我们概述了一个为期9天的协议,用于转导和扩大流黄猴外周外血单核细胞,该细胞产生具有良好共同表达的细胞,其感兴趣的基因数量足以用于细胞有效性的输液研究。
治疗传染病和癌症的新兴免疫疗法通常涉及细胞群的转导,其基因编码为疾病靶向蛋白。例如,用于治疗癌症和病毒感染的嵌合抗原受体(CAR)-T细胞涉及T细胞的转导,合成基因编码CAR分子。CAR分子使T细胞专门识别和杀死癌症或病毒感染的细胞。细胞也可以与其他感兴趣的基因共同转化。例如,细胞可以与编码蛋白质的基因共同转化,这些蛋白质将细胞目标对准特定位置。在这里,我们提出了一个协议,以转换原发性外周血单核细胞(PBMC),基因编码病毒特异性CAR和B细胞卵泡培养分子化学酶受体5型(CXCR5)。此过程需要 9 天,并产生具有中央记忆表型的转导 T 细胞群。中央记忆或不太分化的表型的维护已被证明与输液后细胞的持久性相关联。此外,用这种方法产生的细胞表现出高水平的生存能力,两个转导基因的表达水平高,以及足够数量的细胞用于免疫治疗输液。这九天的协议可广泛用于CAR-T细胞和其他T细胞免疫治疗方法。此处描述的方法基于我们以前出版物中介绍的研究。
细胞免疫疗法正在成为治疗癌症和传染病等疾病的新手段。这些免疫疗法通常涉及基因操作治疗细胞以表达特定分子。例如,嵌合抗原受体(CAR)T细胞被设计成表达一个CAR分子,该分子具有细胞外域,专门结合病变细胞上的分子和触发免疫细胞杀死病变细胞的信号域。CAR T细胞在癌症免疫疗法中被成功应用,在治疗B细胞白血病11、2、32,3方面特别有效。CAR-T细胞也正在开发,以治疗病毒感染,如艾滋病毒。HIV特异性CAR针对病毒感染细胞表面的包络蛋白4。免疫治疗细胞也可以被设计成表达宿主分子,将治疗细胞定向到特定的组织位置。我们已经开发出一种载体,可以同时传播病毒特定的CAR以及淋巴卵泡的培养分子CXCR55。
病毒复制某些病毒,包括人体免疫机能丧失病毒(HIV)和西米亚免疫机能丧失病毒(SIV),集中在B细胞卵泡中,处于继发淋巴组织6。B细胞卵泡是一些免疫特权网站,其中病毒特异性CTL水平低允许持续病毒复制77,8。8由于这些原因,通过表达CXCR5将HIV/SIV特异性T细胞定向到卵泡中是消灭病毒感染细胞99、1010卵泡库的策略。具体来说,我们通过CXCR5共同表达将SIV特定的CAR T细胞定位到B细胞卵泡。
在此协议中,我们描述了一种转导CAR/CXCR5和扩大PBMC的方法,以生产足够数量的CAR/CXCR5 T细胞用于治疗输液。用这些方法换来的细胞保持一个中央记忆表型。研究表明,具有较少分化表型的细胞,如中央记忆T细胞和T记忆干细胞比分化性更高的细胞11,12,12更好地持久。此外,许多旨在产生采用转移细胞的协议具有相对较短的培养时间,导致具有更分化表型和减少持久性13的细胞。此外,在肺内积累的培养时间长的细胞,而不是在黄斑狼猴14、15,15中的目标淋巴组织。在我们在这里描述和演示的方法中,我们快速转导和扩展黄斑猴PBMC,以产生保持中央记忆表型的转导T细胞。
CD4和CD8 T细胞都包含在我们的免疫治疗方法中。之所以选择这种混合细胞群,是因为在临床试验中,CD8+T细胞产物中缺乏CD4+T细胞与注入CD8 T细胞失败而持续16。这里描述的方法开始激活具有抗CD3和抗CD28抗体的PBMC,这些抗体能有效刺激T细胞受体并提供共同刺激信号,以避免克隆过敏17,18。17,
激活后,细胞通过伽马病毒载体进行转导,编码病毒特异性CAR和淋巴霍姆分子CXCR5。然后,使用专为非粘附细胞繁殖设计的板进行转导细胞扩展,该板在基底有一个透气膜。这种膜允许在井底进行气体交换,从而增强细胞生存和营养可用性19。使用这些方法,可以在9天的时间内产生足够的功能细胞,用于体内输液研究。虽然该协议是为转导和扩大河套猴T细胞而设计的,对物种特异性激活抗体进行轻微修饰,可与其他物种的细胞一起使用。这些方法是基于我们先前发表的研究9,9,20。
该协议概述了T细胞免疫治疗生产策略,它利用伽马病毒载体来转导流苏猴PBMC,导致T细胞群,表示抗病毒CAR以及卵泡宿主受体CXCR5。在总共8天的外活体培养时间,可行的,功能性的CAR T细胞产生的数量是在公布的范围10,21,2210,21,22用于输液到非人类灵长类动物进行临床前疗效测试。
转染协议的成功依赖于健康、刺激的PBPC和伽马病毒的质量制剂。为了成功地实现刺激和转导,在收集后对PBMC的冷冻和运输必须适当小心。理想情况下,如果细胞被收集到场外,它们被运到液氮中,并迅速放入长期液氮储存中。PBMC 必须具有线性活性,才能通过伽马病毒成功转导。在用抗CD3/抗CD28刺激后,应目视地监测细胞的聚类。未能正确激活将导致转染效率低。监测受刺激细胞的生存能力也很重要。刺激步骤后生存能力差通常会导致转导效果较差。无论是在实验室中生产病毒制剂还是外包病毒制剂,它们都应以-80°C储存在一次性的等分值中,以避免冻融周期,从而损害病毒并损害转染效率。病毒必须进行定分,以便每个实验都使用数量一致的病毒。当使用病毒进行转导时,迅速解冻病毒并储存在冰上,直到需要为止。促进剂、增强剂和包络蛋白的选择都可能影响靶细胞中转导效率和转基因表达。因此,必须根据经验确定谅解备忘录。此外,使用一种介质,旨在支持T细胞和板与气体渗透孔膨胀已导致传感器的出色膨胀。然而,在细胞扩张率中存在着动物对动物的变异性。我们建议进行试验性研究,以确定特定细胞制剂的转导和扩展能力。在小型和大型转变中,膨胀水平是一致的。
使用这种协议,我们生产了多达2.5 x 109细胞输液到试验动物体内。尽管我们发现此时没有必要扩大协议规模,但使用6个孔板是大规模细胞制备的限制,该协议需要修改才能产生更多的细胞。潜在修饰的示例包括在纤维化涂层培养袋中进行转导,以增加转导细胞的数量,并利用更大的气体渗透培养容器进行膨胀步骤。虽然我们还没有进行这些修改,但它们利用了商业上可用的产品,并且对目前的协议进行了可行的修改。
利用这种方法,我们从从未感染的动物、感染SIV的动物和经抗逆转录病毒疗法(ART)治疗的SIV感染动物中分离出的PBMC细胞。然而,我们注意到抗逆转录病毒治疗细胞20的转导效率降低。这种减少大概是由于药物抑制逆转录酶和/或整数。从抗逆转录病毒疗法处理的动物细胞的转导将需要修改该协议,例如通过在收集PBMC之前停止抗逆转录病毒疗法几天或使用不受常用抗逆转录病毒药物影响的替代载体来降低抗逆转录病毒药物细胞内水平。
重要的是,为免疫治疗而产生的细胞具有最小的分化表型,这样它们就会在输注后持续12。虽然许多采用细胞转移的协议需要很长的培养时间,但减少的体外培养时间与减少分化和改善CAR T细胞功能13有关。这种转导和扩展协议相对快速的时间范围允许维持所需的中央记忆表型,同时仍然产生足够的细胞来测试其免疫治疗潜力20。
这种T细胞免疫治疗产品生产策略的目标是制造T细胞,识别SIV感染细胞,将流量到B细胞卵泡中的病毒复制部位,并将长期留在动物中功能治疗,无需抗逆转录病毒药物。对于人类免疫治疗产品的翻译,该协议可以通过使用人类特异性抗体和细胞因子以及实施GMP标准来改变,以改变人类T细胞的转化方式,最终目标是为Hiv。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了NIH资助5R01AI096966-06S1(PS、EC和EB),1UM1AI26617(PS, EC 和 EB、P51OD011106/P51RR0000167 (ER)、MN REACH 授予 5U01HL127479-03 (PS)、1R01A143380-01 (PS 和 EB)、1UM14126617(PS 和 EC)以及 NIAID 内膜研究部和国家卫生研究院针对的抗病毒性抗病毒计划提供的资金。这些研究中使用的抗CD3和反CD28由NIH非人类灵长类试剂资源(R24 OD010976,U24 AI126683)提供。这些研究中使用的IL-2由NCI临床前储存库提供。我们感谢我们在这个CD4-MBL CAR/CXCR5项目中的合作者,亚利桑那大学的伊丽莎白·康尼克博士,NIH的爱德华·阿·伯杰博士,威斯康星州国家灵长类研究中心的伊娃·戈·拉卡兹博士,明尼苏达大学的杰夫·哈特博士和普雷蒂·哈兰博士,哈佛医学院的莱斯利·基恩博士,儿童研究所的凯瑟琳·波拉德博士。我们还感谢明尼苏达大学的斯科特·麦基弗博士、弗雷德·哈钦森癌症中心的克里斯托弗·彼得森博士、NIH的马修·特里维特博士、西雅图儿童医院的阿涅·塔拉塞维丘特博士和儿童研究所的康拉德·罗素·克鲁兹博士在优化这一方案方面提供了非常有益的帮助。我们还感谢明尼苏达大学的奇·潘女士和Jhomary Alegria-Berrocal女士生产伽马病毒,感谢威斯康星大学麦迪逊分校的Kim Weisgrau女士隔离河套猴PBMC。
Gammaretrovirus preparation | |||
0.025% Trypsin, 0.01% EDTA | Gibco | R-001-100 | |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
6 well plates, treated | CytoOne | CC7682-7506 | |
DMEM | Gibco | 10569-010 | |
Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | transfection reagent |
Opti-Mem | Invitrogen | 31985070 | reduced serum media |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | A gift from Dr. Patrick Salmon |
pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5 | custom order from GenScript | ||
RD114 | A gift from Dr. Ed Berger | ||
T75 flasks | CytoOne | CC7682-4875 | |
VSV-G | pMD.G | A gift from Dr. Scott McIvor | |
T cell stimulation | |||
6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
Anti-CD28 | NHP Reagent Resource | Clone: CD28.2 | |
Anti-macaque CD3 | NHP Reagent Resource | Clone: FN18 | |
Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells | WNPRC | Primary cells | |
For Fibronectin coating | |||
6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
BSA (Fraction V) | HyClone | SH 30574.02 | |
RetroNectin (1 mg/ml) | TaKaRa | T100A | |
For T cell Expansion | |||
G-Rex 6 Well Plate | Wilson Wolf | P/N 80240M | Plates with gas permeable wells |
Media Components | |||
b mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
IL-2 | NCI Preclinical Repository | ||
Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
X-Vivo-15 medium | Lonza | 04-418Q | |
Variations of Media used | |||
Basic medium: | X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | ||
Expansion medium: | Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol | ||
Growth medium: | Basic medium + 50 IU/ml IL-2 | Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use. | |
Cell counting | |||
Countess cell counting chambers | Invitrogen | AMQAF1000 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | |
Trypan blue, 0.4% solution | Invitrogen | T10282 | |
Flow Cytometry | |||
Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20186 | for conjugation of MBL antibody |
anti-CD28-BV605 | BD Biosciences | 562976 | |
anti-CD3-AF700 | BD Biosciences | 557917 | |
anti-CD4-FITC | BD Biosciences | 556615 | |
anti-CD8-BV788 | BD Biosciences | 563824 | |
anti-CD95-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 561655 | |
anti-CXCR5-PE | eBioscience | 12-1985-42 | |
anti-MBL | Invitrogen | MA1-40145-S6 | |
Flow Analysis software | FlowJo, LLC | FlowJo v10 | |
Flow Cytometer | Beckman | CytoFlex | |
Live/Dead Near IR | Invitrogen | L10119 | |
Other equipment | |||
Aerosolve canisters to contain aerosol leakage | Beckman | SX4750 | Safety equipment |
Beckman Allegra Centrifuge | Beckman | Sterilgard e3 | |
Cell culture incubator | Thermo Fisher | Everlast 247 | |
Class II Laminar flow hood | Baker | Heracell Vios 160i | |
Extra-Safe Disposable lab coat | Fisher Scientific | 359232 | Personal protective equipment |
Microplate carriers with biocertified covers | Beckman | SX4750A | Safety equipment |
Rocking platform | Benchmark | C10228 | |
Swinging bucket rotor | Beckman | X13-R | |
X-Gen Nitrile gloves | Genesee | Personal protective equipment |