Summary
Vi beskriver ett 9-dagars protokoll för transduktion och expansion av rhesus makak perifert blod mononukleära celler som ger celler med utmärkta co-uttryck av gener av intresse i tillräckligt antal för infusion studier av cellen effekt.
Abstract
Nya immunterapier för att behandla infektionssjukdomar och cancer innebär ofta transduktion av cellulära populationer med gener kodning sjukdomsankande proteiner. Till exempel, chimär antigen receptor (CAR)-T-celler för att behandla cancer och virusinfektioner innebär transduktion av T-celler med syntetiska gener kodning CAR molekyler. CAR-molekylerna gör att T-cellerna specifikt känner igen och dödar cancer eller virusinfekterade celler. Celler kan också samtransduceras med andra gener av intresse. Till exempel kan celler samtransduceras med gener som kodar proteiner som riktar sig till celler till specifika platser. Här presenterar vi ett protokoll för att transduce primära perifera blod mononukleära celler (PBMCs) med gener kodning en virusspecifik CAR och B-cellen follikel homing molekyl chemokine receptor typ 5 (CXCR5). Denna procedur tar nio dagar och resulterar i transduced T-cell populationer som upprätthåller ett centralt minne fenotyp. Underhåll av ett centralt minne eller mindre differentierad fenotyp har visat sig associera med persistens av celler efter infusion. Dessutom visar celler som produceras med denna metod höga nivåer av livskraft, höga nivåer av co-expression av de två transduced gener, och tillräckligt stora mängder celler för immunoterapeutisk infusion. Detta nio dagars protokoll kan i stort sett användas för CAR-T cell och andra T-cells immunterapi metoder. De metoder som beskrivs här är baserade på studier som presenteras i våra tidigare publikationer.
Introduction
Cellulära immunterapier växer fram som ett nytt sätt att behandla sjukdomar inklusive cancer och infektionssjukdomar. Dessa immunterapimetoder innebär ofta genetiskt manipulera terapeutiska celler för att uttrycka specifika molekyler. Till exempel, chimeric antigen receptor (CAR) T-celler är konstruerade för att uttrycka en CAR molekyl som har en extracellulär domän som specifikt binder molekyler på sjuka celler och en signalering domän som utlöser immunceller för att döda den sjuka cellen. CAR T-celler används framgångsrikt i cancer immunterapier, och har varit särskilt effektiva vid behandling av B-cell leukemier1,2,3. CAR-T-celler utvecklas också för att behandla virusinfektioner som hiv. HIV-specifika cars riktar kuvertproteiner på ytan av virusinfekterade celler4. Immunoterapeutiska celler kan också konstrueras för att uttrycka homing molekyler att rikta terapeutiska celler till specifika vävnadsplatser. Vi har utvecklat vektorer som transduce både en virusspecifik CAR samt lymfoid follikel vävning molekyl CXCR55.
Virusreplikation av vissa virus, inklusive humant immunbristvirus (HIV) och simiant immunbristvirus (SIV), är koncentrerat till B-cellsfolliklar i sekundära lymfoida vävnader6. B-cell folliklar är något immun privilegierade platser där låga nivåer av virusspecifika CTL tillstånd pågående viral replikering7,8. Av dessa skäl, inriktning HIV/SIV-specifika T-celler i follikeln genom uttryck för CXCR5 är en strategi för eliminering av follikulära reservoaren av viralt infekterade celler9,10. Specifikt riktar vi SIV-specifika CAR T-celler till B-cellfolliklar via CXCR5 co-expression.
I detta protokoll beskriver vi en metod för att transduce CAR/CXCR5 och expandera PBMCs att producera CAR/CXCR5 T celler av tillräckliga mängder för terapeutisk infusion. Celler som tillverkas med dessa metoder upprätthåller en central minnesfenotyp. Studier har visat att celler med en mindre differentierad fenotyp, såsom centrala minne T-celler och T-minne stamceller bättre kvarstår än mer differentierade celler11,12. Dessutom har många protokoll som är utformade för att producera adoptivt överförda celler relativt långa odlingstider som resulterar i celler som har en mer differentierad fenotyp och minskad persistens13. Dessutom adoptivförflyttade celler med långa odlingstider ackumuleras i lungorna i stället för mål lymfoida vävnader i rhesus makak14,15. I de metoder som vi beskriver och demonstrera här, vi snabbt transduce och expandera rhesus makak PBMCs att producera transduced T-celler som upprätthåller ett centralt minne fenotyp.
Både CD4- och CD8 T-celler ingår i vår immunterapimetod. Denna blandade cellpopulation valdes eftersom frånvaron av CD4+ T-celler i CD8+ T-cellprodukten i kliniska prövningar korrelerades med ett fel på infunderade CD8 T-celler för att kvarstå 16. De metoder som beskrivs här börjar med att aktivera PBMCs med anti-CD3 och anti-CD28 antikroppar som kraftigt stimulera T-cellreceptorn och ger en co-stimulatory signal för att undvika klonursättning anergy17,18.
Efter aktivering, celler transduced med en gammaretroviral vektor kodning en virusspecifik CAR och lymfoida homing molekylen CXCR5. Transducerade celler expanderas sedan med hjälp av plattor avsedda för icke-vidhäftande cell förökning som har en gas genomsläppliga membran vid basen. Detta membran tillåter gasutbyte längst ner i brunnen leder till förbättrad cell överlevnad och näringsämnen tillgänglighet19. Med hjälp av dessa metoder kan tillräckliga funktionella celler produceras inom en 9-dagars tidsram för infusionsstudier in vivo. Även om detta protokoll är utformat för att inducera och expandera rhesus makak T-celler, med liten modifiering av de artspecifika aktiverande antikropparna, kan det användas med celler från andra arter. Dessa metoder är baserade på våra tidigare publicerade studier9,20.
Protocol
OBS: Detta rhesus PBMC transduktionsprotokoll kräver användning av en gammaretroviral vektor. Observera att gammaretrovirus antingen kan produceras i labbet eller läggas ut på en viral produktionsbolag. I lab produktion kan utföras med protokollet beskrivs i steg 1 och viruset kan titered som beskrivs i steg 2. Oavsett om viruset produceras på plats eller av ett produktionsbolag bör ett moi (förhållandet mellan infektiösa virions och celler i odling) bestämmas, som beskrivs i steg 3, för varje nyproducerat viruspreparat och de celler av intresse.
VARNING: Arbete med gammaretrovirala vektorer eller andra retrovirala vektorer kräver lämpliga säkerhetsåtgärder såsom användning av labbrockar och dubbla lager av handskar. All hantering av viruset måste ske i biosäkerhetshuven. Alla pipetter ska saneras i en lösning på 10% blekmedel i 30 min. Allt flytande infektiöst avfall bör saneras med en slutlig koncentration på 10 % blekmedel. Sekundär inneslutning, med en tätning som förhindrar utsläpp av mikrobiologiska aerosoler, krävs för centrifugering
1. Produktion av gammaretrovirala lager
- Platta 293T-celler för transfection. En fullständig virusberedning kräver 12 T75 flaskor vid 4,5 x 106 celler/kolv i Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) + 10% fetala nötkreatur serum (FBS) utan antibiotika.
- Låt cellerna växa över natten vid 37 °C före transfektion.
- Späd 60 μL transfinfektionsreagens i 1,5 ml reducerat serummedel. Förbered ett rör för varje kolv. Inkubera i 5 minuter på RT.
- För varje kolv bereder du ett rör som innehåller 1,5 ml reducerat serummedtryck och följande plasmider: 9,0 μg av en överföringsplasmid som innehåller den eller de gener som är av intresse, 3 μg RD114 och 1,2 μg VSV-G (kuvertplasmider) och 3 μg gag/pol.
OBS: Kuvertet och gag /pol gener behövs för retrovirala förpackningar. För vår retrovirala produktion lägger vi till både RD114-kuvertet och, för ökad stabilitet, en liten mängd VSV-G-kuvert. - Tillsätt utspädda plasmider (steg 1.4) till utspädd transfsektionsreagens (steg 1.3). Blanda försiktigt. Inkubera i 20 min vid rumstemperatur.
- Mata celler 5 ml färskt komplett medium och tillsätt 3 ml transfktionsreagens/plasmidblandning droppesvis per kolv och inkubera i 5–6 timmar vid 37 °C.
- Tillsätt ytterligare 5 ml färskt medium till kolvarna och inkubera i 42–43 timmar vid 37 °C.
- Efter en total transfection tid på 48 h, samla media och centrifug på 1282 x g i 3 min vid 4 °C för att avlägsna cellskräp.
- Aliquot till lämpliga volymer för framtida användning, blixt frysa viruset i en etanol / torris bad och lagra på -80 °C.
2. Titering gammaretroviruset
OBS: Flera utspädningar av virus kan behövas för att erhålla en giltig titer.
- Platta 293T celler vid 600 000 celler/brunn i en 6-brunnsplatta och inkubera plattorna i 24 timmar vid 37 °C.
- Ta bort mediet från cellerna och tillsätt önskad mängd DMEM + 10% FBS till 293T (2 ml total volym av virus).
- Tillsätt viruset till motsvarande brunn och snurra försiktigt för att blanda. Tillsätt till exempel 200 μL, 100 μL, 50 μL respektive 25 μL till 4 brunnar. Inkludera en brunn utan virus för flödescytometri (mock sample).
- Inkubera i 48 timmar vid 37 °C.
- Trypsinize 293T celler genom att lägga till 0,5 ml Trypsin-EDTA och ruva i 4 min vid 37 °C. Stoppa trypsin genom att lägga till 1,5 ml DMEM + 10% FBS. Räkna cellerna och bestämma lönsamheten med en automatiserad cellräknare eller en hemocytometer.
- Om du vill använda cellräknaren lägger du till 10 μL celler till 10 μL trypanblå, blanda, ladda kammarbilden och sätt in i räknaren. Tryck på "capture"-knappen för att räkna cellerna.
- Samla 0,5–1 x 106 celler och utvärdera nivåerna av CAR och CXCR5 med flödescytometri (se steg 9.5). Uttryck för CD4 eller MBL tillsammans med CXCR5 kommer att identifiera transduced 293T celler co-uttrycker CAR och CXCR5. Se reaktiva antikroppar i steg 9.5.1.
- Beräkna viral titer.
OBS: Välj provet med en transduktionsnivå på högst 20 % för beräkning av titer.- Använd följande formel för att beräkna titer:
transduktionsenheter/ml = (antal celler i odling)(% av de celler som tillverkas)/volymen av virus som tillsätts till odlingen
- Använd följande formel för att beräkna titer:
3. Bestämma optimal MOI för en nyproducerad viral beredning och celler av intresse
- Följ transduktionsprotokollet (avsnitt 4–9) med primära PBMC och dubbla utspädningar av gammaretroviralpreparat.
- Bedöm uttrycksnivån för de gener av intresse genom flödescytometri (steg 9.5).
- Välj en koncentration av virus som tillåter maximal transduktion utan förlust av cellviabilitet.
4. Förbereda plattor för T-cellsaktivering genom beläggningsbrunnar med anti-CD3-antikroppar
- Förbered anti-makak CD3-antikropp (FN18) genom att späda ut lagret till 10 μg/ml i fosfatbuffertad koksaltlösning (PBS).
- Fördela 2 ml/brunn i 6-brunnsplattor. Inkubera vid 37 °C i 2 timmar Alternativt kan plattorna ruvas över natten vid 4 °C.
- Aspirera PBS och obundna antikroppar. Skölj brunnarna två gånger med 2 ml PBS och använd omedelbart till plattan PBMCs.
5. Stimulera Rhesus PBMCs med plate-bound Anti-CD3 och lösliga Anti-CD28
- Tina primära rhesus PBMCs i en 37 °C vattenbad, med mild agitation, tills bara en liten mängd is kvarstår.
- I huven, försiktigt pipettceller i ett koniskt rör. Skölj flaskan med 1 ml grundmedium och tillsätt den långsamt i cellerna. Därefter lägger långsamt till ytterligare 9 ml varmt grundmedium till cellerna.
OBS: Detta steg kan skalas upp men tina aldrig mer än 4 flaskor på en gång. - Centrifugera vid 600 x g i 5 min vid 22 °C för att pellet cellerna. Aspirera supernatanten och sedan återsuspend pelleten i en liten mängd tillväxtmedium. Välj en volym så att koncentrationen av celler kommer att överstiga 2 x 106 celler/ml vid denna punkt eftersom den slutliga koncentrationen bör vara 2 x 106 celler/ml.
- Fläckceller med trypan blå och räkna cellerna för att bestämma antalet livskraftiga celler.
OBS: Detta kan göras med en vanlig hemocytometer eller en automatiserad cellräknare. Vi använder en automatiserad cellräknare som visar livskraft och antal levande celler.- För att använda räknaren, tillsätt 10 μl celler till 10 μL trypan blå, blanda, ladda kammaren bilden och sätt in i räknaren. Tryck på "capture"-knappen för att räkna cellerna.
- Beräkna det totala antalet celler genom att multiplicera cellkoncentrationen med volym och späd sedan cellerna till 2 x 106 celler/ml i tillväxtmedium. Före plätering, tillsätt anti-CD28 till en slutlig koncentration på 5 μg/ml för att ge en nödvändig medstimulerande signal för T-cellsaktivering.
- Pipettceller i anti-CD3-belagda plattor. Tillsätt 3–6 x 106 celler per brunn (ett bra mål är 4 x 106 celler i 2 ml-media per brunn) och inkubera i 2 dagar vid 37 °C i 5 % CO2.
6. Förbereda Fibronectin-belagda plattor
OBS: PBMC och T-celler uttrycker integrinreceptorer VLA-4 eller VLA-5 och är bra mål för fibronectin-medierad transduktion.
- Före beläggning av plattorna, först förbereda fibronectin reagens genom att späda ut det 1:100 i steril PBS.
- Pipettera 2 ml steril fibronectinlösning i varje brunn i en 6-brunnsplatta. Försiktigt bergplattor för 2 h vid rumstemperatur.
OBS: Icke-behandlade, cellkultur-grade vävnad kultur plattor eller rätter bör användas i detta steg. - Ta bort fibronectinlösningen genom aspiration och blockera sedan med 1 ml sterilt 2% bovint serumalbumin (BSA, fraktion V) i PBS. Gunga plattorna i rumstemperatur i 30 min.
- Sug upp BSA-lösningen och tvätta plattan med 2 ml PBS. Efter pbs-sökandet kan de fibronectinbelagda plattorna förseglas med tätningslindning och förvaras vid 4 °C i upp till en vecka.
OBS: Vi förbereder vanligtvis plattorna en dag före transduktion.
7. Transduktion av aktiverade rhesus PBMCs
VARNING: Arbete med virusvektorer eller med rhesus makak PBMCs kräver användning av lämpliga säkerhetsåtgärder såsom användning av labbrockar och dubbla lager av handskar. All hantering av viruset och cellerna måste ske i biosäkerhetshuven. Alla pipetter ska saneras i en lösning på 10% blekmedel i 30 min. Allt flytande infektiöst avfall bör saneras med en slutlig koncentration på 10 % blekmedel. Sekundär inneslutning med en tätning som förhindrar utsläpp av mikrobiologiska aerosoler, krävs för centrifugering.
- Fäst gammaretroviral transducing vektor till fibronectin-belagda väl.
- Värm en centrifug till 32 °C genom att köra vid 2000 x g i ca 30 min.
- Värm både serumfri och tillväxtmedia i ett 37 °C vattenbad.
- Tina viruset på is eller genom att försiktigt snurra flaskan i ett 37 °C-vattenbad tills endast en liten mängd is återstår. För att undvika nedbrytning av viruspreparatet, låt inte innehållet värmas upp.
- Späd retroviruset till en förutbestämd optimal mångfald av infektion (MOI) i serumfritt medium.
OBS: Med vår gammaretrovirus och rhesus PBMC, har vi funnit att en MOI på 0,5 är optimal.- Exempel utspädning: Att belägga 4 brunnar med virus och tillsätt 1,5 x 106 celler, (4) (1,5 x 106)(0,5) = 3 x 106 TU behövs. Om virustiter är 1,1 TU/ml, använd sedan 2,7 ml-virus i 5,3 ml-medium för en total volym på 8 ml.
- Tillsätt 2 ml utspädt retrovirus till varje brunn av fibronectin-belagda plattan.
- För negativa kontroll mock-transduced celler, lägga till media ensam till fibronectin-belagda brunnar.
- Placera plattorna i den förvärmda centrifugen på 32 °C i mikroplattor med biosäkra lock och centrifug vid 2000 x g i 2 timmar.
OBS: Virusbelagda plattor kan användas omedelbart eller förvaras, med virus, vid 4 °C över natten. - För omedelbar användning, aspirera virusberedningen från brunnarna och tillsätt 2 ml tillväxtmedium. Håll de virusbelagda brunnarna från torkning.
- Platta stimulerade PBMCs.
- Kontrollera cellerna med ett inverterat mikroskop. Cellerna ska se friska ut, vilket innebär att de är runda, ljusa och bryter ljus. De bör också visa ett klumpigt utseende som indikerar stimulering.
- Samla målceller och överföra dem till en 50 ml koniska rör. Skölj brunnen en gång med 1 ml tillväxtmedia och lägg till det koniska röret. Räkna antalet levande celler med den automatiserade cellräknaren som i steg 5.4.
OBS: Stimulerade celler kommer att klumpas ihop och denna klumpar kan leda till svårigheter att exakt räkna cellerna. - Pellet cellerna i rören genom centrifugering vid 600 x g i 5 min vid 32 °C. Aspirera mediet från cellpelletet och resuspend cellerna i tillväxtmedium vid en koncentration av 1,5 x 106 celler/ml.
- Tillsätt 1 ml cellfjädring för totalt 1,5 x 106 celler/3 ml till varje virusbelagd brunn (bereds i steg 7.1). Observera att varje brunn redan innehåller 2 ml tillväxtmedium. Utför samma steg för mock-transduced celler men platta dem på fibronectin-belagda brunnar som inte fick något virus.
- Centrifugera plattorna vid 1000 x g i 10 min vid 32 °C.
- Inkubera plattorna i 48 timmar vid 37 °C under 5 % CO2.
8. Expansion av de transducerade cellerna
- Rita innehållet i brunnarna upp och ner med en 5 ml pipet för att återsuspend cellerna och sedan överföra till en 50 ml konisk rör.
- Tillsätt 1 ml tillväxtmedia till varje brunn och dra upp och ner med en steril överföring pipett för att ta bort vidhäftande celler.
- Räkna celler för att bestämma det totala cellantalet och livskraften med hjälp av en automatiserad cellräknare som i steg 5.4.
- Om så önskas, ta bort 1 x 106 celler för flödescytometri för att bedöma genuttryck och fenotyp. Se steg 9.5.1 och tabellen över material för rekommenderade antikroppar och gatingstrategi.
- Centrifugera cellerna vid 600 x g i 10 min vid 25 °C.
- Aspirera mediet och resuspend cellerna i expansionsmedia till en koncentration av 1 x 106 celler/ml. Utsäde varje gasgenomsläpplig brunn av en 6-brunnsplatta med 5 ml celler. Lager försiktigt ytterligare 25 ml expansionsmedia per brunn.
OBS: Vi lägger till cellerna i en liten volym och sedan lager återstående media så att cellerna kvar på botten av brunnen. - Inkubera cellerna ostörda vid 37 °C2 i 5% CO 2-inkubator i 4 dagar.
9. Insamling av expanderade celler och utvärdering av fenotypen av den transducerade cellpopulationen
- Samla celler från gasgenomsläppliga brunnar genom att ta bort och kassera 20 ml-media. Försiktighet bör iakttas för att undvika att störa cellerna.
Obs: Vi expanderar cellerna för endast 4 dagar och samla cellerna på denna punkt. Men om ytterligare dagar av kultur önskas, ta bort 20 ml media utan att störa cellerna och ersätta den med 20 ml färskexpansion media. - Pipet det återstående mediet upp och ner för att lossa cellerna. Medierna bör vara mycket grumlig om cellerna har vuxit bra.
- Skölj varje brunn med 3 ml-medium med hjälp av en steril överföringsröra för att samla in eventuella kvarvarande celler.
- Räkna cellerna med den automatiska räknaren eller en hemocytometer för att kontrollera om det finns en lönsamhet och ett cellnummer.
- Utför flödescytometri för att bestämma transduced genuttryck och cellfenotyp.
- I det här exemplet bestämmer du rhesus makak PBMC-fenotyp med hjälp av antikroppar riktade mot CD4 (M-T477), en klon som är reaktiv med både endogen rhCD4 och rhCD4-MBL CAR; mot CD3 (SP34-2) och CD8 (RPA-T8) som färgar totala T-celler respektive CD8 T-celler. mot död receptorn CD95 (DX2) och co-stimulatory molekylen CD28 (CD28.2) som används för att bestämma minnet fenotyp av cellerna; och mot CXCR5 (MU5UBEE) och MBL (3E7) för att upptäcka CXCR5 och CD4-MBL CAR på de transducerade cellerna.
- Bedömning lönsamhet bedömdes med en fastställbar lönsamhet färgämne.
- Förbered celler för flödescytometri.
- Gör upp en antikroppsmasterblandning för det totala antalet rör. Få upp till den totala volymen med PBS.
- Tillsätt cellerna i flödesrör. Placera 0,5–1 x 106 celler per rör. Inkludera negativa kontroller som ofläckade celler samt färgade mock-omdaucerade celler.
- Tillsätt 2 ml PBS till cellerna, centrifugera vid 400 x g i 5 min vid rumstemperatur (RT) och dekantera.
- Tillsätt 100 μl antikroppsblandning till rören och inkubera i 30 min vid RT.
- Tillsätt 2 ml PBS, centrifug på 400 x g i 5 min vid RT och dekantera.
- Tillsätt 300 μL 1% paraformaldehyd och inkubera i 15 min.
- Centrifugera vid 400 x g i 5 min vid RT och dekantera. Tillsätt 300 μl PBS och blanda.
- På en flödescytometer, förvärva 150.000 händelser för varje prov.
- Analysera data med flödesanalysprogramvara.
OBS: Gating strategin har tidigare publicerats20.- För identifiering av transducerade celler, grindceller på lymfocyter, undertrötor, live, CD3+och MBL+CXCR5+.
- För identifiering av den centrala minnespopulationen, gate celler på lymfocyter, singlets, live CD3 +, CD8 +, CD28 + CD95 +.
- Använd celler efter behov. Celler kan användas för in vitro-analyser av funktion, såsom en transwell migration analys9 eller in vitro-cell dödande analyser5,9. Celler kan användas för infusion till djur. Alternativt, frysa eventuella återstående celler i 90% FBS med 10% dimetylsulfaoxid (DMSO) för senare användning eller analys
OBS: Även om en måldos för infusion av adoptivförflyttade celler till en rhesusmacaque ännu inte har fastställts, har publicerade adoptivöverföringsstudier på icke-mänskliga primater använt 0,6 till 1,2 x 107 celler/kg21, 1 till 5 x 108 celler/kg22 och 1,4 till 8 x 108 celler/kg10. Med detta område som riktlinje kan tillräckligt med celler för infusion produceras med detta 9-dagars protokoll.
Representative Results
Cellproduktion
Resultaten som presenteras i denna publikation liknar dem i vårt tidigare publicerade verk9,20. Med hjälp av det protokoll som presenteras här förväntar vi oss minst en 8-faldig expansion av celler mellan dag 5 och 9 (median 11,1 gånger, intervall 8,7–13 gånger). Gasgenomsläppliga brunnar seeds med en starttäthet på 5 x 106 celler och efter 4 dagars tillväxt uppnådde vi en mediantäthet på 55,6 x 106 celler per brunn (intervall 43,5–64,8 x 106) (figur 1A). Cellräkning med Trypan Blue-undantag visar att cellerna har hög lönsamhet i hela protokollet (dag 9 median 85,8%, intervall 83–95%) (Figur 1B). Vi finner djur till djurvariationer i cellernas förmåga att expandera; Men med en startpopulation på 50–100 x 106 celler dag 1 har vi använt detta protokoll för att producera tillräckligt med celler för rhesus makakinfusion på 1–2 x 108 celler/kg.
Meduttryck av de transducerade generna övervakades med flödescytometri (figur 2A). Uttryck för CAR och CXCR5 på ytan av de transduced cellerna var relativt stabil mellan dag 5 och 9 av denna expansion protokoll. Dag 5, en median på 42,8% (intervall 36,5-46,9%) av cellerna var omledas med både CD4-MBL CAR och CXCR5 medan på dag 9 var medianuttrycket 47,6% (intervall 44,5–64,5%) med en enda tranduktionsrunda (figur 2B). Även om vissa protokoll kräver en andra omgång av transduktion, har vi inte sett en fördel i form av totala transduced celler vid slutförandet av protokollet (data visas inte).
Cell fenotyp
Transduced celler analyserades av flöde cytometri att övervaka deras minne fenotyp. Före transduktion och expansion identifieras naiva, centrala minnes- och effektorminnespopulationer (data som inte visas) men den naiva populationen går förlorad med odling och cellerna är främst centrala minnesceller dag 5 (figur 3A) och dag 9 (figur 3B) som identifieras av CD95+ CD28+ uttryck. Användningen av denna snabba transduktion och expansion protokoll har producerat celler som främst är centrala minnesceller och därmed kommer att vara mer benägna att föröka sig och kvarstår när infunderas i ett testdjur.
Figur 1: Omduktions- och expansionsprotokollet producerar rikliga omdaucerade celler som är mycket livskraftiga. a) Utvidgning av de omutbildade cellerna från 6 olika djur från dag 5 till 9 i de gasgenomsläppliga kärlen och(B)den transducerade PBMC:s livskraft från samma 6 djur. Trypan blå uteslutning med hjälp av en automatiserad cellräknare användes för att övervaka cellnummer och lönsamhet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Transduktionsprotokollet producerar celler som upprätthåller ett uttryck för de två transducerade generna. a) Ett representativt flödesområde för rhesus PBMC dag 9 i transduktions- och expansionsprotokollet som visar att både CD4-MBL CAR och CXCR5 uttrycks. b)Uttryck för CD4-MBL CAR och CXCR5 på transduced rhesus PBMC från 6 olika djur dag 5 och 9 i kultur mätt med flödescytometri. Gates sattes på live, CD3+ celler. Transduced celler identifieras som MBL+ CXCR5+. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Majoriteten av de celler som produceras i 9-dagarsprotokollet har en central minnesfenotyp. Representativa flödescytometriområden av(A)dag 5 och(B)dag 9 CAR/CXCR5-transduced rhesus PBMC. Gates sattes på live, CD3+, CD8+ celler. Centralt minne definierades som CD28+ CD95+. Effektorminne definierades som CD28-, CD95+. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Detta protokoll beskriver en T-cells immunterapi produktionsstrategi som använder en gammaretroviral vektor för att transduce rhesus makak PBMC leder till T-cellpopulation som uttrycker en antiviral CAR samt follikulära homing receptor, CXCR5. Med totalt 8 dagars ex vivo-odlingstid produceras livskraftiga, funktionella CAR T-celler i en mängd som ligger inom det publicerade intervallet10,,21,22 som används för infusion till icke-mänskliga primater för preklinisk effekttestning.
Framgången för transduktionsprotokollet bygger på både friska, stimulerade PBMCs och på kvalitetspreparat av gammaretrovirus. För att uppnå framgångsrik stimulering och transduktion är det viktigt att lämplig försiktighet iakttas vid frysning och transport av pbmcs efter insamling. Helst, om cellerna samlas in utanför anläggningen, de levereras i flytande kväve och snabbt placeras i långsiktiga flytande kväve lagring. PBMCs måste vara mitotically aktiva för att framgångsrikt kunna överföras av ett gammaretrovirus. Man bör övervaka visuellt för klustring av cellerna efter stimulering med anti-CD3/anti-CD28. Ett fel att aktivera på rätt sätt kommer att orsaka låg effektivitet i transduktion. Det är också viktigt att övervaka livskraften i de stimulerade cellerna. Dålig lönsamhet efter stimuleringssteget leder vanligtvis till en mindre lyckad transduktion. Oavsett om viruspreparat produceras i labbet eller läggs ut på entreprenad bör de förvaras vid -80 °C i alikvoter för engångsbruk för att undvika frysdöpcykler som kan skada viruset och försämra transduktionseffektiviteten. Viruset måste titereras så att konsekventa mängder virus kan användas i varje experiment. När du använder viruset för transduktion, tina viruset snabbt och förvara på is tills det behövs. Valet av promotor-, förstärkare- och kuvertproteiner kan alla påverka transduktionseffektiviteten och uttrycket av transgen i målceller. Således måste en MOI vara empiriskt bestämd. Dessutom har användningen av ett medium som utformats för att stödja T-celler och plattor med gasgenomsläppliga brunnar för expansion lett till utmärkt expansion av de transducerade cellerna. Det finns dock djur till djurvariationer i cellexpansionen. Vi rekommenderar en studie för att bestämma förmågan hos en viss cell beredning som skall transduceras och utökas. Expansionsnivåerna är konsekventa i både små och stora transductions.
Med hjälp av detta protokoll har vi producerat upp till 2,5 x 109 celler för infusion till försöksdjur. Även om vi har funnit det onödigt att skala upp protokollet just nu, är användningen av 6 brunnsplattor en begränsning till storskalig cellberedning och protokollet skulle kräva ändringar för att producera ett större antal celler. Exempel på potentiella modifieringar är att utföra transduktionen i en fibronectin-belagda kulturpåse för att öka antalet celler som tillverkas och för att utnyttja ett större gasgenomsläppligt kulturkärl för expansionssteget. Även om vi ännu inte har gjort dessa ändringar, de använder kommersiellt tillgängliga produkter och är genomförbara ändringar av det nuvarande protokollet.
Med denna metod har vi producerat transduced celler från PBMC isolerade från oinfekterade djur, SIV-infekterade djur och från SIV-infekterade djur som behandlats med antiretroviral terapi (ART). Vi har dock noterat en minskning av transduktionseffektiviteten i ART-behandlade celler20. Denna minskning beror förmodligen på hämning av omvänd transkriptas och/eller integras av drogerna. Transductions av celler från ART-behandlade djur kommer att kräva ändringar av detta protokoll såsom att minska de intracellulära nivåerna av ART droger genom att stoppa ART i flera dagar innan insamling av PBMC eller genom användning av en alternativ vektor som inte påverkas av ART droger som vanligen används.
Det är viktigt att celler som produceras för immunterapi vara av en minimalt differentierad fenotyp så att de kommer att kvarstå efter infusion12. Även om många protokoll för adoptivöverföring av celler kräver långa odlingstider, har en minskad ex vivo-kulturtid korrelerats med både en minskning av differentiering och en förbättring av CAR T-cellfunktion13. Den relativt snabba tidsramen för detta transduktions- och expansionsprotokoll gör det möjligt att underhålla den önskade centrala minnesfenotypen samtidigt som den producerar tillräckligt med celler för testning av deras immunoterapeutiska potential20.
Målet med produktionsstrategin för denna T-cellsimmunterapiprodukt är att tillverka T-celler som känner igen SIV-infekterade celler, kommer att trafikera till platsen för virusreplikation i B-cellfol follikeln och kommer att kvarstå i djuret vilket resulterar i en långsiktig funktionellt botemedel utan behov av antiretrovirala läkemedel. För översättning till en humanimmunterapiprodukt kan detta protokoll ändras för att transducera mänskliga T-celler med hjälp av humanspecifika antikroppar och cytokiner och implementering av GMP-standarder med slutmålet att producera ett funktionellt botemedel mot Hiv.
Disclosures
Dr Pamela Skinner är en av grundarna och chief scientific officer i MarPam Pharma.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av NIH-bidrag 5R01AI096966-06S1 (PS, EG och EB), 1UM1AI26617 (PS, EG och EB), P51OD011106/P51RR000167 (ER), MN REACH-bidrag 5U01HL127479-03 (PS), 1R01A143380-01 (PS och EB), 1UM14126617 (PS och EG) samt medel från NIAID-avdelningen för intramural forskning och NIH:s intramurala aids-riktade antivirala program. Anti-CD3 och anti-CD28 som användes i dessa studier tillhandahölls av NIH Nonhuman Primate Reagent Resource (R24 OD010976, U24 AI126683). IL-2 som användes i dessa studier tillhandahölls av NCI prekliniska repository. Vi tackar våra medarbetare i detta CD4-MBL CAR /CXCR5 projekt, Dr Elizabeth Connick vid University of Arizona, Dr Edward A Berger vid NIAID, NIH, Dr Eva RakaSz vid Wisconsin National Primate Research Center och Dr Geoff Hart och Ms Preethi Haran vid University of Minnesota, Dr Leslie Kean vid Harvard Medical School och Dr Catherine Bollard vid Children's Institute Research. Vi tackar också Dr Scott McIvor vid University of Minnesota, Dr Christopher Peterson vid Fred Hutchinson Cancer Center, Dr Matthew Trivett vid NIH, Dr Agne Taraseviciute vid Seattle Children's Hospital, och Dr Conrad Russell Cruz vid The Children's Research Institute för deras mycket hjälp med att optimera detta protokoll. Vi erkänner också tacksamt Ms Chi Phan och Ms Jhomary Alegria-Berrocal vid University of Minnesota för gammaretroviral produktion, och Ms Kim Weisgrau vid University of Wisconsin-Madison för isolering av rhesus makak PBMC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gammaretrovirus preparation | |||
| 0.025% Trypsin, 0.01% EDTA | Gibco | R-001-100 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 6 well plates, treated | CytoOne | CC7682-7506 | |
| DMEM | Gibco | 10569-010 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | transfection reagent |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985070 | reduced serum media |
| pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | A gift from Dr. Patrick Salmon |
| pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5 | custom order from GenScript | ||
| RD114 | A gift from Dr. Ed Berger | ||
| T75 flasks | CytoOne | CC7682-4875 | |
| VSV-G | pMD.G | A gift from Dr. Scott McIvor | |
| T cell stimulation | |||
| 6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
| Anti-CD28 | NHP Reagent Resource | Clone: CD28.2 | |
| Anti-macaque CD3 | NHP Reagent Resource | Clone: FN18 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
| Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells | WNPRC | Primary cells | |
| For Fibronectin coating | |||
| 6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
| BSA (Fraction V) | HyClone | SH 30574.02 | |
| RetroNectin (1 mg/ml) | TaKaRa | T100A | |
| For T cell Expansion | |||
| G-Rex 6 Well Plate | Wilson Wolf | P/N 80240M | Plates with gas permeable wells |
| Media Components | |||
| b mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
| IL-2 | NCI Preclinical Repository | ||
| Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
| X-Vivo-15 medium | Lonza | 04-418Q | |
| Variations of Media used | |||
| Basic medium: | X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | ||
| Expansion medium: | Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol | ||
| Growth medium: | Basic medium + 50 IU/ml IL-2 | Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use. | |
| Cell counting | |||
| Countess cell counting chambers | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | |
| Trypan blue, 0.4% solution | Invitrogen | T10282 | |
| Flow Cytometry | |||
| Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20186 | for conjugation of MBL antibody |
| anti-CD28-BV605 | BD Biosciences | 562976 | |
| anti-CD3-AF700 | BD Biosciences | 557917 | |
| anti-CD4-FITC | BD Biosciences | 556615 | |
| anti-CD8-BV788 | BD Biosciences | 563824 | |
| anti-CD95-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 561655 | |
| anti-CXCR5-PE | eBioscience | 12-1985-42 | |
| anti-MBL | Invitrogen | MA1-40145-S6 | |
| Flow Analysis software | FlowJo, LLC | FlowJo v10 | |
| Flow Cytometer | Beckman | CytoFlex | |
| Live/Dead Near IR | Invitrogen | L10119 | |
| Other equipment | |||
| Aerosolve canisters to contain aerosol leakage | Beckman | SX4750 | Safety equipment |
| Beckman Allegra Centrifuge | Beckman | Sterilgard e3 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | Everlast 247 | |
| Class II Laminar flow hood | Baker | Heracell Vios 160i | |
| Extra-Safe Disposable lab coat | Fisher Scientific | 359232 | Personal protective equipment |
| Microplate carriers with biocertified covers | Beckman | SX4750A | Safety equipment |
| Rocking platform | Benchmark | C10228 | |
| Swinging bucket rotor | Beckman | X13-R | |
| X-Gen Nitrile gloves | Genesee | Personal protective equipment |
References
- Klebanoff, C. A., Rosenberg, S. A., Restifo, N. P. Prospects for gene-engineered T cell immunotherapy for solid cancers. Nature Medicine. 22 (1), 26-36 (2016).
- Lim, W. A., June, C. H. The Principles of Engineering Immune Cells to Treat Cancer. Cell. 168 (4), 724-740 (2017).
- Sadelain, M., Rivière, I., Riddell, S. Therapeutic T cell engineering. Nature. 545 (7655), 423-431 (2017).
- Kuhlmann, A., Peterson, C. W. Chimeric antigen receptor T-cell approaches to HIV cure. Current Opinion in HIV and AIDS. 13 (5), 446-453 (2018).
- Ghanem, M. H., Bolivar-Wagers, S., et al. Bispecific chimeric antigen receptors targeting the CD4 binding site and high-mannose Glycans of gp120 optimized for anti-human immunodeficiency virus potency and breadth with minimal immunogenicity. Cytotherapy. 20, 407-419 (2018).
- Folkvord, J. M., Armon, C., Connick, E. Lymphoid Follicles Are Sites of Heightened Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) Replication and Reduced Antiretroviral Effector Mechanisms. AIDS Research and Human Retroviruses. , (2005).
- Connick, E., Mattila, T., et al. CTL Fail to Accumulate at Sites of HIV-1 Replication in Lymphoid Tissue. The Journal of Immunology. 178 (11), 6975-6983 (2007).
- Connick, E., Folkvord, J. M., et al. Compartmentalization of Simian Immunodeficiency Virus Replication within Secondary Lymphoid Tissues of Rhesus Macaques Is Linked to Disease Stage and Inversely Related to Localization of Virus-Specific CTL. The Journal of Immunology. 193 (11), 5613-5625 (2014).
- Haran, K. P., Hajduczki, A., et al. Simian immunodeficiency virus (SIV)-specific chimeric antigen receptor-T cells engineered to target B cell follicles and suppress SIV replication. Frontiers in Immunology. 9 (MAR), 1-12 (2018).
- Ayala, V. I., Deleage, C., et al. CXCR5-Dependent Entry of CD8 T Cells into Rhesus Macaque B-Cell Follicles Achieved through T-Cell Engineering. Journal of Virology. 91 (11), e02507-e02516 (2017).
- Redeker, A., Arens, R. Improving adoptive T cell therapy: The particular role of T cell costimulation, cytokines, and post-transfer vaccination. Frontiers in Immunology. 7 (SEP), 1-17 (2016).
- Klebanoff, C. A., Gattinoni, L., Restifo, N. P. Sorting Through Subsets. Journal of Immunotherapy. 35 (9), 651-660 (2012).
- Ghassemi, S., Nunez-Cruz, S., et al. Reducing Ex Vivo Culture Improves the Antileukemic Activity of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells. Cancer Immunology Research. 6 (9), 1100-1109 (2018).
- Minang, J. T., Trivett, M. T., Bolton, D. L., Trubey, C. M., Estes, J. D., Li, Y., et al. Efficacy of Adoptively Transferred Central and Effector Memory-Derived Autologous Simian Immunodeficiency Virus-Specific CD8+ T Cell Clones in Rhesus Macaques during Acute Infection. The Journal of Immunology. 184 (1), 315-326 (2010).
- Bolton, D. L., Minang, J. T., et al. Trafficking, persistence, and activation state of adoptively transferred allogeneic and autologous Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8(+) T cell clones during acute and chronic infection of rhesus macaques. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950). 184 (1), 303-314 (2010).
- Patel, S., Jones, R. B., Nixon, D. F., Bollard, C. M. T-cell therapies for HIV : Preclinical successes and current clinical strategies. Cytotherapy. 18 (8), 931-942 (2019).
- Chambers, C. A., Allison, J. P. Costimulatory regulation of T cell function. Current Opinion in Cell Biology. 11 (2), 203-210 (1999).
- Schwartz, R. H. A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy. Science. 248 (4961), 1349-1356 (1990).
- Bajgain, P., Mucharla, R., et al. Optimizing the production of suspension cells using the G-Rex M series. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 1, 14015 (2014).
- Pampusch, M. S., Haran, K. P., et al. Rapid transduction and expansion of transduced T cells with maintenance of central memory populations. Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 16, 1-10 (2019).
- Taraseviciute, A., Tkachev, V., et al. Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates. Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).
- Berger, C., Sommermeyer, D., et al. Safety of targeting ROR1 in primates with chimeric antigen receptor-modified T cells. Cancer Immunology Research. 3 (2), 206-216 (2015).
