En innfødt Western Blot metode for å analysere endogene interferon regulatoriske faktor 5 dimerization i CAL-1 plasmacytoid dendrittiske cellelinjen er beskrevet. Denne protokollen kan også brukes på andre cellelinjer.
Interferon regulerings faktor 5 (IRF5) er en nøkkel transkripsjon faktor for å regulere immunresponsen. Det er aktivert nedstrøms av toll-lignende reseptor myelogen differensiering primære respons gen 88 (TLR-MyD88) signalering veien. IRF5 aktivering innebærer fosforylering, dimerization, og påfølgende translokasjon fra cytoplasma inn i kjernen, som igjen induserer genet uttrykk for ulike Pro-inflammatorisk cytokiner. En deteksjon analysen for IRF5 aktivering er viktig å studere IRF5 funksjoner og relevante veier. Denne artikkelen beskriver en robust analysen til å oppdage endogene IRF5 aktivering i CAL-1 Human plasmacytoid dendrittiske celle (pDC) linje. Protokollen består av en modifisert nondenaturing elektroforese analysen det kanne skjelne IRF5 i sin monomer og dimer blankett, således skaffer en affordable og følsom adgang å analysere IRF5 aktivisering.
Interferon regulatoriske faktor 5 (IRF5) er en viktig transkripsjon regulator som spiller en fremtredende rolle i å regulere immunresponsen, spesielt i utgivelsen av Pro-inflammatorisk cytokiner og type I interferoner (IFNs)1,2 ,3. Misregulation av IRF5 er en medvirkende faktor i mange autoimmune sykdommer, som tydelig av ulike polymorfismer i IRF5 geometriske steder som er forbundet med systemisk lupus erythematosus, multippel sklerose, revmatoid artritt, etc.4, 5,6,7,8,9,10. Derfor, en robust oppdagelsen analysen for endogene IRF5 aktivisering begrunne er avgjørende for forståelse det regulere trasé og nedstrøms virkninger av IRF5 inne en fysiologisk relevant Cellular sammenheng.
IRF5 er constitutively uttrykt i monocytter, dendrittiske celler (DCs), B-celler og makrofager1,11. Som med andre IRF familien transkripsjon faktorer, IRF5 bor i cytoplasma i sin latente tilstand. Ved aktivering, IRF5 er fosforylert og danner homodimers, som deretter translocate inn i kjernen og binder seg til spesifikke regulatoriske elementer av gener koding type jeg IFNs og Pro-inflammatorisk cytokiner, til slutt indusere uttrykk for disse genene1 ,2,11,12,13. IRF5 regulerer medfødte immunresponser nedstrøms av ulike bompenger-lignende reseptorer (TLRs), slik som TLR7, TLR 8, og TLR 9, som er lokalisert i endosomes og bruke MyD88 for signalnettverk1,11,14. Disse TLRs anerkjenner først og fremst utenlandske nukleinsyre yre arter som single-strandet RNA (ssRNA) og metylerte CpG DNA som er symptomatisk for en infeksjon15,16,17,18. IRF5 har vist å regulere immunresponser mot bakteriell, viral, og fungal infeksjoner19,20,21. Vurderer IRF5’s innflytelsesrike og mangfoldig rolle i immunforsvaret, styrke eller dempe IRF5 aktivitet kan tjene som en roman Avenue for utvikling av terapeutiske agenter22. Derfor er det avgjørende å utvikle en protokoll for å overvåke aktiveringsstatus endogene IRF5 å tillate grundig undersøkelse av veier og mekanismer som regulerer IRF5 aktivitet i ulike celletyper.
Etter beste av vår kunnskap, ingen biokjemiske eller gel Elektroforetiske analysen for endogene IRF5 aktivisering har blitt publisert før utviklingen av denne protokollen. Fosforylering har vist seg å være et viktig første trinn i IRF5-aktiveringen, og et phosphospecific IRF5-antistoff ble utviklet som førte til oppdagelsen og bekreftelsen av en Serine rester som var viktig for IRF5 aktivitet13. Men mens antistoff klart oppdager fosforylert IRF5 når immunoprecipitated eller overexpressed23, den ikke klarer å oppdage IRF5 fosforylering i en hel celle lysat i våre hender (data ikke vist). Dimerization er neste trinn i IRF5 aktivisering, og mange viktige studier til dato gransker dette trinnet var avhengig av overuttrykte av epitope-Tagged IRF5, ofte i irrelevante celletyper som ikke normalt uttrykker IRF511,12 ,24,25. Tidligere studier har vist at dimerized IRF5 kan ikke alltid translocate inn i kjernen og dermed er ikke nødvendigvis fullt aktivert25,26. En analysen for endogene IRF5 kjernefysiske lokalisering ble utviklet for å vurdere IRF5 aktivering av Imaging Flow flowcytometri27. Denne analysen har vært brukt i studier som var avgjørende for å forstå IRF5 aktivitet, spesielt i primære eller sjeldne celletyper28,29 og i stor grad avanserte kunnskapen i feltet. Imidlertid er denne analysen avhengig av et spesialisert instrument som ikke er allment tilgjengelig for forskere. Videre er det ofte nødvendig å undersøke de innledende trinnene for aktivisering mens dissekere IRF5 regulatoriske trasé og identifisere oppstrøms regulatorer og Pathway komponenter. Denne studien gir en robust og pålitelig biokjemiske analysen for tidlig aktivering hendelser av IRF5 som kan utføres i laboratorier utstyrt med molekylærbiologi verktøy. Protokollen som er beskrevet her vil være svært nyttig i å undersøke veier og mekanismer for IRF5 handlinger, spesielt når kombinert med ortogonale analyser som Imaging Flow analytiske analyse av IRF5 kjernefysiske lokalisering23, 27,28,30.
Native polyakrylamid gel elektroforese (Native side) er en mye brukt metode for å analysere protein komplekser31,32. I motsetning til natrium dodecylsulfate polyakrylamid gel-elektroforese (SDS-PAGE), skiller den innfødte siden proteiner på grunnlag av sin form, størrelse og ladning. Den beholder også native protein struktur uten denaturering31,33,34,35. Protokollen forevist utnytter disse vise egenskaper av innfødt side og merker begge to monomere og dimeric blankett av IRF5. Denne metoden er spesielt viktig for å oppdage tidlige aktiverings hendelser fordi det ikke er egnet kommersielt tilgjengelig antistoff som kan oppdage endogene fosforylert IRF5. Tidligere brukte flere publiserte studier native PAGE for å vurdere IRF5 dimerization. Men de fleste av disse studiene var avhengig av overuttrykte av eksogene epitope-merket IRF5 å analysere aktiveringsstatus2,13,24,36,37 . Dette arbeidet presenterer en steg-for-trinn protokoll for å analysere endogene IRF5 dimerization via en modifisert native PAGE teknikk i en menneskelig plasmacytoid dendrittiske celle (pDC) linje, der IRF5 aktivitet har vist seg å være avgjørende for sin funksjon1, 38,39,40. Den samme teknikken har blitt brukt på andre cellelinjer23.
Protokollen som er beskrevet her er en modifisert innfødt side som skiller både monomere og dimeric former for endogene IRF5. Det har vært få studier som rapporterer påvisning av endogene IRF5 aktivering ved hjelp av spesialiserte Imaging Flow flowcytometri Technique23,27,28,30. Denne protokollen bruker en felles teknikk og vanlig reagenser og verktøy for å vurdere den endogene IRF5 akti…
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet ble støttet av finansiering fra Croucher Foundation og City University oppstart midler. Vi takker alle medlemmer av Chow laboratoriet for hjelp med eksperimentet og kritisk lesning av manuskriptet.
2-Mercaptoethanol | Life Technologies, HK | 21985023 | |
300 W/250 V power supply 230 V AC | Life Technologies, HK | PS0301 | |
Anti-IRF5 antibody | Bethyl Laboratories, USA | A303-385 | |
BIOSAN Rocker Shaker (cold room safe) | EcoLife, HK | MR-12 | |
EDTA Buffer, pH 8, 0.5 M 4 X 100 mL | Life Technologies | 15575020 | |
Glycerol 500 mL | Life Technologies | 15514011 | |
Glycine | Life Technologies, HK | 15527013 | |
Goat anti-Mouse IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 610-145-002-0.5 | |
Goat anti-Rabbit IgG DyLight 800 Conjugated Antibody | LAB-A-PORTER/Rockland, HK | 611-145-002-0.5 | |
Halt protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fisher Scientific, HK | 78430 | |
HEPES | Life Technologies, HK | 15630080 | |
LI-COR Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Gene Company, HK | 927-50000 | |
Mini Tank blot module combo; Transfer module, accessories | Life Technologies, HK | NW2000 | |
NativePAGE 3-12% gels, 10 well kit | Life Technologies, HK | BN1001BOX | |
NativePAGE Running Buffer 20x | Life Technologies, HK | BN2001 | |
NativePAGE Sample Buffer 4x | Life Technologies, HK | BN2003 | |
NP-40 Alternative, Nonylphenyl Polyethylene Glycol | Tin Hang/Calbiochem, HK | #492016-100ML | |
PBS 7.4 | Life Technologies, HK | 10010023 | |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Bio-gene/Merck Millipore, HK | IPFL00010 | |
Protein assay kit II (BSA) | Bio-Rad, HK | 5000002 | |
R848 | Invivogen, HK | tlrl-r848 | |
RPMI 1640 | Life Technologies, HK | 61870127 | |
Sodium Chloride | ThermoFisher | BP358-1 | |
Sodium deoxycholate ≥97% (titration) | Tin Hang/Sigma, HK | D6750-100G | |
Tris | Life Technologies, HK | 15504020 | |
TWEEN 20 | Tin Hang/Sigma, HK | #P9416-100ML |