Summary
Delineamos um protocolo de 9 dias para a transdução e expansão de células mononucleares periféricas rhesus macaque que produz células com excelente co-expressão dos genes de interesse em número suficiente para estudos de infusão da eficácia celular.
Abstract
Imunoterápicos emergentes para tratar doenças infecciosas e cânceres geralmente envolvem a transdução de populações celulares com genes que codificam proteínas que visam doenças. Por exemplo, as células quiméricas do receptor de antígeno (CAR)-T para tratar cânceres e infecções virais envolvem a transdução de células T com genes sintéticos codificando moléculas car. As moléculas car fazem as células T reconhecerem especificamente e matarem o câncer ou as células infectadas viralmente. As células também podem ser co-transduzidas com outros genes de interesse. Por exemplo, as células podem ser co-transduzidas com genes codificando proteínas que visam as células para locais específicos. Aqui, apresentamos um protocolo para transduzir células mononucleares periféricas primárias (PBMCs) com genes codificando um CAR específico para vírus e o folículo b células que homing molécula quimokina receptor tipo 5 (CXCR5). Este procedimento leva nove dias e resulta em populações de células T transduzidas que mantêm um fenótipo de memória central. A manutenção de uma memória central ou fenótipo menos diferenciado tem sido demonstrada associada à persistência de células pós-infusão. Além disso, as células produzidas com este método apresentam altos níveis de viabilidade, altos níveis de co-expressão dos dois genes transduzidos e grandes quantidades de células para infusão imunoterapêutica. Este protocolo de nove dias pode ser amplamente utilizado para células CAR-T e outras abordagens de imunoterapia celular T. Os métodos descritos aqui são baseados em estudos apresentados em nossas publicações anteriores.
Introduction
As imunoterapias celulares estão surgindo como um novo meio de tratar doenças, incluindo cânceres e doenças infecciosas. Esses métodos de imunoterapia geralmente envolvem manipulação genética de células terapêuticas para expressar moléculas específicas. Por exemplo, as células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) são projetadas para expressar uma molécula CAR que tem um domínio extracelular que liga especificamente moléculas em células doentes e um domínio de sinalização que aciona as células imunes para matar a célula doente. As células CAR T estão sendo usadas com sucesso em imunoterápicos cancerígenos, e têm sido particularmente eficazes no tratamento de leucemias de células B1,2,3. Células CAR-T também estão sendo desenvolvidas para tratar infecções virais como o HIV. As CARs específicas para o HIV visam as proteínas envelope na superfície das células infectadas viralmente4. As células imunoterapêuticas também podem ser projetadas para expressar moléculas de homing para atingir células terapêuticas a locais específicos do tecido. Desenvolvemos vetores que transdutem tanto um CAR específico para o vírus como a molécula de homículo linfóide CXCR55.
A replicação viral de alguns vírus, incluindo o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e o vírus da imunodeficiência símia (SIV), está concentrada dentro de folículos de células B em tecidos linfóides secundários6. Folículos de células B são locais um pouco privilegiados imunológicos nos quais baixos níveis de CTL específicos do vírus permitem a replicação viral contínua7,8. Por essas razões, direcionar células T específicas do HIV/SIV para o folículo através da expressão de CXCR5 é uma estratégia para a eliminação do reservatório folicular de células infectadas viralmente9,10. Especificamente, estamos mirando células CAR T específicas do SIV para folículos celulares B via co-expressão CXCR5.
Neste protocolo descrevemos um método para transduzir CAR/CXCR5 e expandir PBMCs para produzir células CAR/CXCR5 T de quantidades suficientes para infusão terapêutica. As células transduzidas com esses métodos mantêm um fenótipo de memória central. Estudos têm demonstrado que as células com um fenótipo menos diferenciado, como células T de memória central e células-tronco da memória T, persistem melhor do que as células mais diferenciadas11,12. Além disso, muitos protocolos projetados para produzir células transferidas de forma adotiva têm tempos de cultura relativamente longos que resultam em células que possuem um fenótipo mais diferenciado e persistência reduzida13. Além disso, as células adotadas transferidas com longos tempos de cultura acumulados dentro dos pulmões em vez de tecidos linfóides alvo no resus macaque14,15. Nos métodos que descrevemos e demonstramos aqui, rapidamente transdutramos e expandimos pbmcs de macaque rhesus para produzir células T transduzidas que mantêm um fenótipo de memória central.
As células CD4 e CD8 T estão incluídas em nossa abordagem de imunoterapia. Essa população de células mistas foi escolhida porque, em ensaios clínicos, a ausência de células T CD4+ no produto celular CD8+ T foi correlacionada com uma falha das células CD8 T infundidas para persistir 16. Os métodos descritos aqui começam ativando PBMCs com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 que estimulam potentemente o receptor de células T e fornecem um sinal de co-estimulação para evitar a enérgia clonal17,18.
Após a ativação, as células são transduzidas com um vetor gamaretroviral codificando um CAR específico para vírus e a molécula de homing linfóide CXCR5. As células transduzidas são então expandidas usando placas projetadas para propagação celular não aderente que têm uma membrana permeável a gás na base. Esta membrana permite a troca de gás na parte inferior do poço, levando a uma maior sobrevivência celular e disponibilidade de nutrientes19. Usando esses métodos, células funcionais suficientes podem ser produzidas em um prazo de 9 dias para estudos de infusão in vivo. Embora este protocolo seja projetado para transduzir e expandir células T de rhesus macaque, com leve modificação dos anticorpos ativadores específicos da espécie, ele pode ser usado com células de outras espécies. Esses métodos são baseados em nossos estudos publicados anteriormente9,20.
Protocol
NOTA: Este protocolo de transdução rhesus PBMC requer o uso de um vetor gamaretroviral. Observe que o gamaretrovírus pode ser produzido em laboratório ou terceirizado para uma empresa de produção viral. Na produção em laboratório pode ser realizada com o protocolo descrito na etapa 1 e o vírus pode ser titado como descrito na etapa 2. Se o vírus é produzido no local ou por uma empresa produtora, deve ser determinado um MOI (razão de virions infecciosos às células na cultura), conforme descrito na etapa 3, para cada preparação viral recém-produzida e as células de interesse.
ATENÇÃO: O trabalho com vetores gamaretrovirais ou outros vetores retrovirais requer precauções de segurança adequadas, como o uso de jalecos e camadas duplas de luvas. Todo o manuseio do vírus deve ocorrer na capa de biossegurança. Todas as tubulações devem ser descontaminadas em uma solução de 10% de alvejante por 30 min. Todos os resíduos infecciosos líquidos devem ser descontaminados com uma concentração final de 10% de alvejante. A contenção secundária, com um selo que previne a liberação de aerossóis microbiológicos, é necessária para a centrifugação
1. Produção do Estoque Gamaretroviral
- Placa 293T células para transfecção. Uma preparação completa do vírus requer 12 frascos T75 a 4,5 x 106 células/frasco no meio águia modificado de Dulbecco (DMEM) + 10% de soro bovino fetal (FBS) sem antibióticos.
- Deixe que as células cresçam durante a noite a 37 °C antes da transfecção.
- Diluir 60 μL de reagente de transfecção em meios séreos reduzidos de 1,5 mL. Prepare um tubo para cada frasco. Incubar por 5 minutos no RT.
- Para cada frasco, prepare um tubo contendo 1,5 mL de mídia sésorreduzida e os seguintes plasmídeos: 9,0 μg de plasmídeo de transferência contendo o gene(s) de interesse, 3 μg de RD114 e 1,2 μg de VSV-G (plasmídeos envelopes) e 3 μg de gag/pol.
NOTA: Os genes envelope e gag/pol são necessários para a embalagem retroviral. Para nossa produção retroviral, adicionamos tanto o envelope RD114 quanto, para maior estabilidade, uma pequena quantidade de envelope VSV-G. - Adicione plasmídeos diluídos (etapa 1.4) ao reagente de transfecção diluído (etapa 1.3). Misture delicadamente. Incubar por 20 min em temperatura ambiente.
- Alimentar as células 5 mL de mídia completa fresca e adicionar 3 mL de mistura de reagente de transfecção/plasmídeos dropwise por frasco e incubar por 5-6 h a 37 °C.
- Adicione 5 mL adicionais de meio fresco aos frascos e incubar por 42-43 h a 37 °C.
- Após um tempo total de transfecção de 48 h, colete mídia e centrífuga a 1282 x g por 3 min a 4 °C para remover detritos celulares.
- Alíquota em volumes apropriados para uso futuro, congele o vírus em um banho de gelo seco/etanol e armazene a -80 °C.
2. Titering o Gammaretrovirus
NOTA: Várias diluições de vírus podem ser necessárias para obter um título válido.
- Placa 293T células a 600.000 células /bem em uma placa de 6 poços e incubar as placas por 24 h a 37 °C.
- Remova o meio das células e adicione a quantidade desejada de DMEM + 10% FBS ao 293T (volume total de vírus de 2 mL).
- Adicione o vírus ao poço correspondente e gire suavemente para misturar. Por exemplo, adicione 200 μL, 100 μL, 50 μL e 25 μL, respectivamente, a 4 poços. Inclua um poço sem vírus para citometria de fluxo (amostra simulada).
- Incubar por 48 h a 37 °C.
- Tente as células 293T adicionando 0,5 mL de Trypsin-EDTA e incubando por 4 min a 37 °C. Pare a tripsina adicionando 1,5 mL de DMEM + 10% FBS. Conte as células e determine a viabilidade com um contador de células automatizado ou um hemocítômetro.
- Para usar o contador de células, adicione 10 μL de células a 10 μL de azul trypan, misture, carregue o slide da câmara e insira no balcão. Pressione o botão "capturar" para contar as células.
- Coletar 0,5-1 x 106 células e avaliar os níveis de CAR e CXCR5 por citometria de fluxo (ver passo 9.5). A expressão de CD4 ou MBL juntamente com CXCR5 identificará células 293T transduzidas co-expressando o CAR e cXCR5. Veja anticorpos reativos na etapa 9.5.1.
- Calcule o título viral.
NOTA: Escolha a amostra com um nível de transdução de 20% ou menos para o cálculo do título.- Use a seguinte fórmula para calcular o título:
unidades de transdução/mL = (número de células na cultura)(% das células transinduzidas)/volume de vírus adicionadoà cultura
- Use a seguinte fórmula para calcular o título:
3. Determinar o MOI ideal para uma preparação viral recém-produzida e as células de interesse
- Siga o protocolo de transdução (seções 4-9) com PBMCs primários e diluições duplas da preparação gamaretroviral.
- Avaliar o nível de expressão dos genes de interesse por citometria de fluxo (etapa 9.5).
- Escolha uma concentração de vírus que permita a transdução máxima sem perda de viabilidade celular.
4. Preparando placas para ativação de células T por poços de revestimento com anticorpos anti-CD3
- Prepare o anticorpo CD3 anti-macaque (FN18) diluindo o estoque a 10 μg/mL em solução salina tampoada por fosfato (PBS).
- Dispense 2 mL/poço em placas de 6 poços. Incubar a 37 °C por 2 h. Alternativamente, as placas podem ser incubadas durante a noite a 4 °C.
- Aspirar o PBS e anticorpos desvinculados. Enxágüe poços duas vezes com 2 mL de PBS e use imediatamente para emplacar PBMCs.
5. Estimular pbmcs rhesus com anti-CD3 ligado à placa e solúvel Anti-CD28
- Descongele os PBMCs primários em um banho de água de 37 °C, com agitação suave, até que apenas uma pequena quantidade de gelo permaneça.
- No capô, delicadamente as células da pipeta em um tubo cônico. Enxágüe o frasco com 1 mL de meio básico e adicione-o lentamente às células. Em seguida, adicione lentamente um adicional de 9 mL de meio básico quente às células.
NOTA: Esta etapa pode ser ampliada, mas nunca descongele mais de 4 frascos ao mesmo tempo. - Centrífuga a 600 x g por 5 min a 22 °C para pellet as células. Apiratee o sobrenadante e, em seguida, resuspenda a pelota em uma pequena quantidade de meio de crescimento. Escolha um volume de tal forma que a concentração de células exceda 2 x 106 células/mL neste ponto, uma vez que a concentração final deve ser de 2 x 106 células/mL.
- Manche células com trippan azul e conte as células para determinar o número de células viáveis.
NOTA: Isso pode ser feito com um hemocytometro padrão ou um contador de celular automatizado. Usamos um contador de celular automatizado que exibe a viabilidade e o número de células vivas.- Para usar o contador, adicione 10 μL de células a 10 μL de trippan azul, misture, carregue o slide da câmara e insira no balcão. Pressione o botão "capturar" para contar as células.
- Calcule o número total de células multiplicando a concentração celular por volume e, em seguida, diluir as células para 2 x 106 células/mL em meio de crescimento. Antes de emplacar, adicione anti-CD28 a uma concentração final de 5 μg/mL, a fim de fornecer um sinal de co-estimulação necessário para a ativação da célula T.
- Células de pipeta em placas revestidas de anti-CD3. Adicione 3-6 x 106 células por poço (um bom alvo é 4 x 106 células em 2 mL de mídia por poço) e incubar por 2 dias a 37 °C em 5% DE CO2.
6. Preparando placas revestidas de Fibronectina
NOTA: As células PBMC e T expressam receptores integrinos VLA-4 ou VLA-5 e são bons alvos para transdução mediada por fibronectina.
- Antes de revestir as placas, primeiro prepare o reagente de fibronectina diluindo-o 1:100 em PBS estéril.
- Pipeta 2 mL da solução de fibronectina estéril em cada poço de uma placa de 6 poços. Levemente as placas de rocha por 2 h em temperatura ambiente.
NOTA: Placas ou pratos de cultura de cultura de cultura celular não tratados devem ser utilizados nesta etapa. - Remova a solução de fibronectina por aspiração e bloqueie com 1 mL de albumina de soro bovino estéril de 2% (BSA, Fração V) na PBS. Balance as placas à temperatura ambiente por 30 min.
- Apiratee a solução BSA e lave a placa com 2 mL de PBS. Após aspiração do PBS, as placas revestidas de fibronectina podem ser seladas com envoltório de vedação e armazenadas a 4 °C por até uma semana.
NOTA: Geralmente preparamos as placas um dia antes da transdução.
7. Transdução de PBMCs de rhesus ativados
ATENÇÃO: O trabalho com vetores virais ou com PBMCs de macaque resus requer a utilização de precauções de segurança adequadas, como o uso de jalecos e camadas duplas de luvas. Todo o manuseio do vírus e das células deve ocorrer na capa de biossegurança. Todas as tubulações devem ser descontaminadas em uma solução de 10% de alvejante por 30 min. Todos os resíduos infecciosos líquidos devem ser descontaminados com uma concentração final de 10% de alvejante. A contenção secundária com um selo que previne a liberação de aerossóis microbiológicos, é necessária para a centrifugação.
- Conecte o vetor de transdução gamaretroviral ao poço revestido de fibronectina.
- Aqueça uma centrífuga a 32 °C rodando a 2000 x g por cerca de 30 min.
- Aqueça tanto a mídia sem soro quanto a de crescimento em um banho de água de 37 °C.
- Descongele o vírus no gelo ou girando suavemente o frasco em um banho de água de 37 °C até que apenas uma pequena quantidade de gelo permaneça. Para evitar a degradação da preparação viral, não permita que o conteúdo aqueça.
- Diluir o retrovírus para uma multiplicidade ideal predeterminada de infecção (MOI) em meio livre de soro.
NOTA: Com nosso gammaretrovírus e rhesus PBMC, descobrimos que um MOI de 0,5 é ótimo.- Exemplo de diluição: Para revestir 4 poços com vírus e adicionar 1,5 x 106 células, (4)(1,5 x 106)(0,5) = 3 x 106 TU são necessários. Se o título viral for de 1,1 TU/mL, use o vírus de 2,7 mL em mídia de 5,3 mL para um volume total de 8 mL.
- Adicione 2 mL diluído retrovírus a cada poço da placa revestida de fibronectina.
- Para controle negativo de células falsas transduzidas, adicione mídia sozinho aos poços revestidos com fibronectina.
- Coloque as placas na centrífuga pré-aquecida de 32 °C em portadores de microplacas com coberturas bioseguras e centrífugas a 2000 x g por 2 h.
NOTA: As placas revestidas de vírus podem ser usadas imediatamente ou armazenadas, com vírus, a 4 °C durante a noite. - Para uso imediato, apiratee a preparação do vírus dos poços e adicione 2 mL de meio de crescimento. Evitar que os poços revestidos de vírus sequem.
- Emplaca os PBMCs estimulados.
- Verifique as células usando um microscópio invertido. As células devem parecer saudáveis, o que significa que são redondas, brilhantes e refratam a luz. Eles também devem mostrar uma aparência desajeitada indicando estimulação.
- Coletar as células alvo e transferi-las para um tubo cônico de 50 mL. Enxágüe o poço uma vez com 1 mL de mídia de crescimento e adicione ao tubo cônico. Conte o número de células vivas com o contador de celular automatizado como na etapa 5.4.
NOTA: As células estimuladas serão desajeitadas e essa desacoplização pode levar a dificuldades na contagem precisa das células. - Pelota as células nos tubos centrifugando a 600 x g por 5 min a 32 °C. Aspirar a mídia da pelota celular e resuspender as células em meio de crescimento a uma concentração de 1,5 x 106 células/mL.
- Para cada poço revestido de vírus (preparado na etapa 7.1) adicione 1 mL de suspensão celular para um total de 1,5 x 106 células/3 mL. Observe que cada poço já contém 2 mL de crescimento médio. Execute os mesmos passos para células falsas transduzidas, mas emplaca-as em poços revestidos com fibronectina que não receberam vírus.
- Centrifugar as placas a 1000 x g por 10 min a 32 °C.
- Incubar as placas por 48 h a 37 °C abaixo de 5% de CO2.
8. Expansão das células transduzidas
- Desenhe o conteúdo dos poços para cima e para baixo com uma tubulação de 5 mL, a fim de resuspender as células e, em seguida, transferir para um tubo cônico de 50 mL.
- Adicione 1 mL de mídia de crescimento a cada poço e desenhe para cima e para baixo com uma pipeta de transferência estéril para remover as células aderentes.
- Conte células para determinar o número total de células e a viabilidade usando um contador de células automatizado como na etapa 5.4.
- Se desejar, remova 1 x106 células para citometria de fluxo para avaliar a expressão genética e o fenótipo. Consulte o passo 9.5.1 e a Tabela de Materiais para a estratégia recomendada de anticorpos e gating.
- Centrifugar as células a 600 x g por 10 min a 25 °C.
- Aspirar a mídia e resuspender as células em mídia de expansão a uma concentração de 1 x 106 células/mL. Semente cada poço permeável a gás de uma placa de 6 poços com 5 mL de células. Coloque cuidadosamente uma camada adicional de 25 mL de mídia de expansão por poço.
NOTA: Adicionamos as células em um pequeno volume e, em seguida, camada sobra de mídia para que as células permaneçam na parte inferior do poço. - Incubar as células sem perturbação a 37 °C em 5% de incubadora de CO2 durante 4 dias.
9. Coleta de células expandidas e avaliação do fenótipo da população celular transinduzida
- Coletar células de poços permeáveis a gás removendo e descartando 20 mL de mídia. Deve-se ter cuidado para evitar perturbar as células.
NOTA: Expandimos as células por apenas 4 dias e coletamos as células neste momento. No entanto, se forem desejados dias adicionais de cultura, remova 20 mL de mídia sem perturbar as células e substitua-a por 20 mL de novas mídias de expansão. - Pipet a mídia restante para cima e para baixo para desalojar as células. A mídia deve ser muito nebulosa se as células cresceram bem.
- Usando uma tubulação de transferência estéril, enxágue cada poço com mídia de 3 mL para coletar quaisquer células residuais.
- Conte as células com o contador automatizado ou um hemocytometer para verificar a viabilidade e o número do celular.
- Realize citometria de fluxo para determinar a expressão genética transduzida e fenótipo celular.
- Neste exemplo, determine o fenótipo PBMC rhesus macaque utilizando anticorpos direcionados contra cd4 (M-T477), um clone que é reativo com rhCD4 endógeno e o car rhCD4-MBL; contra CD3 (SP34-2) e CD8 (RPA-T8) que mancham células T totais e células T CD8, respectivamente; contra o receptor de morte CD95 (DX2) e a molécula co-estimuladora CD28 (CD28.2) que são usados para determinar o fenótipo de memória das células; e contra CXCR5 (MU5UBEE) e MBL (3E7) para detectar o CAR CXCR5 e CD4-MBL nas células transduzidas.
- A avaliação da viabilidade foi avaliada com um dine de viabilidade fixável.
- Prepare células para citometria de fluxo.
- Faça uma mistura mestre de anticorpos para o número total de tubos. Aumentar o volume total usando pbs.
- Adicione as células aos tubos de fluxo. Coloque 0,5-1 x 106 células por tubo. Inclua controles negativos, como células não manchadas, bem como células falsas e falsas.
- Adicione 2 mL de PBS às células, centrífuga a 400 x g por 5 min à temperatura ambiente (RT) e decante.
- Adicione 100 μL de mistura de anticorpos aos tubos e incubar por 30 min em RT.
- Adicione 2 mL de PBS, centrífuga a 400 x g por 5 min em RT e decante.
- Adicione 300 μL de 1% de paraformaldeído e incubar por 15 min.
- Centrifugação a 400 x g por 5 min no RT e decanto. Adicione 300 μL de PBS e misture.
- Em um citómetro de fluxo, adquira 150.000 eventos para cada amostra.
- Analise os dados com software de análise de fluxo.
NOTA: A estratégia de gating foi publicada anteriormente20.- Para identificação de células transduzidas, células de portão em linfócitos, singlets, live, CD3+, e MBL+CXCR5+.
- Para identificação da população de memória central, células de portão em linfócitos, singlets, CD3+, CD8+, CD28+ CD95+.
- Use células conforme necessário. As células podem ser usadas para ensaios in vitro de função, como um ensaio de migração transwell9 ou ensaios de morte de células in vitro5,9. As células podem ser usadas para infusão em animais. Alternativamente, congele todas as células remanescentes em 90% fbs com sulfóxido de dimetila de 10% (DMSO) para uso posterior ou análise
NOTA: Embora ainda não seja estabelecida uma dose-alvo para infusão de células transferidas de forma adotiva para um macaque resus ainda não está estabelecida, estudos de transferência adotiva publicados em primatas não humanos utilizaram 0,6 a 1,2 x 107 células/kg21, 1 a 5 x 108 células/kg22 e 1,4 a 8 x 108 células/kg10. Com esta gama como diretriz, células suficientes para infusão podem ser produzidas com este protocolo de 9 dias.
Representative Results
Produção celular
Os resultados apresentados nesta publicação são semelhantes aos do nosso trabalho publicado anteriormente9,20. Utilizando o protocolo aqui apresentado, esperamos pelo menos uma expansão de 8 vezes das células entre os dias 5 e 9 (dobra mediana de 11,1 vezes, intervalo de 8,7 a 13 vezes). Os poços permeáveis a gás foram semeados em uma densidade inicial de 5 x 106 células e após 4 dias de crescimento, alcançamos uma densidade mediana de 55,6 x 106 células por poço (faixa 43,5-64,8 x 106)(Figura 1A). A contagem de células com a exclusão do Trypan Blue mostra que as células mantêm alta viabilidade ao longo do protocolo (dia 9 mediana 85,8%, faixa de 83-95%) (Figura 1B). Encontramos variabilidade animal para animal na capacidade das células de se expandirem; no entanto, com uma população inicial de 50-100 x 106 células no dia 1, usamos este protocolo para produzir células suficientes para a infusão de 1-2 x 108 células/kg.
A co-expressão dos genes transduzidos foi monitorada com citometria de fluxo(Figura 2A). A expressão do CAR e do CXCR5 na superfície das células transduzidas foi relativamente estável entre os dias 5 e 9 deste protocolo de expansão. No dia 5, mediana de 42,8% (faixa 36,5-46,9%) das células foram transduzidas tanto com CD4-MBL CAR quanto CXCR5, enquanto no dia 9, a expressão mediana foi de 47,6% (faixa 44,5-64,5%) com uma única rodada de transdução(Figura 2B). Embora alguns protocolos apelam para uma segunda rodada de transdução, não vimos um benefício em termos de células transduzidas totais na conclusão do protocolo (dados não mostrados).
Fenótipo celular
As células transduzidas foram analisadas por citometria de fluxo para monitorar seu fenótipo de memória. Antes da transdução e expansão, são identificadas populações ingênuas, de memória central e de memória efeitodora (dados não mostrados), mas a população ingênua se perde com o cultivo e as células são principalmente células centrais de memória nos dias 5 (Figura 3A) e dia 9 (Figura 3B) identificadas por CD95+ CD28+ expressão. O uso deste protocolo de transdução rápida e expansão produziu células que são principalmente células de memória central e, portanto, serão mais propensas a proliferar e persistir quando infundidas em um animal de teste.
Figura 1: O protocolo de transdução e expansão produz células transduzidas abundantes que são altamente viáveis. ( A) Expansão das células transduzidas de 6 animais diferentes dos dias 5 aos 9 nos vasos permeáveis a gás e (B) viabilidade do PBMC transdução dos mesmos 6 animais. A exclusão azul trypan usando um contador de células automatizado foi usada para monitorar o número do celular e a viabilidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O protocolo de transdução produz células que mantêm a co-expressão dos dois genes transduzidos. (A) Um gráfico de fluxo representativo do Rhesus PBMC no dia 9 do protocolo de transdução e expansão demonstrando a expressão tanto do CAR CD4-MBL quanto do CXCR5. (B) Expressão do CAR CD4-MBL e CXCR5 no resus pbmc transduzido de 6 animais diferentes nos dias 5 e 9 na cultura, medido pela citometria de fluxo. Os portões foram colocados ao vivo, CD3+ células. As células transduzidas são identificadas como MBL+ CXCR5+. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: A maioria das células produzidas no protocolo de 9 dias tem um fenótipo de memória central. Parcelas representativas de citometria de fluxo de (A) dia 5 e (B) dia 9 CAR/CXCR5 transduzido rhesus PBMC. Os portões foram colocados ao vivo, CD3+, CD8+ células. A memória central foi definida como CD28+ CD95+. A memória do efeito foi definida como CD28-, CD95+. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Este protocolo descreve uma estratégia de produção de imunoterapia celular T que utiliza um vetor gamaretroviral para transdutor rhesus macaque PBMC levando à população de células T que expressa um CAR antiviral, bem como o receptor de homing folicular, CXCR5. Com um total de 8 dias de tempo de cultura ex vivo, as células CAR T viáveis e funcionais são produzidas em uma quantidade que está dentro da faixa publicada10,21,22 utilizadas para infusão em primatas não humanos para testes de eficácia pré-clínica.
O sucesso do protocolo de transdução depende tanto de PBMCs saudáveis e estimulados quanto de preparações de qualidade do gamaretrovírus. Para alcançar a estimulação e a transdução bem sucedidas, é essencial que os cuidados adequados seja tomado no congelamento e transporte dos PBMCs após a coleta. Idealmente, se as células são coletadas fora do local, elas são enviadas em nitrogênio líquido e rapidamente colocadas em armazenamento de nitrogênio líquido a longo prazo. Os PBMCs devem ser mitoticamente ativos para serem transdutados com sucesso por um gamaretrovírus. Deve-se monitorar visualmente para agrupamento das células após a estimulação com anti-CD3/anti-CD28. Uma falha na ativação adequada causará baixa eficiência de transdução. Também é importante monitorar a viabilidade nas células estimuladas. A baixa viabilidade após o passo de estimulação geralmente leva a uma transdução menos bem sucedida. Se as preparações do vírus são produzidas em laboratório ou terceirizadas, elas devem ser armazenadas a -80 °C em alíquotas de uso único para evitar ciclos de degelo que podem danificar o vírus e prejudicar a eficiência da transdução. O vírus deve ser usado para que quantidades consistentes de vírus possam ser usadas em cada experimento. Ao usar o vírus para transdução, descongele o vírus rapidamente e armazene no gelo até que seja necessário. A escolha de proteínas promotoras, aprimoradaras e envelopes pode impactar na eficiência da transdução e expressão de transgene nas células-alvo. Assim, um MOI deve ser empiricamente determinado. Além disso, o uso de uma mídia projetada para suportar células T e placas com poços permeáveis a gás para expansão levou a uma excelente expansão das células transduzidas. No entanto, há variabilidade animal para animal na taxa de expansão celular. Recomendamos um estudo experimental para determinar a capacidade de uma determinada preparação celular ser transduzida e expandida. Os níveis de expansão são consistentes em transduções de pequena e grande escala.
Com o uso deste protocolo, produzimos até 2,5 x 109 células para infusão em animais de teste. Embora tenhamos achado desnecessário ampliar o protocolo neste momento, o uso de 6 placas de poço é uma limitação para a preparação celular em larga escala e o protocolo exigiria modificação para produzir um maior número de células. Exemplos de modificações potenciais incluem a realização da transdução em um saco de cultura revestido com fibronectina para aumentar o número de células transduzidas e utilizar um vaso de cultura permeável a gás maior para a etapa de expansão. Embora ainda não tenhamos feito essas alterações, elas utilizam produtos disponíveis comercialmente e são modificações viáveis ao protocolo atual.
Usando este método, produzimos células transduzidas de PBMC isoladas de animais não infectados, animais infectados por SIV e de animais infectados por SIV tratados com terapia antirretroviral (TARV). No entanto, observou-se uma redução da eficiência de transdução nas células tratadas com ART20. Essa redução deve-se, presumivelmente, à inibição da transcriptase reversa e/ou integração pelas drogas. Transduções de células de animais tratados com TARV exigirão modificações neste protocolo, como a redução dos níveis intracelulares dos fármacos ART, parando a ART por vários dias antes da coleta do PBMC ou através do uso de um vetor alternativo que não é impactado pelos fármacos ART comumente utilizados.
É importante que as células produzidas para a imunoterapia sejam de um fenótipo minimamente diferenciado para que persistam após a infusão12. Embora muitos protocolos de transferência adotiva de células exijam longos tempos de cultura, um tempo de cultura ex vivo reduzido tem sido correlacionado tanto com a redução da diferenciação quanto com uma melhoria na função da célula CAR T13. O prazo relativamente rápido deste protocolo de transdução e expansão permite a manutenção do fenótipo de memória central desejado, ao mesmo tempo em que produz células suficientes para o teste de seu potencial imunoterapêutico20.
O objetivo da estratégia de produção deste produto de imunoterapia celular T é fabricar células T que reconhecerão células infectadas por SIV, trafedarão para o local de replicação viral no folículo celular B e persistirão no animal resultando em um longo prazo, resultando em um longo prazo, resultando em um longo prazo cura funcional sem necessidade de drogas anti-retrovirais. Para a tradução para um produto de imunoterapia humana, este protocolo pode ser modificado para transduzir células T humanas através do uso de anticorpos e citocinas específicos do ser humano e da implementação de padrões GMP com o objetivo final de produzir uma cura funcional para Hiv.
Disclosures
Pamela Skinner é co-fundadora e diretora científica da MarPam Pharma.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelas subvenções do NIH 5R01AI096966-06S1 (PS, CE e EB), 1UM1AI26617 (PS, EC e EB), P51OD011106/P51RR000167 (ER), MN REACH grant 5U01HL127479-03 (PS), 1R01A1 43380-01 (PS e EB), 1UM14126617 (PS e CE), bem como fundos fornecidos pela Divisão NIAID de Pesquisa Intramural e pelo Programa Antiviral Direcionado à AIDS Intramural. Anti-CD3 e anti-CD28 utilizados nesses estudos foram fornecidos pelo NIH Nonhuman Primat Reagent Resource (R24 OD010976, U24 AI126683). O IL-2 utilizado nestes estudos foi fornecido pelo Repositório Pré-Clínico da NCI. Agradecemos aos nossos colaboradores neste projeto CD4-MBL CAR/CXCR5, Dr. Elizabeth Connick na Universidade do Arizona, Dr. Edward A Berger na NIAID, NIH, Dr. Eva G Rakasz no Centro Nacional de Pesquisa de Primatas de Wisconsin e Dr. Geoff Hart e Sra. Preethi Haran na Universidade de Minnesota, Dr. Leslie Kean na Harvard Medical School e Dr. Catherine Bollard no Children's Research Institute. Também agradecemos ao Dr. Scott McIvor da Universidade de Minnesota, ao Dr. Christopher Peterson no Fred Hutchinson Cancer Center, ao Dr. Matthew Trivett no NIH, à Dra. Também reconhecemos com gratidão a Srta. Chi Phan e a Sra. Jhomary Alegria-Berrocal na Universidade de Minnesota pela produção gamaretroviral, e a Sra. Kim Weisgrau na Universidade de Wisconsin-Madison pelo isolamento do resus macaque PBMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gammaretrovirus preparation | |||
| 0.025% Trypsin, 0.01% EDTA | Gibco | R-001-100 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 6 well plates, treated | CytoOne | CC7682-7506 | |
| DMEM | Gibco | 10569-010 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | transfection reagent |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985070 | reduced serum media |
| pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | A gift from Dr. Patrick Salmon |
| pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5 | custom order from GenScript | ||
| RD114 | A gift from Dr. Ed Berger | ||
| T75 flasks | CytoOne | CC7682-4875 | |
| VSV-G | pMD.G | A gift from Dr. Scott McIvor | |
| T cell stimulation | |||
| 6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
| Anti-CD28 | NHP Reagent Resource | Clone: CD28.2 | |
| Anti-macaque CD3 | NHP Reagent Resource | Clone: FN18 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells | WNPRC | Primary cells | |
| For Fibronectin coating | |||
| 6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
| BSA (Fraction V) | HyClone | SH 30574.02 | |
| RetroNectin (1 mg/ml) | TaKaRa | T100A | |
| For T cell Expansion | |||
| G-Rex 6 Well Plate | Wilson Wolf | P/N 80240M | Plates with gas permeable wells |
| Media Components | |||
| b mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
| IL-2 | NCI Preclinical Repository | ||
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| X-Vivo-15 medium | Lonza | 04-418Q | |
| Variations of Media used | |||
| Basic medium: | X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | ||
| Expansion medium: | Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol | ||
| Growth medium: | Basic medium + 50 IU/ml IL-2 | Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use. | |
| Cell counting | |||
| Countess cell counting chambers | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Invitrogen | T10282 | |
| Flow Cytometry | |||
| Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20186 | for conjugation of MBL antibody |
| anti-CD28-BV605 | BD Biosciences | 562976 | |
| anti-CD3-AF700 | BD Biosciences | 557917 | |
| anti-CD4-FITC | BD Biosciences | 556615 | |
| anti-CD8-BV788 | BD Biosciences | 563824 | |
| anti-CD95-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 561655 | |
| anti-CXCR5-PE | eBioscience | 12-1985-42 | |
| anti-MBL | Invitrogen | MA1-40145-S6 | |
| Flow Analysis software | FlowJo, LLC | FlowJo v10 | |
| Flow Cytometer | Beckman | CytoFlex | |
| Live/Dead Near IR | Invitrogen | L10119 | |
| Other equipment | |||
| Aerosolve canisters to contain aerosol leakage | Beckman | SX4750 | Safety equipment |
| Beckman Allegra Centrifuge | Beckman | Sterilgard e3 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | Everlast 247 | |
| Class II Laminar flow hood | Baker | Heracell Vios 160i | |
| Extra-Safe Disposable lab coat | Fisher Scientific | 359232 | Personal protective equipment |
| Microplate carriers with biocertified covers | Beckman | SX4750A | Safety equipment |
| Rocking platform | Benchmark | C10228 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman | X13-R | |
| X-Gen Nitrile gloves | Genesee | Personal protective equipment |
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