Vi skisserer en 9-dagers protokoll for transduksjon og utvidelse av rhesus macaque perifere blod mononukleære celler som gir celler med utmerket co-uttrykk av genene av interesse i tilstrekkelig antall for infusjonsstudier av celleeffekt.
Nye immunterapier for å behandle smittsomme sykdommer og kreft innebærer ofte transduksjon av cellulære populasjoner med gener som koder sykdomsrettetproteiner. For eksempel, chimeric antigen reseptor (CAR)-T celler for å behandle kreft og virusinfeksjoner innebære transduksjon av T-celler med syntetiske gener koding CAR molekyler. CAR molekylene gjør T-cellene spesielt gjenkjenne og drepe kreft eller viralt infiserte celler. Celler kan også overføres sammen med andre interessegener. For eksempel kan celler overføres sammen med gener som koder proteiner som retter seg mot celler til bestemte steder. Her presenterer vi en protokoll for å overføre primære perifere blod mononukleære celler (PBMCs) med gener som koder en virusspesifikk BIL og B-cellefollikkelhomingmolekylet chemokinreseptor type 5 (CXCR5). Denne prosedyren tar ni dager og resulterer i transducerte T cellepopulasjoner som opprettholder en sentral minne fenotype. Vedlikehold av et sentralt minne eller mindre differensiert fenotype har vist seg å assosiere med utholdenhet av celler etter infusjon. Videre viser celler produsert med denne metoden høye nivåer av levedyktighet, høye nivåer av kopresjon av de to transduserte genene, og store nok mengder celler for immunoterapeutisk infusjon. Denne ni-dagers protokollen kan brukes bredt til CAR-T-celle og andre T-celle immunterapi tilnærminger. Metodene som er beskrevet her er basert på studier presentert i våre tidligere publikasjoner.
Cellulære immunterapier fremstår som et nytt middel for å behandle sykdommer, inkludert kreft og smittsomme sykdommer. Disse immunterapimetodene involverer ofte genetisk manipulering av terapeutiske celler for å uttrykke spesifikke molekyler. For eksempel er chimeric antigen reseptor (CAR) T-celler konstruert for å uttrykke et CAR molekyl som har et ekstracellulært domene som spesifikt binder molekyler på syke celler og et signaldomene som utløser immuncellene for å drepe den syke cellen. CAR T-celler brukes med hell i kreft immunterapi, og har vært spesielt effektiv i behandling av B celle leukemier1,2,3. CAR-T-celler utvikles også for å behandle virusinfeksjoner som HIV. HIV-spesifikke CARs retter seg mot konvoluttproteinene på overflaten av vially infiserte celler4. Immunoterapeutiske celler kan også konstrueres for å uttrykke homing molekyler for å målrette terapeutiske celler til bestemte vev steder. Vi har utviklet vektorer som transduce både en virus-spesifikk BIL samt lymfoid follicle homing molekyl CXCR55.
Viral replikering av noen virus, inkludert humant immunsviktvirus (HIV) og simian immunsviktvirus (SIV), er konsentrert i B-cellefollikler i sekundært lymfoidvev6. B cellefollikler er noe immunprivilegerte steder der lave nivåer av virusspesifikke CTL tillater pågående viral replikering7,8. Av disse grunnene er målretting av HIV/SIV-spesifikke T-celler i follikkelen gjennom uttrykk for CXCR5 en strategi for eliminering av follikulært reservoar av vially infiserte celler9,10. Spesielt retter vi oss mot SIV-spesifikke CAR T-celler til B-cellefollikler via CXCR5-kopresjon.
I denne protokollen beskriver vi en metode for å transduce CAR /CXCR5 og utvide PBMCs for å produsere CAR / CXCR5 T celler av tilstrekkelige mengder for terapeutisk infusjon. Celler som er transduced med disse metodene opprettholde en sentral minne fenotype. Studier har vist at celler med en mindre differensiert fenotype, for eksempel sentralminne T-celler og T minne stamceller bedre vedvarer enn mer differensierte celler11,12. I tillegg har mange protokoller designet for å produsere adoptivoverførte celler relativt lange kulturtider som resulterer i celler som har en mer differensiert fenotype og redusert utholdenhet13. Videre, adoptivoverførte celler med lange kulturtider akkumulert i lungene i stedet for mål lymfoid vev i rhesus macaque14,15. I metodene vi beskriver og demonstrerer her, vi raskt transduce og utvide rhesus macaque PBMCs å produsere transduced T celler som opprettholder en sentral minne fenotype.
Både CD4- og CD8 T-celler er inkludert i vår immunterapitilnærming. Denne blandede cellepopulasjonen ble valgt fordi fraværet av CD4+ T-celler i CD8+ T-celleproduktet var korrelert med en svikt i infunderte CD8 T-celler for å vedvare 16. Metodene som er beskrevet her begynner med å aktivere PBMCer med anti-CD3 og anti-CD28 antistoffer som kraftig stimulerer T-cellereseptoren og gir et kotimulatorisk signal for å unngå klonal anergy17,18.
Etter aktivering blir celler transduced med en gammaretroviral vektor koding en virusspesifikk BIL og lymfoid homing molekylCXCR5. Transduserte celler utvides deretter ved hjelp av plater designet for ikke-tilhengercelleforplantning som har en gassgjennomtrengelig membran ved basen. Denne membranen tillater gassutveksling på bunnen av brønnen som fører til forbedret celleoverlevelse og næringstilgjengelighet19. Ved hjelp av disse metodene kan tilstrekkelige funksjonelle celler produseres i en 9-dagers tidsramme for in vivo infusjonsstudier. Mens denne protokollen er designet for å transducing og utvide rhesus macaque T-celler, med liten endring av de artsspesifikke aktiveringsantistoffene, kan den brukes med celler fra andre arter. Disse metodene er basert på våre tidligere publiserte studier9,20.
Denne protokollen skisserer en T-celle immunterapi produksjonsstrategi som benytter en gammaretroviral vektor for å transduce rhesus macaque PBMC fører til T cellepopulasjon som uttrykker en antiviral CAR samt follikulær homing reseptor, CXCR5. Med totalt 8 dager med ex vivo kulturtid produseres levedyktige, funksjonelle CAR T-celler i en mengde som er innenfor det publiserte området10,21,22 som brukes til infusjon i ikke-menneskelige primater for preklinisk effekttesting.
Suksessen til transduksjonsprotokollen er avhengig av både sunne, stimulerte PBMCer og kvalitetspreparater av gammaretrovirus. For å oppnå vellykket stimulering og transduksjon, er det viktig at riktig forsiktighet tas i frysing og transport av PBMCs etter innsamling. Ideelt sett, hvis cellene samles inn utenfor stedet, sendes de i flytende nitrogen og raskt plasseres i langsiktig flytende nitrogenlagring. PBMC-er må være mitotisk aktive for å kunne overføres av et gammaretrovirus. Man bør overvåke visuelt for klynger av cellene etter stimulering med anti-CD3 / anti-CD28. En unnlatelse av å aktivere riktig vil føre til lav effektivitet av transduksjon. Det er også viktig å overvåke levedyktigheten i de stimulerte cellene. Dårlig levedyktighet etter stimuleringstrinnet fører vanligvis til en mindre vellykket transduksjon. Enten viruspreparater produseres i laboratoriet eller outsources, bør de lagres ved -80 °C i engangsbruk for å unngå frysetiningssykluser som kan skade viruset og svekke transduksjonseffektiviteten. Viruset må titered slik at konsistente mengder virus kan brukes i hvert eksperiment. Når du bruker viruset for transduksjon, tine viruset raskt og lagre på is til det trengs. Valget av promoter, enhancer og konvolutt proteiner kan alle påvirke transduksjon effektivitet og uttrykk for transgene i målceller. Dermed må en MOI bestemmes empirisk. I tillegg har bruk av et medium designet for å støtte T-celler og plater med gassgjennomtrengelige brønner for ekspansjon ført til utmerket utvidelse av de transduserte cellene. Det er imidlertid dyr til dyr variabilitet i celle ekspansjonshastigheten. Vi anbefaler en studie for å bestemme evnen til et bestemt cellepreparat som skal overføres og utvides. Ekspansjonsnivåene er konsistente i både små og store transduksjoner.
Ved bruk av denne protokollen har vi produsert opptil 2,5 x 109 celler for infusjon i testdyr. Selv om vi har funnet det unødvendig å skalere opp protokollen på dette tidspunktet, er bruk av 6 brønnplater en begrensning for storskala celleforberedelse, og protokollen ville kreve endring for å produsere større antall celler. Eksempler på potensielle modifikasjoner inkluderer å utføre transduksjonen i en fibronectin-belagt kulturpose for å øke antall celler som er transducert og å utnytte et større gassgjennomtrengelig kulturfartøy for ekspansjonstrinnet. Selv om vi ennå ikke har gjort disse endringene, bruker de kommersielt tilgjengelige produkter og er mulige endringer i gjeldende protokoll.
Ved hjelp av denne metoden har vi produsert transduserte celler fra PBMC isolert fra uinfiserte dyr, SIV-infiserte dyr og fra SIV-infiserte dyr behandlet med antiretroviral terapi (ART). Vi har imidlertid notert en reduksjon i transduksjonseffektivitet i ART-behandlede celler20. Denne reduksjonen skyldes antagelig hemming av reverstranskripsjon og/eller integrase av stoffene. Transduksjoner av celler fra ART-behandlede dyr vil kreve endringer i denne protokollen, for eksempel å redusere de intracellulære nivåene av ART-stoffene ved å stoppe ART i flere dager før du samler PBMC eller gjennom bruk av en alternativ vektor som ikke påvirkes av ART-stoffene som vanligvis er i bruk.
Det er viktig at celler produsert for immunterapi være av en minimaldifferensiert fenotype slik at de vil vedvare etter infusjon12. Selv om mange protokoller for adoptivoverføring av celler krever lange kulturtider, har en redusert ex vivo kulturtid vært korrelert med både en reduksjon i differensiering og en forbedring i CAR T cellefunksjon13. Den relativt raske tidsrammen for denne transduksjons- og ekspansjonsprotokollen tillater vedlikehold av ønsket sentral minnefenotype samtidig som de produserer tilstrekkelige celler for testing av deres immunterapeutiske potensial20.
Målet med produksjonsstrategien for dette T-celleimmunterapiproduktet er å produsere T-celler som vil gjenkjenne SIV-infiserte celler, vil trafikktilere til stedet for viral replikering i B-cellefollikkelen og vil vedvare i dyret som resulterer i en langsiktig funksjonell kur uten behov for anti-retrovirale legemidler. For oversettelse til et humant immunterapiprodukt kan denne protokollen endres for å overføre humane T-celler gjennom bruk av menneskespesifikke antistoffer og cytokiner og implementering av GMP-standarder med det endelige målet om en funksjonell kur for Hiv.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av NIH-tilskudd 5R01AI096966-06S1 (PS, EC og EB), 1UM1AI26617 (PS, EC og EB), P51OD011106/P51RR000167 (ER), MN REACH-stipend 5U01HL127479-03 (PS), 1R01A1 43380-01 (PS og EB), 1UM14126617 (PS og EC) samt midler fra NIAID-divisjonen for intramural forskning og NIH Intramural AIDS Målrettet antiviralprogram. Anti-CD3 og anti-CD28 brukt i disse studiene ble levert av NIH Nonhuman Primate Reagent Resource (R24 OD010976, U24 AI126683). IL-2 som ble brukt i disse studiene ble levert av NCI Preclinical Repository. Vi takker våre samarbeidspartnere i dette CD4-MBL CAR/CXCR5-prosjektet, Dr. Elizabeth Connick ved University of Arizona, Dr. Edward A Berger ved NIAID, NIH, Dr. Eva G Rakasz ved Wisconsin National Primate Research Center og Dr. Geoff Hart og Ms. Preethi Haran ved University of Minnesota, Dr. Leslie Kean ved Harvard Medical School og Dr. Catherine Bollard ved Children’s Research Institute. Vi takker også Dr. Scott McIvor ved University of Minnesota, Dr. Christopher Peterson ved Fred Hutchinson Cancer Center, Dr. Matthew Trivett ved NIH, Dr. Agne Taraseviciute ved Seattle Children’s Hospital, og Dr. Conrad Russell Cruz ved The Children’s Research Institute for deres svært nyttige hjelp til å optimalisere denne protokollen. Vi anerkjenner også ms. Chi Phan og Ms. Jhomary Alegria-Berrocal ved University of Minnesota for gammaretroviral produksjon, og Ms. Kim Weisgrau ved University of Wisconsin-Madison for isolasjon av rhesus macaque PBMC.
Gammaretrovirus preparation | |||
0.025% Trypsin, 0.01% EDTA | Gibco | R-001-100 | |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
6 well plates, treated | CytoOne | CC7682-7506 | |
DMEM | Gibco | 10569-010 | |
Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | transfection reagent |
Opti-Mem | Invitrogen | 31985070 | reduced serum media |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | A gift from Dr. Patrick Salmon |
pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5 | custom order from GenScript | ||
RD114 | A gift from Dr. Ed Berger | ||
T75 flasks | CytoOne | CC7682-4875 | |
VSV-G | pMD.G | A gift from Dr. Scott McIvor | |
T cell stimulation | |||
6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
Anti-CD28 | NHP Reagent Resource | Clone: CD28.2 | |
Anti-macaque CD3 | NHP Reagent Resource | Clone: FN18 | |
Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells | WNPRC | Primary cells | |
For Fibronectin coating | |||
6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
BSA (Fraction V) | HyClone | SH 30574.02 | |
RetroNectin (1 mg/ml) | TaKaRa | T100A | |
For T cell Expansion | |||
G-Rex 6 Well Plate | Wilson Wolf | P/N 80240M | Plates with gas permeable wells |
Media Components | |||
b mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
IL-2 | NCI Preclinical Repository | ||
Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
X-Vivo-15 medium | Lonza | 04-418Q | |
Variations of Media used | |||
Basic medium: | X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | ||
Expansion medium: | Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol | ||
Growth medium: | Basic medium + 50 IU/ml IL-2 | Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use. | |
Cell counting | |||
Countess cell counting chambers | Invitrogen | AMQAF1000 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | |
Trypan blue, 0.4% solution | Invitrogen | T10282 | |
Flow Cytometry | |||
Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20186 | for conjugation of MBL antibody |
anti-CD28-BV605 | BD Biosciences | 562976 | |
anti-CD3-AF700 | BD Biosciences | 557917 | |
anti-CD4-FITC | BD Biosciences | 556615 | |
anti-CD8-BV788 | BD Biosciences | 563824 | |
anti-CD95-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 561655 | |
anti-CXCR5-PE | eBioscience | 12-1985-42 | |
anti-MBL | Invitrogen | MA1-40145-S6 | |
Flow Analysis software | FlowJo, LLC | FlowJo v10 | |
Flow Cytometer | Beckman | CytoFlex | |
Live/Dead Near IR | Invitrogen | L10119 | |
Other equipment | |||
Aerosolve canisters to contain aerosol leakage | Beckman | SX4750 | Safety equipment |
Beckman Allegra Centrifuge | Beckman | Sterilgard e3 | |
Cell culture incubator | Thermo Fisher | Everlast 247 | |
Class II Laminar flow hood | Baker | Heracell Vios 160i | |
Extra-Safe Disposable lab coat | Fisher Scientific | 359232 | Personal protective equipment |
Microplate carriers with biocertified covers | Beckman | SX4750A | Safety equipment |
Rocking platform | Benchmark | C10228 | |
Swinging bucket rotor | Beckman | X13-R | |
X-Gen Nitrile gloves | Genesee | Personal protective equipment |