطلب أضافه البروتينات ECM8,10. هذا التعقيد يؤدي أيضا إلى مشاكل مع استنساخ. وهناك حاجه إلى طريقه بسيطه وقابله للاستنساخ التي تسمح للجيل من الخصية العضوية مع الجمعيات الخلية التي هي مثل الخصية في الجسم الفيفو.
وقد أبلغنا مؤخرا عن نظام لمعالجه هذه المتطلبات12. باستخدام خنزير كنموذج ، استخدمنا الطرد المركزي القسري نهج التجميع في نظام microwell. في ال [ميكروسس] نظامه, يحتوي كل بئر [ا لرج نومبر] من متماثلة صغيره ميكروويلس13. هذا يسمح للجيل من يتعدد خزان من حجم متسقة. وقد مكن نظام microwell من توليد اعداد كبيره من الهيكل التنظيمي الموحد مع بنيه خاصه بالخصية. النظام بسيط ولا يتطلب أضافه بروتينات ECM.
لقد انشانا طريقه بسيطه تسمح للجيل متسقة وقابله للتكرار من اعداد كبيره من organoids الخصية مع الهندسة المعمارية الانسجه التي تشبه الخصية في الجسم المجري12. في حين تم تطوير النهج باستخدام خلايا الخصية الخنازير ، فانه ينطبق علي نطاق أوسع أيضا علي الماوس ، الرئيسيات غير البشرية والخص?…
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة/NICHD HD091068 إلى الدكتورة أينا Dobrinski.
100 mm ultra low attachment tissue culture dish | Corning | #CLS3262 | |
100 mm tissue culture dish | Corning | #353803 | |
Aggrwell 400 | Stemcell Technologies | #34411 | |
Anti-Adherence Rinsing Solution | Stemcell Technologies | #07010 | |
Collagenase type IV from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | #C5138 | referred as Collagenase IV S |
Collagenase type IV Worthington | Worthington-Biochem | #LS004189 | referred as Collagenase IV W |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | #DN25 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 | Gibco | #11330-032 | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | #D6429 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | #D8537 | |
Epidermal Growth Factor | R&D Systems | #236-EG | |
Falcon Cell Strainers 70 µm | FisherScientific | #352350 | |
Falcon Cell Strainers 40 µm | FisherScientific | #352340 | |
Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | #12483-020 | |
Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | #41400-045 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | #P4333 | |
Porcine testicular tissue | Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada) | ||
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit | Millipore | #SCGP00525 | |
Trypsin-EDTA | Sigma | #T4049 |