Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Generering av porcin testikulär Organoider med testis specifik arkitektur med hjälp av Microwell kultur

Published: October 3, 2019 doi: 10.3791/60387

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för reproducerbar generering av porcin testikulär organoider med testiklarna specifik vävnad arkitektur med hjälp av kommersiellt tillgängliga mikrobrunn kultur system.

Abstract

Organoider är tredimensionella strukturer som består av flera celltyper som kan rekapitulera vävnad arkitektur och funktioner av organ in vivo. Bildandet av organoider har öppnat upp olika vägar för grundläggande och translationell forskning. Under de senaste åren, testikulär organoider har samlat intresse inom området för manlig reproduktionsbiologi. Testikulär organoider möjliggöra studiet av cell-cell interaktioner, vävnad utveckling, och könsceller nisch mikromiljö och underlätta hög genomströmning Drug och toxicitet screening. En metod behövs för att tillförlitligt och reproducerbart generera testikelorganoider med testiklarna specifika vävnads arkitektur. Mikrobrunn kultur system innehåller ett tätt utbud av Pyramid-formade mikrobrunnar. Testikelceller som härrör från pre-pubertal testiklarna centrifugeras i dessa mikrobrunnar och odlas för att generera testikulär organoider med testis-specifik vävnad arkitektur och cell associationer. Tusentals homogena organoider kan genereras via denna process. Det protokoll som rapporteras här kommer att vara av stort intresse för forskare som studerar manlig reproduktion.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Under de senaste åren har det varit ett återuppvaknande av intresset för tredimensionella (3D) organoider. Olika organ såsom tarmen1, mage2, bukspottkörteln3,4, lever5, och hjärna6 har framgångsrikt erhållits i 3D Organoid system. Dessa organoider har arkitektoniska och funktionella likheter med organen in vivo och är mer biologiskt relevanta för studier av vävnad mikromiljö än enskiktslager kultur system7. Som ett resultat, testikulär organoider har börjat Garner intresse också8,9,10,11,12. De flesta metoder som hittills rapporterats är komplexa, icke-hög genomströmning10 och kräver tillsats av ECM-proteiner8,10. Denna komplexitet leder också till problem med reproducerbarhet. En enkel och reproducerbar metod behövs som gör det möjligt för generering av testikulär organoider med cell-föreningar som är som testiklarna in vivo.

Vi har nyligen rapporterat ett system för att hantera dessa krav12. Med hjälp av grisen som modell använde vi en centrifugaltvingad aggregerings metod i mikrobrunn-systemet. I mikrobrunn-systemet innehåller varje brunn ett stort antal identiska mindre mikrobrunnar13. Detta möjliggör generering av många spheroids av enhetlig storlek. Mikrobrunn-systemet möjliggjorde generering av ett stort antal enhetliga organoider med en testis-specifik arkitektur. Systemet är enkelt och kräver inte tillsats av ECM-proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Anmärkning: testiklarna från 1-veckors gamla smågrisar erhölls från en kommersiell gris odling som biprodukt från kastrering av kommersiella svin. Inköp av testiklarna godkändes av Animal Care kommittén vid University of Calgary.

1. beredning av enzym lösningar för vävnadsnedbrytning

Anmärkning: tre olika enzymatiska lösningar behövs, som omfattar två olika kollagenaslösningar (lösning A, B) och en deoxyribonuclease I (DNase I) lösning.

  1. För att bereda lösning A, Lös 20 mg kollagenase IV S (tabell över material) och 40 mg kollagenas IV W (tabell över material) i 25 ml av hög glukos Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM). Filtrera sedan sterilisera med ett 0,22 μm filter. Tillsätt 0,4 mL fetalt bovint serum (FBS) till lösning A för att hämma trypsin aktivitet.
  2. För beredning av lösning B, lös 80 mg kollagenas IV W (tabell över material) i 40 ml DMEM. Filtrera sedan sterilisera med ett 0,22 μm filter.
  3. För beredning av DNase I lösning (7 mg/mL), lös 70 mg DNase i i 10 mL DMEM. Filtrera sedan sterilisera med ett 0,22 μm filter.
    Anmärkning: enzym koncentrationen för kollagenase IV-lösningar som beskrivs här varierar från de koncentrationer (2 mg/mL) som anges i den ursprungliga artikel14. Det nuvarande protokollet ger celler med något högre lönsamhet. Celler som isoleras av båda protokollen producerar dock organoider med identisk vävnads arkitektur.

2. testis vävnad enzymatisk matsmältning

  1. Samla testiklarna i en steril bägare och tvätta med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som innehåller 1% penicillin/streptomycin (P/S). Efter tvättning, överföra testiklarna till en 100 mm vävnad kultur skålen med PBS som innehåller 1% P/S och ta bort tunica vaginalis och bitestiklarna använda autoklaverade sax och pinpett. Överför de isolerade testiklarna till en ny 100 mm maträtt och tvätta noggrant med PBS som innehåller 1% P/S.
  2. För att bibehålla sterilitet, använda en annan uppsättning av sterila sax och pinmett att skala testikel parenkymet ur Tunica albuginea. Skär testiklarna längs den längsgående axeln direkt under Tunica. Sedan skala testiklarna ur Tunica med hjälp av två pincett och placera i en ny 100 mm maträtt innehållande 1 mL DMEM med 1% P/S.
  3. Finhacka de skalade testiklarna med steril sax i 1-2 mm vävnad bitar. Efter hackning, Använd sterila pinkoppar för att ta bort vita fragment av bindväv.
  4. Överför de malet vävnad bitarna till lösning A och upp det upp till 50 mL med DMEM för att få en koncentration av 0,4 mg/mL för kollagenase IV S (tabell över material) och en koncentration av 0,8 mg/ml för kollagenas IV W (tabell över material). Placera lösning A som innehåller vävnaden bitarna i en 37 ° c vattenbad i 30 min, försiktigt Invertera rören var 5 min och kontrollera visuellt för frisättning av DNA.
    1. Tillsätt 500 μL DNase I om fritt flytande DNA observeras. Efter 30 min, Centrifugera röret vid 90 x g med bromsar vid 25 ° c för 1,5 min och Kassera supernatanten.
      Anmärkning: DNA skulle framstå som ett grumligt ämne. När rören skakas, vävnaden bitar bosätta sig medan DNA skulle hålla sig flytande.
  5. Tillsätt lösning B till röret och upp till 50 mL med DMEM för att få en koncentration på 1,2 mg/mL kollagenase IV W (tabell över material). Placera röret i 37 ° c vattenbad i 30 min och försiktigt Invertera röret var 5 min. Tillsätt 500 μL DNase I om fritt flytande DNA observeras.
  6. Efter 30 min centrifugeras röret vid 90 x g med bromsar vid 25 ° c i 1,5 min. Efter att Kassera supernatanten och tvätta en gång med PBS med 1% P/S.
    Anmärkning: de kasserade supernatanterna från både lösning A och B kommer i första hand att innehålla interstitiella celler.
  7. Upp röret med PBS upp till 50 mL. Samla försiktigt in tubuli från toppen och placera den i ett nytt 50 mL-rör.
    Obs: de stora osmälta vävnaderna fragment snabbt bosätta sig i botten, medan smält seminihaltiga tubuli kommer att förbli i suspension. Inga stora vävnads fragment ska samlas in. Denna procedur kan upprepas flera gånger tills lösningen i det ursprungliga röret är nästan klar och bara osmält vävnads fragment är kvar, som kan kasseras.
  8. Centrifugera tubuli på 90 x g med bromsar vid 25 ° c för 1,5 min och Kassera supernatanten. Tillsätt färsk PBS och centrifugera igen. Upprepa detta tvättsteg två gånger.
  9. Efter den sista PBS tvätta, ta bort supernatanten och Omsuspendera de seminihaltiga tubuli i 5 mL PBS. Tillsätt sedan 15 mL 0,25% trypsin-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) till tubuli. Placera röret i 37 ° c vattenbad och vänd försiktigt var 2 min. Om en massa fritt flytande DNA observeras, tillsätt 500 μL DNase I med 5 mL DMEM.
  10. Utvärdera enzymatisk nedbrytning av tubuli till enstaka celler under mikroskopet (först efter 5 min, sedan varje 2 min). Om de flesta enstaka celler kan upptäckas, stoppa reaktionen med 5 mL FBS och filtrera genom en 70 μm mesh och sedan genom en 40 μm mesh.
    Anmärkning: försiktighet bör iakttas som CAPS på 50 mL-rören som används för digestioner (lösning A, B och 0,25% trypsin-EDTA) är ordentligt åtdragna. Om förorening i vattenbadet är ett bekymmer, kan paraffin film lindas runt locket för att säkerställa sterilitet.
  11. Centrifugera de enskilda cellerna vid 500 x g med bromsar vid 25 ° c i 5 min, Omsuspendera i anriknings mediet (Dulbecco modifierad Eagle medium F/12 (DMEM/F12) som innehåller 5% FBS och 1% P/S) och räkna antalet livskraftiga celler. Detta är den första cellpopulationen. Fix 100 x 103 celler och utföra immunocytokemi för köns CELLS markör UCHL1 (ubiquitin C-Terminal Hydrolase L1) som beskrivs12 och bestämma andelen könsceller i denna startcell population.
    Anmärkning: köns cells markör Promyelocytisk leukemi zink finger protein (PLZF)15 kan också användas som ett lämpligt alternativ för UCHL1. I den inledande cellpopulationen är den förväntade cell avkastningen runt 700-800 x 109/g vävnad. Andelen könsceller i denna cellpopulation bör vara 4-5%.
  12. Placera runt 20 x 106 av denna start cells population i två ultralåg infästning 100 mm petriskålar (10 x 106 celler suspenderade i 10 ml DMEM/F12 innehållande 1% P/S i varje maträtt) i 2 dagar i en inkubator för vävnadsodling (37 ° c , 5% CO2, 21% syre). Utför köns cells berikningen med de återstående cellerna.
    Anmärkning: för att säkerställa optimal lönsamhet och cell kvalitet, medan köns cells anrikningen och den efterföljande kvantifieringen sker, placeras startcell populationen i kulturen i Ultra Low tillbehör vävnad kultur rätter för 2 dagar.

3. berikning av könsceller

Anmärkning: det förfarande som beskrivs ovan ger främst Sertoli celler och könsceller. Olika vidhäftning egenskaper möjliggör separation av Sertoli celler och könsceller via differential plätering.

  1. Utsäde 20-25 x 106 celler i den första cellen populationen per 100 mm vävnad kultur skålen i en total volym av 8 ml anrikningsmedium (DMEM/F12 med 5% FBS och 1% P/S) för differential plätering. Placera cellerna i en inkubator (37 ° c, 5% CO2, 21% O2) och efter 1,5 h, se till att majoriteten av Sertoli celler fäster på plattan.
  2. Samla och kombinera supernatanten (huvudsakligen innehållande könsceller) med 2 plattor till en ny 100 mm plåt och placera tillbaka den i inkubatorn. Efter 1 h, återigen kombinera supernatanten av 2 plattor till en ny 100 mm tallrik. Placera plattorna tillbaka i inkubatorn för övernattning.
    Anmärkning: supernatanterna kombinerade kommer främst att innehålla könsceller. De vidhäftat cellerna som kasseras tillsammans med plattorna är främst testikulär somatiska celler som Sertoli och peritubulära myoid celler.
  3. Samla de berikade könscellerna i två fraktioner enligt följande.
    Anmärkning: berikade könsceller fäster på olika sätt, icke-anhängare fraktion och något fastnat fraktion. Båda dessa fraktioner bildar tillsammans den berikade köns cells populationen
    1. Icke anhängare fraktion: samla supernatanten.
    2. Något anhängare fraktion: Tvätta plattorna försiktigt med PBS, behandla med 2 mL 1:20 utspädning av 0,25% trypsin-EDTA i 5 min vid rumstemperatur, stoppa reaktionen med 2 mL anrikningsmedium och samla i samma rör som icke sittande fraktion.
      Anmärkning: 0,25% trypsin-EDTA måste spädas med PBS att producera en 1:20 trypsin lösning.
  4. Räkna det totala antalet celler med hjälp av en cell räknare, Fix 100 x 103 celler och utföra immunocytokemi för köns CELLS markör UCHL1 som beskrivs12 och bestämma andelen könsceller i denna anrikad cellpopulation.
    Anmärkning: andelen könsceller i denna cellpopulation bör vara minst 60-70%. Eftersom immunocytokemi för kvantifiering skulle kräva 1 dag, de anrikade cellerna bör placeras i en ultra låg infästning 100 mm petriskål med DMEM/F12 kompletteras med 1% P/S för varaktigheten för att säkerställa optimal cell kvalitet och lönsamhet.

4. beredning av celler för sådd

  1. För att skörda startcellen förberedelse, samla supernatanten i en 50 mL tub från Ultra låg infästning 100 mm rätter. Tvätta plattorna kraftigt med PBS för att samla in de klibbad cellerna. Ingen enzymatisk nedbrytning behövs.
    Notera: några av testikelcellerna, främst Sertoli celler, kan något följa de ultra låg fästen plattorna.
  2. Kombinera startcell beredning och berikade könsceller för att få en fungerande cell beredning som innehåller 25% könsceller. Centrifugera vid 500 x g med bromsar vid 25 ° c i 5 min, Kassera supernatanten och Omsuspendera cellerna i organoidbildande medium (DMEM/F12 kompletterat med insulin 10 μg/ml, transferrin 5,5 μg/ml, selen 6,7 ng/ml, 20 ng/ml Epidermal tillväxtfaktor , 1% P/S). Justera CELLTÄTHETEN till 2,4 x 106 per ml.
    Anmärkning: varje brunn i mikroborrplattorna som används13 i detta protokoll innehöll 1 200 mikrobrunnar.
  3. Använd formeln nedan för att beräkna antalet celler per brunn som beskrivs nedan.
    Antal celler per brunn = antal mikrobrunnar x antal celler som ska grupperas för varje Organoid.
  4. För att generera organoider från 1 000 celler vardera, utsäde vardera med (1 200 x 1 000 celler vardera =) 1,2 x 106 celler. Justera CELLTÄTHETEN i cellsuspensionen på ett sätt som cellerna är seedade i en volym av 0,5 mL medium. För organoider bildas från 1 000 celler vardera, använda en densitet på 2,4 x 106 celler per mL (1,2 x 106 celler i 0,5 ml).

5. beredning av mikrobrunnar för att ta emot celler

Anmärkning: för att säkerställa att cellerna inte fastnar på mikrobrunn ytan, behandla med en ytaktivt sköljlösning som finns att köpa av tillverkaren.

  1. Tillsätt 0,5 mL sköljnings lösning till varje brunn. Se till att inga luftbubblor fastnar i brunnen. För att avlägsna luftbubblor, om någon, Centrifugera plattan vid 2 000 x g med bromsar vid 25 ° c i 2 min.
  2. Observera plattan under en låg förstoring inverterad Mikroskop, för att kontrollera att bubblorna har avlägsnats från mikrobrunnarna. Om fångade bubblor observeras, Centrifugera igen vid 2 000 x g med bromsar vid 25 ° c i 2 min för att avlägsna eventuella kvarvarande bubblor.
  3. Täck plattan med locket och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. Efter avslutad behandling, ta bort Sköljlösningen och tvätta omedelbart plattan med sterilt vatten eller PBS. Se till att plattan inte torkar ut efter behandlingen med Sköljlösningen.

6. generering av testikulär organoider

  1. Tillsätt 0,5 mL Organoid formation medium (utan celler) till varje brunn och centrifugera vid 2 000 x g med bromsar vid 25 ° c i 2 min för att avlägsna eventuella fångade luftbubblor. Observera brunnen under en låg förstoring inverterad Mikroskop för att kontrollera att luftbubblor har avlägsnats. Om fångade bubblor observeras, Centrifugera igen vid 2 000 x g med bromsar vid 25 ° c i 2 min för att avlägsna eventuella kvarvarande bubblor.
  2. Tillsätt 0,5 mL av den arbetande cellsuspensionen och blanda försiktigt genom pipettering upp och ner. Centrifugera vid 500 x g med bromsar vid 25 ° c i 5 min. Använd ett inverterat Mikroskop för att kontrollera att cellerna har klustrat i mikrobrunnarna.
  3. Överför plattan till en cellkultur inkubator och kultur i 5 dagar. Ändra halva mediet varannan dag.
    1. För att byta medium utan att förlora några organoider, tryck pipettspetsen till väggen i brunnen och sänk försiktigt för att röra menisken och sakta dra mediet. Se till att följa menisken som det droppar ner. För att lägga till färskt medium, vidrör pipettspetsen mot väggen på brunnen på samma sida som mediet tillbakadragande och tillsätt färskt medium försiktigt mot brunnen väggen, så att den långsamt rinner ner i väggen.
  4. För att återvinna organoider, Pipettera försiktigt mediet upp och ner med hjälp av en bred munpipett. Detta skulle göra det möjligt för organoider att komma ut ur mikrobrunnarna.
  5. Samla in organoider, tvätta med PBS, fixa och utföra immunocytokemi för köns cells markör (UCH-L1), Sertoli cell markör (GATA bindande protein 4-GATA4), peritubulär myoid cell markör (α-glatt muskel Actin-αSMA) och Leydig cell markör (cytokrom P450-CYP450) enligt beskrivningen12 och visualisera under ett konfokalmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Isolerade celler från 1-veckors gamla svin testiklar som odlades i mikrobrunnarna själv organiserade i sfäooider (figur 1A, figur 2), med avgränsad och distinkt exteriör (seminiferiska epitel) och invändiga fack ( interstitium) (figur 1B, figur 2). De två avdelningarna var åtskilda av ett kollagen IV+ ve basalmembran. UCH-L1+ ve könsceller och GATA4+ ve Sertoli celler var i ytterfacket på basalmembranet (figur 1B, figur 2). α-SMA+ ve peritubulär myoid celler lokaliserades längs insidan av basalmembranet medan cytokrom P450+ ve Leydig celler var i mitten av interstitiets (figur 1B, figur 2). Denna struktur (figur 2) liknar in situ-förhållanden (figur 1C), där Leydigceller, peritubulär myoid-celler finns i interstitiets i mellansidesrummet; och könsceller, Sertoli celler är belägna vid seminiferiska epitelet.

Figure 1
Figur 1: Mikrovälhärledda testikelorganoider uppvisar testis-specifik vävnads arkitektur med inverterad topografi. A) svin testikelceller vid 0, 3 och 5 dagars mikrovälkultur. B) immunofluorescensbilder av testikelorganoider som identifierar specifika celltyper: Sertoli-celler (GATA4), basalmembran (kollagen IV). könsceller (UCH-L1). peritubulära myoid celler (α-SMA); Leydigceller (CYP450). C) histologiskt utseende (H & E) och schematisk representation av 1-veckors-gamla svin testis. Specifika celltyper indikeras med motsvarande pilar. Skalstreck = 50 μm. Denna siffra har modifierats från Sakib et al.12. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: schematisk representation av Organoid formation. Isolerade enstaka testikelceller är seedade och odlade i mikrobrunnarna i 5 dagar för att producera testikulär organoider. Denna siffra har modifierats från Sakib et al.12. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi har etablerat en enkel metod som möjliggör en konsekvent, repeterbar generation av stora mängder testikelorganoider med vävnads arkitektur som liknar testiklarna in vivo12. Medan tillvägagångssättet utvecklades med hjälp av svin testiklarna celler, det är mer allmänt tillämplig även på mus, icke-mänskliga primater och mänskliga testiklarna12. Ett antal olika metoder har rapporterats för framställning av testikelorganoider8,9,10,11. Baert et al. genererade mänskliga testikulär organoider från vuxna och pre-pubertala prover genom odling testikelceller med extra cellulära matris (ECM) erhålls genom decellularization av vuxna mänskliga testiklarna11. Även om denna modell inte hade distinkta testikelmorfologi, organoider kunde utsöndra testosteron och cytokiner11. En annan Human Organoid modell rapporterades av Pendergraft et al. med hjälp av en hängande droppe kultur metod som utnyttjas solubilized testikel ECM proteiner och organoider kan producera testosteron8. Alves-Lopes et al. använde en unik tre skikt basalmembran matris (t. ex., Matrigel) gradient system för att generera testikulär organoider från råttor10. Cellerna i detta system genererade tubulär strukturer som hade en blod testiklarna barriär. Könscellerna i dessa tubule-liknande strukturer var också lyhörda för retinoinsyra Acid stimulering10. Alla dessa metoder är något komplexa och utmanande att använda för högt dataflöde analyser. I motsats, mikrobrunn systemet är enkelt, reproducerbara, kan generera organotypic testikulär organoider och kan användas för hög genomströmning läkemedel och toxicitetsanalyser.

Även i den metod som beskrivs här har vi använt en celltäthet 1 000 celler/microwell (1 000 celler/Organoid), denna metod kan användas för att generera organoider med så lite som 125 celler/microwell12. Detta kan vara till särskild nytta när man experimenterar med begränsade prover.

Om plattan inte balanseras korrekt under centrifugering kan ojämn fördelning av cellerna leda till generering av organoider med varierande storlek och form. Försiktighet bör iakttas för att balansera mikrobrunn plattan ordentligt. När cellerna har seedade, bör uppmärksamhet ägnas åt att hantera plattan under medie byten. Att skaka plattan för mycket när man tar ut den ur inkubatorn eller skapar turbulens under medie byten kan orsaka att några av organoiderna kommer ut ur mikrobrunnarna och smälter samman med andra13.

Den däggdjurs-köns cell nisch är komplex och flercelliga. De olika cellerna i testiklarna såsom Sertoli celler, peritubulära myoid celler, Leydig celler alla bidra till köns cells underhåll och öde16,17. Vårt Organoid system kan användas för att manipulera olika signalvägar i specifika celltyper. En gen av intresse kan vara upp eller nedreglerade i könsceller eller andra testikulär somatiska celler såsom peritubulära myoid celler, Sertoli celler. Dessa modifierade celler kan sedan kombineras med andra testikelceller för att generera modifierade testikelorganoider, som sedan kan användas för att studera effekterna av redigering på ECM deposition, morfogenes, cell-cell signalering, och spermatogenes. Sådana ändringar kan också utföras för att generera specifika sjukdoms fenotyper för Drug screening. Jämfört med andra metoder för generering av sfäriska organoider såsom kultur i hängande droppar eller Ultra Low bifogad U-Bottenplattor8, med hjälp av mikrobrunn systemet har gjort det möjligt för en testikelcancer Organoid modell som är mer tillgänglig och möjliggör Ändringar. Könsceller kan till exempel vara genetiskt modifierade eller behandlade med experimentella faktorer och placeras på en premade vildtyps-Organoid genom enkel centrifugering och observeras för effekter i senare led.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Ungrin har ett ekonomiskt intresse i AggreWell-teknologin som uppfinnare.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NIH/NICHD HD091068-01 till Dr Ina Dobrinski.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm ultra low attachment tissue culture dish Corning #CLS3262
100 mm tissue culture dish Corning #353803
Aggrwell 400 Stemcell Technologies #34411
Anti-Adherence Rinsing Solution Stemcell Technologies #07010
Collagenase type IV from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich #C5138 referred as Collagenase IV S
Collagenase type IV Worthington Worthington-Biochem #LS004189 referred as Collagenase IV W
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich #DN25
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/F12 Gibco #11330-032
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose Sigma-Aldrich #D6429
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich #D8537
Epidermal Growth Factor R&D Systems #236-EG
Falcon Cell Strainers 70 µm FisherScientific #352350
Falcon Cell Strainers 40 µm FisherScientific #352340
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific #12483-020
Insulin-Transferrin-Selenium Gibco #41400-045
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich #P4333
Porcine testicular tissue Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada)
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit Millipore #SCGP00525
Trypsin-EDTA Sigma #T4049

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, (7244), 262-265 (2009).
  2. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, (1), 25-36 (2010).
  3. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo Journal. 32, (20), 2708-2721 (2013).
  4. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160, (1-2), 324-338 (2015).
  5. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499, (7459), 481-484 (2013).
  6. Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545, (7652), 48-53 (2017).
  7. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424, (6951), 870-872 (2003).
  8. Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger. Biology of Reproduction. 96, (3), 720-732 (2017).
  9. Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7, (1), 82-82 (2018).
  10. Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
  11. Baert, Y., et al. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8, (1), 30-38 (2017).
  12. Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. (2019).
  13. Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates. Journal of Visualized Experiments. (81), 50665 (2013).
  14. Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100, (6), 1648-1660 (2019).
  15. González, R., Dobrinski, I. Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models. ILAR Journal. 56, (1), 83-98 (2015).
  16. Oatley, J. M., Brinster, R. L. The germline stem cell niche unit in mammalian testes. Physiological Reviews. 92, (2), 577-595 (2012).
  17. Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development. Proceedings of the National Academy of Science USA. 113, (7), 1829-1834 (2016).
Generering av porcin testikulär Organoider med testis specifik arkitektur med hjälp av Microwell kultur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sakib, S., Yu, Y., Voigt, A., Ungrin, M., Dobrinski, I. Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture. J. Vis. Exp. (152), e60387, doi:10.3791/60387 (2019).More

Sakib, S., Yu, Y., Voigt, A., Ungrin, M., Dobrinski, I. Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture. J. Vis. Exp. (152), e60387, doi:10.3791/60387 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter