Summary
Vi præsenterer en motordrevet centrifugal mikrofluidic enhed, der kan dyrke celle sfæroider. Ved hjælp af denne enhed, sfæroider af enkelt eller flere celletyper kunne let cocultureres under høj tyngdekraft betingelser.
Abstract
En tredimensionel sfærisk cellekultur kan opnå mere brugbare resultater i celle eksperimenter, fordi det bedre kan simulere celle mikromiljøer i den levende krop end to-dimensionelle cellekultur. I denne undersøgelse, vi fabrikerede en elektrisk motordrevet Lab-on-a-CD (Compact Disc) platform, kaldet en centrifugal microfluidic-baseret sfæroide (CMS) kultur system, at skabe tredimensionelle (3D) celle sfæroider gennemføre høj centrifugalkraft. Denne enhed kan variere rotationshastigheder til at generere tyngdekraften betingelser fra 1 x g til 521 x g. CMS-systemet er 6 cm i diameter, har 500 μm mikrobrønde, og er lavet ved støbning med Polydimethylsiloxan i en polycarbonat skimmel premade af en computer numerisk kontrol maskine. En barriere væg ved kanal indgangen til CMS-systemet bruger centrifugalkraft til at sprede cellerne jævnt inde i chippen. I slutningen af kanalen er der et diasområde, der gør det muligt for cellerne at komme ind i mikrobrøndene. Som en demonstration, sfæroider blev genereret af monokultur og coculture af menneskelige Adipose-afledte stamceller og menneskelige lunge fibroblaster under høj tyngdekraften betingelser ved hjælp af systemet. CMS-systemet brugte en simpel operation ordning til at producere coculture sfæroider af forskellige strukturer af koncentrisk, Janus og sandwich. CMS-systemet vil være nyttigt i cellebiologi og vævsteknik undersøgelser, der kræver sfæroider og organoid kultur af enkelt eller flere celletyper.
Introduction
Det er lettere at simulere biologiske in vivo-mikromiljøer med tredimensionel (3D) sfærisk cellekultur end med todimensionel (2D) cellekultur (f. eks. konventionel Petri skål cellekultur) for at producere mere fysiologisk realistiske eksperimentelle resultater1. I øjeblikket tilgængelige sfæroide formation metoder omfatter hængende dråbe teknik2, væske-overlay teknik3, natriumcarboxymethylcellulose cellulose teknik4, magnetisk kraft-baseret mikrofluidisk teknik5, og brugen af bioreaktorer6. Selv om hver metode har sine egne fordele, yderligere forbedring i reproducerbarhed, produktivitet, og generere coculture sfæroider er nødvendig. For eksempel, mens den magnetiske kraft-baserede mikrofluidisk teknik5 er relativt billig, skal virkningerne af stærke magnetiske felter på levende celler nøje overvejes. Fordelene ved sfæriske kultur, især i studiet af mesenchymal stamcelle differentiering og spredning, er blevet rapporteret i flere undersøgelser7,8,9.
Den centrifugal mikrofluidic system, også kendt som Lab-on-a-CD (Compact Disc), er nyttig til let at styre væsken inde og udnytte rotation af substratet og er således blevet udnyttet i biomedicinske applikationer såsom immunassays10, kolorimetriske assays til påvisning af biokemiske markører11, nukleinsyre amplifikation (PCR) assays, automatiserede blod analysesystemer12, og alt-i-en centrifugal mikrofluidic enheder13. Den drivende kraft, der styrer væsken er den centripetale kraft skabt af rotation. Derudover kan flere funktioner i blanding, valving og prøve opdeling gøres simpelthen i denne enkelt CD-platform. Men i forhold til ovennævnte biokemiske analysemetoder, har der været færre forsøg med at anvende CD-platforme til kultur celler, især sfæroider14.
I denne undersøgelse viser vi ydeevnen af det centrifugal mikrofluidic-baserede sfæroide (CMS) system ved monokultur eller coculture af humane Adipose afledte stamceller (HASC) og humane lunge fibroblaster (MRC-5). Dette dokument beskriver i detaljer vores gruppes Forskningsmetode15. Således kan sfæroide Culture Lab-on-a-CD-platformen let gengives. Et CMS-produktionssystem bestående af en CMS-kultur chip, en chip holder, en jævnstrømsmotor, en motormontering og en roterende platform præsenteres. Motor holderen er 3D-printet med acrylonitrilbutadien styren (ABS). Chip holderen og den roterende platform er CNC (computer numerisk styring) bearbejdet med pc'en (polycarbonat). Motorens rotationshastighed styres fra 200 til 4.500 rpm ved at indkode en PID (proportional-Integral-afledt) algoritme baseret på puls-bredde modulation. Dens dimensioner er 100 mm x 100 mm x 150 mm og den vejer 860 g, hvilket gør den nem at håndtere. Ved hjælp af CMS-systemet, kan sfæroider genereres under forskellige tyngdekraften betingelser fra 1 x g til 521 x g, så studiet af Celledifferentiering fremme under høj tyngdekraft kan forlænges fra 2D-celler16,17 til 3D sfæroide. Coculture af forskellige typer af celler er også en vigtig teknologi til effektivt at efterligne in vivo miljø18. CMS-systemet kan nemt generere monokultur sfæroider, samt coculture sfæroider af forskellige struktur typer (f. eks koncentrisk, Janus, og sandwich). CMS-systemet kan udnyttes ikke kun i simple sfæroide undersøgelser, men også i 3D organoid undersøgelser, at overveje menneskelige organ strukturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. centrifugal microfluidic-baseret sfæroide (CMS) kultur chip fabrikation
- Lav PC forme til de øverste og nederste lag af CMS kultur chip ved CNC bearbejdning. De detaljerede dimensioner af chippen er angivet i figur 1.
- Bland PDMS base og PDMS Hærdningsmiddel i et forhold på 10:1 (w/w) i 5 min og Placer i en ekssikkator i 1 time for at fjerne luftbobler.
- Efter hælde PDMS blandingen i forme af CMS kultur chip, fjerne luftbobler for 1 h mere og helbrede i et varme kammer ved 80 °C for 2 h.
- Placer dem i støvsugeren med de overflader, der skal bindes opad, og Udsæt dem til luftassisteret plasma ved en effekt på 18 W for 30 s.
- Bond de to lag af CMS kultur chip og placere den i varmekammeret ved 80 °C i 30 min at øge vedhæftningsstyrke.
- Steriliser CMS-kultur chippen i en autoklave sterilisator ved 121 °C og 15 PSI.
2. klargøring af celler
- De 1 mL hætteglas, der indeholder 5 × 105– 1 × 106 hascs eller MRC-5s celler, tø i et vandbad ved 36,5 °c i 2 min.
- Tilsæt 1 mL Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM) til et hætteglas og bland forsigtigt med en 1.000 μL pipette.
- 15 mL af DMEM forvarmes til 36,5 °C i en Petri skål på 150 mm med en pipette og tilsættes cellerne fra hætteglasset.
- Efter 1 dag skal du aspirere DMEM og udskifte med 15 mL frisk DMEM. Derefter ændre medierne hver 2 eller 3 dage.
- For at frigøre cellerne fra Petri skålen tilsættes 4 mL trypsin til Petriskålene og placeres i en inkubator ved 36,5 °C og 5% CO2 i 4 min.
3. dannelse af sfæide monokultur
- Sæt 2,5 mL 4% (w/v) pluralistisk F-127 opløsning i indløbs hullet i CMS-kultur chippen (figur 2a), mens du roterer chippen med 500 – 1000 rpm, og drej derefter chippen ved 4.000 rpm i 3 min ved hjælp af CMS-systemet (figur 2b).
Bemærk: den pluroniske belægning forhindrer celle fastgørelse til indløbs porten, mens chippen roterer. Sørg for, at luften ikke er fanget i mikrobrøndene. - Incubate CMS kultur chip fyldt med pluronic løsning natten over ved 36,5 °C i 5% CO2.
- Fjern den pluroniske opløsning, skyl den resterende pluroniske opløsning med DMEM, og tør chippen i 12 timer på en ren bænk.
- Tilsæt 2,5 mL DMEM til CMS-kultur chippen, og drej chippen ved ~ 4.000 rpm i 3 minutter for at prewetting indersiden af chippen.
- Stop rotationen og træk 100 μL DMEM ud for at gøre plads til injektion af cellesuspensionen.
- Tilsæt 100 μL af celle suspensioner, der indeholder enten 5 × 105 hascs eller 8 × 105 MRC-5s ved pipettering jævnt distribuere cellerne ved pipettering 3 – 5x for resuspension.
- Drej chippen ved 3.000 rpm i 3 minutter for at diffusere cellerne i hver mikrobrønd med centrifugalkraft.
Bemærk: overdreven rotationshastighed kan medføre, at celle flugt gennem løsningens udslyngning huller. - Kultur cellerne i 3 dage i inkubator ved 36,5 °C, > 95% fugtighed, og 5% CO2, roterende ved 1000-2000 rpm. Skift kulturmedium hver dag.
4. coculture sfæoidedannelse
-
Koncentriske sfæroider dannelse
- Tilføj de første celler, 2,5 × 105 hascs, og drej chippen ved 3.000 rpm. Efter 3 min, tilsæt den anden celler, 4 × 105 MRC-5s, og drej chippen ved 3.000 rpm i 3 min. Injicer i alt 100 μl af celle suspensioner ved pipettering. Når cellerne injiceres, skifte rotationshastigheden til 500-1000 rpm.
- Kultur cellerne i inkubator ved 36,5 °C, > 95% fugtighed%, og 5% CO2 ved at rotere ved 1000-2000 rpm. De koncentriske sfæroider er skabt inden for 24 timer. For langsigtet kultur, ændre kulturmediet hver dag.
-
Janus sfæide dannelse
- Tilsæt 100 μL af celle suspensioner, der indeholder de første celler, 2,5 × 105 hascs, ved pipettering, mens chippen roterer ved 500 – 1000 rpm. Drej derefter chippen ved 3.000 rpm i 3 min.
- Chippen inkubates ved 36,5 °C, > 95% fugtighed og 5% CO2 ved at rotere ved 1000 – 2000 rpm i 3 timer.
- Tilsæt 100 μL af de celle suspensioner, der indeholder det andet sæt celler, 4 × 105 MRC-5s, ved pipettering, mens chippen roterer ved 500 – 1000 rpm. Drej derefter chippen ved 3.000 rpm i 3 min.
- Kultur cellerne i inkubator ved 36,5 °C, > 95% fugtighed, og 5% CO2 ved at rotere ved 1000-2000 rpm. Janus sfæroider er skabt inden for 24 timer. For langsigtet kultur, ændre kulturmediet hver dag.
-
Sandwich sfæoiddannelse
- Tilsæt 100 μL af celle suspensioner, der indeholder de første celler, 1,5 × 105 hascs, ved pipettering, mens chippen roterer ved 500 – 1000 rpm. Drej derefter chippen ved 3.000 rpm i 3 min.
- Chippen inkubates ved 36,5 °C, > 95% fugtighed og 5% CO2 ved at rotere ved 1000 – 2000 rpm i 3 timer.
- Tilsæt 100 μL celle suspensioner, der indeholder de anden celler, 3 × 105 MRC-5s, ved pipettering, mens chippen roterer ved 500 – 1000 rpm. Drej derefter chippen ved 3.000 rpm i 3 min.
- Chippen inkubates ved 36,5 °C, > 95% luftfugtighed% og 5% CO2 ved at rotere ved 1000 – 2000 rpm i 3 timer.
- Tilsæt 100 μL af celle suspensioner, der indeholder de tredje celler, 1,5 × 105 hascs, ved pipettering, mens chippen roterer ved 500 – 1000 rpm. Drej derefter chippen ved 3.000 rpm i 3 min.
- Kultur cellerne i inkubator ved 36,5 °C, > 95% fugtighed%, og 5% CO2 ved at rotere ved 1000-2000 rpm. Sandwich sfæroider er skabt inden for 12 h. For langsigtet kultur, ændre kulturmediet hver dag.
5. celle farvning
- Opvarmer celle fluorescens farvestof til stuetemperatur (20 °C).
- Der tilsættes 20 μL vandfri dimethylsulfoxid (DMSO) pr. hætteglas for at lave en 1 mM opløsning.
- Fluorescensen fortyndes til en endelig arbejds koncentration på 1 μM med DMEM.
- Tilsæt fluorescensen til cellesuspensionen, og resuspender forsigtigt med en pipette.
- Inkuber 20 min ved 36,5 °C, fugtighed på > 95% og 5% CO2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den 6 cm diameter CMS kultur chip (figur 2) blev udført med succes efter ovenstående protokol. Først blev chippen lavet separat fra et toplag og et bund lag og derefter bundet sammen af plasma binding. Resulterende sfæroider kan let samles ved at løsne chippen. Kanalen af CMS kultur chip omfatter en indsugnings port og centrale, slide, og strips med mikrobrønde regioner (figur 3). Celle-, medium-og pluroniske opløsninger injiceres gennem et indløbs hul med en diameter på 5 mm. De injicerede celler fordeles jævnt ved opblanding 3 – 5x i indløbs portregionen. Cellerne udsættes for centrifugalkraft i den centrale region og spredes udad. Fordi den centrale region er højere end mikrobrønden, kan den indeholde flere medier, hvilket gør det muligt for sfæroider at overleve længere. Højden af mikrobrønden er 0,4 mm, og højden af den centrale region er 1,5 mm. der er indsugnings huller i midten af den centrale region, så det er nemt at fjerne de interne løsninger. Slide regionen er et skrånende område, der forbinder den centrale region og strips med mikrobrønde-regionen. Cellerne bevæger sig langs en 45 ° hældning og bosætte sig i strips med mikrobrønde regionen, hvor cellerne bosætte sig, vokse, og tangle at danne sfæroider. Mikrobrønde placeret 14 mm fra midten af chippen er semicylindrisk med en højde på 400 μm og en diameter på 400 μm. I alt 100 sfæroider kan genereres samtidigt i 100 mikrobrønde.
Ved hjælp af den forberedte CMS-chip kan sfæroider genereres i den rækkefølge, der er vist i protokollen (figur 4). Monokultur og coculture sfæroider blev genereret med hASC og MRC-5 celler. For at generere en monokultur sfæroide af hver type celle, 5 × 105 hascs eller 8 × 105 MRC-5s blev injiceret. Antallet af injicerede celler var uafhængigt af cellestørrelsen. Tidsforskudt billeder af begge typer celler blev taget ved 2.000 rpm indtil dag 3 i cellekulturen (figur 5). Coculture sfæroider af hASCs og MRC-5s blev også genereret med koncentriske, Janus og sandwich strukturer. For at lave koncentriske sfæroider blev de første celler (2,5 × 105 hascs) injiceret, og de anden celler (4 × 105 MRC-5s) blev injiceret 3 min senere (figur 6a). Da de første celler blev injiceret, blev de U-formede på grund af høj tyngdekraft, og da de anden celler blev injiceret, flyttede de til midten af U-formen. Over tid omringede de første U-Shape-celler de to celler og afsluttede de koncentriske sfæroider. For at fremstille Janus sfæroider blev de første celler (2,5 × 105 hascs) injiceret, og den anden celle (4 × 105 MRC-5s) blev injiceret 3 timer senere (figur 6b). Når injektions intervallet mellem de to celler var langt, ændrede formen på de første celler sig fra en U-form til en elliptisk form ved celle sammenlægning. Når den anden celle blev føjet til den elliptiske form af de første celler, blev Janus sfæroider genereret. I tilfælde af sandwich sfæroider blev de første celler (1,5 × 105 hascs) injiceret, de anden celler (3 × 105 MRC-5s) blev injiceret 3 h senere, og de tredje celler (1,5 × 105 hascs) blev injiceret efter en anden 3 h (figur 6c ). Svarende til Janus spheroid, hver celle samles i en elliptisk form, og de tre lag stablet til at generere sandwich sfæroider. Endelig, for at demonstrere den langsigtede kultur kapacitet i CMS, blev hASCs dyrket, udsat for høj tyngdekraft i 7 dage efterfulgt af en levende/død analyse udført for at vise, at de fleste celler overlevede (figur 7). Også, billeder af alle mikrobrønde af CMS blev taget efter 3 dage af MRC-5s dyrkning for at vise fremragende ensartethed og sfæse af sfæroider (figur 8).
Figur 1: dimensioner af de øverste og nederste lag af en CMS kultur chip. PC'EN skimmelsvamp blev lavet ved hjælp af en CNC-maskine og replikeret med PDMS at gøre en CMS kultur chip baseret på tegningen skabt af en 3D CAD (Computer-Aided Design) program. De fire cirkler ved kanterne af de øverste og nederste lag er for at justere de to lag. Dimensionerne er i millimeter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: fotografier af CMS-systemet. A) fotografier af den udfyldte CMS-kultur chip. Diameteren af chippen er 6 cm og diameteren af strips med mikrobrønde er 400 μm. Tallene over mikrobrøndene repræsenterer det enkelte antal mikrobrønde fra 1 til 100. Disse numre blev indgraveret i formen. Scale bar = 400 μm. B) fotografi af hele CMS-systemet. CMS-systemet omfatter CMS kultur chip, chip holder, DC motor, og roterende platform. CMS-enheder kan generere tyngdekraften betingelser op til 521 x g gennem roterende kraft. Chip holderen forhindrer adskillelse af CMS-kultur chippen på grund af høj tyngdekraft. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: kanal komponenter i CMS. (A) skematiske billeder og (B) fotografier af et tværsnit af CMS kultur chip. CMS kultur chip består af en indsugnings port og centrale, slide, og strips med mikrobrønde regioner. Fordi de injicerede celler ikke passerer gennem barrieren ved en rotationshastighed på mindre end 1.000 rpm, hjælper barrieren i opblanding af cellen og endda fordeling til mikrobrønden. Scale bar = 2 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: processen med at indlæse celler i CMS kultur chip. (A) for at forhindre celler i at klæbe til bunden af chippen, frakke med 2,5 ml af den Pluroniske F-127 opløsning ved 4.000 rpm. Vent en dag på, at belægningen påføres. B) Fjern den pluroniske opløsning, og fyld kanalen med 2,5 ml af DMEM-mediet. C) Fjern 100 ΜL af DMEM, og tilsæt 100 μl cellesuspension. På dette tidspunkt, resuspendere 3 – 5x, så cellerne er jævnt fordelt. (D) Flyt cellerne til mikrobrønden ved at rotere chippen, og derefter kulturen cellerne i 3 dage ved 1.000 til 2.000 rpm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: tidsforskudt fotografi af monokultur sfæroider af hASC-og MRC-5-celler. Cellerne blev dyrket i 24 timer ved 2.000 rpm. Sfæroide blev genereret inden for 24 h. Scale bar = 400 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: fluorescensbilleder af coculture sfæroider. A) koncentriske sfærisk former, hvor HASC-celler (grøn) omgiver MRC-5-celler (rød). B) Janus sfærisk form, hvori to celler er symmetriske. (C) sandwich sfæide form, hvor HASC lag er stablet mellem to MRC-5 lag. Scale bar = 400 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: levende/dødt assay af hASC på dag 7. Den grønne fluorescerende farve repræsenterer levende celler, og den røde fluorescerende farve repræsenterer døde celler. Scale bar = 400 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: MRC-5 sfæroider på dag 3. Et relativt konstant antal celler kommer ind i hver mikrobrønd og danner sfæroider med relativ konstant sfæicitet i CMS-systemet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: høst sfæroider. Kultiverede sfæroider kan høstes ved at dividere de to lag af CMS kultur chip. De to plasma-bundne lag kan let adskilles med hånden. Derefter indsamles sfæroider fra mikrobrøndene i det nederste lag blot ved pipettering. Scale bar = 400 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
CMS er et lukket system, hvor alle injicerede celler ind i mikrobrønden uden affald, hvilket gør det mere effektivt og økonomisk end konventionelle strips med mikrobrønde-baserede sfæroide generation metoder. I CMS-systemet udskiftes medierne hver 12 – 24 timer gennem et sugehul, der er designet til at fjerne mediet i chippen (figur 3a). Under medierne suge proces, næppe nogen medier undslipper inde i mikrobrønden på grund af overfladen spændinger mellem medierne og væggen af strips med mikrobrønde. En bruger kan nemt fjerne de fangede medier ved at trykke tæt på strips med mikrobrønde regionen af chippen med en finger, fordi chippen lavet af PDMS er elastisk og fleksibel. Cellerne i mikrobrønden forbliver stabile uden at undslippe, selv med flere medieændringer. For at opnå den samme kvalitet af sfæroide i alle 100 mikrobrønde, bør rotationen af enheden ikke være excentrisk, og chippen skal være axisymmetrisk. Ellers kan et variabelt antal celler indtaste hver brønd og størrelsen og formen af sfæroide kunne afvige. I det konventionelle strips med mikrobrønde-system, fordi luften ofte er fanget i mikrobrønden, er det nødvendigt at fjerne luftbobler. Men, CMS-systemet kræver ikke boble fjernelse proces, fordi den høje centrifugalkraft genereret af rotationen forårsager medierne til at skubbe boblerne og presse dem ud fra mikrobrønde.
CMS-systemet har også sine begrænsninger i forhold til konventionelle metoder. CMS-systemet kræver et større kulturrum (f. eks. et stort inkubator rum), da det består af en motor, en roterende platform og en regulator, og dens samlede størrelse er ca. 100 mm x 100 mm x 150 mm (figur 2b). Desuden, det forårsager en lille, men vedvarende vibrationer. Vi forventer, at miniaturisering af systemet (forhåbentlig svarer til størrelsen af 6 brønd plader) vil løse disse problemer.
Det skal bemærkes, at de dyrkede sfæroider kan opsamles ved at adskille de to plasma-bundne lag i CMS-systemet (figur 9). Limningen af de to lag er stærk nok til at forhindre mediet i at lække under systemdrift. Men på grund af den lille bonding område, det er separabel i hånden. Sfæroider kan simpelthen indsamles fra det nederste lag ved pipettering.
CMS-systemet har bedre reproducerbarhed og produktivitet end konventionelle metoder til sfæide generering. De konventionelle metoder, såsom normal strips med mikrobrønde eller hængende dråbe metoder, er arbejdskraftintensive. Men i CMS-systemet er det meget lettere at øge antallet af sfæroider ved blot at øge spån størrelsen. Med denne enhed er det også muligt at generere organoider, der kræver kultur af multicell typer, hvilket ikke er let at gøre i konventionelle dyrkningsmetoder. Ud over cellerne i dette studie (hASC og MRC-5), kan CMS bruges til sfæoidproduktion ved hjælp af forskellige andre typer af celler, der kan danne sfæroider.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af den grundlæggende videnskab forskning program (2016R1D1A1B03934418) og bio & medicinsk teknologiudvikling program (2018M3A9H1023141) af NRF, og finansieret af den koreanske regering, MSIT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Cubicon | 3DP-210F | |
| Adipose-derived mesenchymal stem cells (hASC) | ATCC | PCS-500-011 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Contained 1% of completed medium and buffer |
| CellTracker Green CMFDA | Thermo Fisher Scientific | C2925 | 10 mM |
| CellTracker Red CMTPX | Thermo Fisher Scientific | C34552 | 10 mM |
| Computer numerical control (CNC) rotary engraver | Roland DGA | EGX-350 | |
| DC motor | Nurielectricity Inc. | MB-4385E | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Dulbecco's modified eaggle's medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) | ATCC | 30-2200 | |
| Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | Contained 10% of completed medium |
| human lung fibroblasts (MRC-5) | ATCC | CCL-171 | |
| Inventor 2019 | Autodesk | 3D computer-aided design program | |
| Petri dish Φ 150 mm | JetBiofill | CAD010150 | Surface Treated |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Pluronic F-127 | Sigma Aldrich | 11/6/9003 | Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution |
| Polycarbonate (PC) | Acrylmall | AC15PC | 200 x 200 x 15 mm |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dowcorning | Sylgard 184 | |
| Trypsin | Gibco | 12604021 |
References
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Paul Solomon, F. D. 3D cell culture systems: Advantages and applications. Journal of Cellular Physiology. 230 (1), 16-26 (2015).
- Tung, Y. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Sutherland, R., Carlsson, J., Durand, R., Yuhas, J. Spheroids in Cancer Research. Cancer Research. 41 (7), 2980-2984 (1981).
- Korff, T., Krauss, T., Augustin, H. G. Three-dimensional spheroidal culture of cytotrophoblast cells mimics the phenotype and differentiation of cytotrophoblasts from normal and preeclamptic pregnancies. Experimental Cell Research. 297 (2), 415-423 (2004).
- Yaman, S., Anil-Inevi, M., Ozcivici, E., Tekin, H. C. Magnetic force-based microfluidic techniques for cellular and tissue bioengineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, (2018).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, (2016).
- Li, Y., et al. Three-dimensional spheroid culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells promotes cell yield and stemness maintenance. Cell and Tissue Research. 360, 297-307 (2015).
- Yamaguchi, Y., Ohno, J., Sato, A., Kido, H., Fukushima, T. Mesenchymal stem cell spheroids exhibit enhanced in-vitro and in-vivo osteoregenerative potential. Bmc Biotechnology. 14 (1), 105 (2014).
- Koh, C. Y., et al. Centrifugal microfluidic platform for ultrasensitive detection of botulinum toxin. Analytical Chemistry. 87 (2), 922-928 (2015).
- Steigert, J., et al. Direct hemoglobin measurement on a centrifugal microfluidic platform for point-of-care diagnostics. Sensors and Actuators, A: Physical. 130-131, 228-233 (2006).
- Park, Y. -S., et al. Fully automated centrifugal microfluidic device for ultrasensitive protein detection from whole blood. Journal of Visualized Experiments. (110), e1 (2016).
- Lee, A., et al. All-in-one centrifugal microfluidic device for size-selective circulating tumor cell isolation with high purity. Analytical Chemistry. 86 (22), 11349-11356 (2014).
- Gorkin, R., et al. Centrifugal microfluidics for biomedical applications. Lab on a Chip. 10 (14), 1758-1773 (2010).
- Park, J., Lee, G. H., Yull Park, J., Lee, J. C., Kim, H. C. Hypergravity-induced multicellular spheroid generation with different morphological patterns precisely controlled on a centrifugal microfluidic platform. Biofabrication. 9 (4), (2017).
- Rocca, A., et al. Barium titanate nanoparticles and hypergravity stimulation improve differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts. International Journal of Nanomedicine. 10, 433-445 (2015).
- Genchi, G. G., et al. Hypergravity stimulation enhances PC12 neuron-like cell differentiation. BioMed Research International. 2015, (2015).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
