Vi beskriver ett 9-dagars protokoll för transduktion och expansion av rhesus makak perifert blod mononukleära celler som ger celler med utmärkta co-uttryck av gener av intresse i tillräckligt antal för infusion studier av cellen effekt.
Nya immunterapier för att behandla infektionssjukdomar och cancer innebär ofta transduktion av cellulära populationer med gener kodning sjukdomsankande proteiner. Till exempel, chimär antigen receptor (CAR)-T-celler för att behandla cancer och virusinfektioner innebär transduktion av T-celler med syntetiska gener kodning CAR molekyler. CAR-molekylerna gör att T-cellerna specifikt känner igen och dödar cancer eller virusinfekterade celler. Celler kan också samtransduceras med andra gener av intresse. Till exempel kan celler samtransduceras med gener som kodar proteiner som riktar sig till celler till specifika platser. Här presenterar vi ett protokoll för att transduce primära perifera blod mononukleära celler (PBMCs) med gener kodning en virusspecifik CAR och B-cellen follikel homing molekyl chemokine receptor typ 5 (CXCR5). Denna procedur tar nio dagar och resulterar i transduced T-cell populationer som upprätthåller ett centralt minne fenotyp. Underhåll av ett centralt minne eller mindre differentierad fenotyp har visat sig associera med persistens av celler efter infusion. Dessutom visar celler som produceras med denna metod höga nivåer av livskraft, höga nivåer av co-expression av de två transduced gener, och tillräckligt stora mängder celler för immunoterapeutisk infusion. Detta nio dagars protokoll kan i stort sett användas för CAR-T cell och andra T-cells immunterapi metoder. De metoder som beskrivs här är baserade på studier som presenteras i våra tidigare publikationer.
Cellulära immunterapier växer fram som ett nytt sätt att behandla sjukdomar inklusive cancer och infektionssjukdomar. Dessa immunterapimetoder innebär ofta genetiskt manipulera terapeutiska celler för att uttrycka specifika molekyler. Till exempel, chimeric antigen receptor (CAR) T-celler är konstruerade för att uttrycka en CAR molekyl som har en extracellulär domän som specifikt binder molekyler på sjuka celler och en signalering domän som utlöser immunceller för att döda den sjuka cellen. CAR T-celler används framgångsrikt i cancer immunterapier, och har varit särskilt effektiva vid behandling av B-cell leukemier1,2,3. CAR-T-celler utvecklas också för att behandla virusinfektioner som hiv. HIV-specifika cars riktar kuvertproteiner på ytan av virusinfekterade celler4. Immunoterapeutiska celler kan också konstrueras för att uttrycka homing molekyler att rikta terapeutiska celler till specifika vävnadsplatser. Vi har utvecklat vektorer som transduce både en virusspecifik CAR samt lymfoid follikel vävning molekyl CXCR55.
Virusreplikation av vissa virus, inklusive humant immunbristvirus (HIV) och simiant immunbristvirus (SIV), är koncentrerat till B-cellsfolliklar i sekundära lymfoida vävnader6. B-cell folliklar är något immun privilegierade platser där låga nivåer av virusspecifika CTL tillstånd pågående viral replikering7,8. Av dessa skäl, inriktning HIV/SIV-specifika T-celler i follikeln genom uttryck för CXCR5 är en strategi för eliminering av follikulära reservoaren av viralt infekterade celler9,10. Specifikt riktar vi SIV-specifika CAR T-celler till B-cellfolliklar via CXCR5 co-expression.
I detta protokoll beskriver vi en metod för att transduce CAR/CXCR5 och expandera PBMCs att producera CAR/CXCR5 T celler av tillräckliga mängder för terapeutisk infusion. Celler som tillverkas med dessa metoder upprätthåller en central minnesfenotyp. Studier har visat att celler med en mindre differentierad fenotyp, såsom centrala minne T-celler och T-minne stamceller bättre kvarstår än mer differentierade celler11,12. Dessutom har många protokoll som är utformade för att producera adoptivt överförda celler relativt långa odlingstider som resulterar i celler som har en mer differentierad fenotyp och minskad persistens13. Dessutom adoptivförflyttade celler med långa odlingstider ackumuleras i lungorna i stället för mål lymfoida vävnader i rhesus makak14,15. I de metoder som vi beskriver och demonstrera här, vi snabbt transduce och expandera rhesus makak PBMCs att producera transduced T-celler som upprätthåller ett centralt minne fenotyp.
Både CD4- och CD8 T-celler ingår i vår immunterapimetod. Denna blandade cellpopulation valdes eftersom frånvaron av CD4+ T-celler i CD8+ T-cellprodukten i kliniska prövningar korrelerades med ett fel på infunderade CD8 T-celler för att kvarstå 16. De metoder som beskrivs här börjar med att aktivera PBMCs med anti-CD3 och anti-CD28 antikroppar som kraftigt stimulera T-cellreceptorn och ger en co-stimulatory signal för att undvika klonursättning anergy17,18.
Efter aktivering, celler transduced med en gammaretroviral vektor kodning en virusspecifik CAR och lymfoida homing molekylen CXCR5. Transducerade celler expanderas sedan med hjälp av plattor avsedda för icke-vidhäftande cell förökning som har en gas genomsläppliga membran vid basen. Detta membran tillåter gasutbyte längst ner i brunnen leder till förbättrad cell överlevnad och näringsämnen tillgänglighet19. Med hjälp av dessa metoder kan tillräckliga funktionella celler produceras inom en 9-dagars tidsram för infusionsstudier in vivo. Även om detta protokoll är utformat för att inducera och expandera rhesus makak T-celler, med liten modifiering av de artspecifika aktiverande antikropparna, kan det användas med celler från andra arter. Dessa metoder är baserade på våra tidigare publicerade studier9,20.
Detta protokoll beskriver en T-cells immunterapi produktionsstrategi som använder en gammaretroviral vektor för att transduce rhesus makak PBMC leder till T-cellpopulation som uttrycker en antiviral CAR samt follikulära homing receptor, CXCR5. Med totalt 8 dagars ex vivo-odlingstid produceras livskraftiga, funktionella CAR T-celler i en mängd som ligger inom det publicerade intervallet10,,21,22 som används för infusion till icke-mänskliga primater för preklinisk effekttestning.
Framgången för transduktionsprotokollet bygger på både friska, stimulerade PBMCs och på kvalitetspreparat av gammaretrovirus. För att uppnå framgångsrik stimulering och transduktion är det viktigt att lämplig försiktighet iakttas vid frysning och transport av pbmcs efter insamling. Helst, om cellerna samlas in utanför anläggningen, de levereras i flytande kväve och snabbt placeras i långsiktiga flytande kväve lagring. PBMCs måste vara mitotically aktiva för att framgångsrikt kunna överföras av ett gammaretrovirus. Man bör övervaka visuellt för klustring av cellerna efter stimulering med anti-CD3/anti-CD28. Ett fel att aktivera på rätt sätt kommer att orsaka låg effektivitet i transduktion. Det är också viktigt att övervaka livskraften i de stimulerade cellerna. Dålig lönsamhet efter stimuleringssteget leder vanligtvis till en mindre lyckad transduktion. Oavsett om viruspreparat produceras i labbet eller läggs ut på entreprenad bör de förvaras vid -80 °C i alikvoter för engångsbruk för att undvika frysdöpcykler som kan skada viruset och försämra transduktionseffektiviteten. Viruset måste titereras så att konsekventa mängder virus kan användas i varje experiment. När du använder viruset för transduktion, tina viruset snabbt och förvara på is tills det behövs. Valet av promotor-, förstärkare- och kuvertproteiner kan alla påverka transduktionseffektiviteten och uttrycket av transgen i målceller. Således måste en MOI vara empiriskt bestämd. Dessutom har användningen av ett medium som utformats för att stödja T-celler och plattor med gasgenomsläppliga brunnar för expansion lett till utmärkt expansion av de transducerade cellerna. Det finns dock djur till djurvariationer i cellexpansionen. Vi rekommenderar en studie för att bestämma förmågan hos en viss cell beredning som skall transduceras och utökas. Expansionsnivåerna är konsekventa i både små och stora transductions.
Med hjälp av detta protokoll har vi producerat upp till 2,5 x 109 celler för infusion till försöksdjur. Även om vi har funnit det onödigt att skala upp protokollet just nu, är användningen av 6 brunnsplattor en begränsning till storskalig cellberedning och protokollet skulle kräva ändringar för att producera ett större antal celler. Exempel på potentiella modifieringar är att utföra transduktionen i en fibronectin-belagda kulturpåse för att öka antalet celler som tillverkas och för att utnyttja ett större gasgenomsläppligt kulturkärl för expansionssteget. Även om vi ännu inte har gjort dessa ändringar, de använder kommersiellt tillgängliga produkter och är genomförbara ändringar av det nuvarande protokollet.
Med denna metod har vi producerat transduced celler från PBMC isolerade från oinfekterade djur, SIV-infekterade djur och från SIV-infekterade djur som behandlats med antiretroviral terapi (ART). Vi har dock noterat en minskning av transduktionseffektiviteten i ART-behandlade celler20. Denna minskning beror förmodligen på hämning av omvänd transkriptas och/eller integras av drogerna. Transductions av celler från ART-behandlade djur kommer att kräva ändringar av detta protokoll såsom att minska de intracellulära nivåerna av ART droger genom att stoppa ART i flera dagar innan insamling av PBMC eller genom användning av en alternativ vektor som inte påverkas av ART droger som vanligen används.
Det är viktigt att celler som produceras för immunterapi vara av en minimalt differentierad fenotyp så att de kommer att kvarstå efter infusion12. Även om många protokoll för adoptivöverföring av celler kräver långa odlingstider, har en minskad ex vivo-kulturtid korrelerats med både en minskning av differentiering och en förbättring av CAR T-cellfunktion13. Den relativt snabba tidsramen för detta transduktions- och expansionsprotokoll gör det möjligt att underhålla den önskade centrala minnesfenotypen samtidigt som den producerar tillräckligt med celler för testning av deras immunoterapeutiska potential20.
Målet med produktionsstrategin för denna T-cellsimmunterapiprodukt är att tillverka T-celler som känner igen SIV-infekterade celler, kommer att trafikera till platsen för virusreplikation i B-cellfol follikeln och kommer att kvarstå i djuret vilket resulterar i en långsiktig funktionellt botemedel utan behov av antiretrovirala läkemedel. För översättning till en humanimmunterapiprodukt kan detta protokoll ändras för att transducera mänskliga T-celler med hjälp av humanspecifika antikroppar och cytokiner och implementering av GMP-standarder med slutmålet att producera ett funktionellt botemedel mot Hiv.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av NIH-bidrag 5R01AI096966-06S1 (PS, EG och EB), 1UM1AI26617 (PS, EG och EB), P51OD011106/P51RR000167 (ER), MN REACH-bidrag 5U01HL127479-03 (PS), 1R01A143380-01 (PS och EB), 1UM14126617 (PS och EG) samt medel från NIAID-avdelningen för intramural forskning och NIH:s intramurala aids-riktade antivirala program. Anti-CD3 och anti-CD28 som användes i dessa studier tillhandahölls av NIH Nonhuman Primate Reagent Resource (R24 OD010976, U24 AI126683). IL-2 som användes i dessa studier tillhandahölls av NCI prekliniska repository. Vi tackar våra medarbetare i detta CD4-MBL CAR /CXCR5 projekt, Dr Elizabeth Connick vid University of Arizona, Dr Edward A Berger vid NIAID, NIH, Dr Eva RakaSz vid Wisconsin National Primate Research Center och Dr Geoff Hart och Ms Preethi Haran vid University of Minnesota, Dr Leslie Kean vid Harvard Medical School och Dr Catherine Bollard vid Children’s Institute Research. Vi tackar också Dr Scott McIvor vid University of Minnesota, Dr Christopher Peterson vid Fred Hutchinson Cancer Center, Dr Matthew Trivett vid NIH, Dr Agne Taraseviciute vid Seattle Children’s Hospital, och Dr Conrad Russell Cruz vid The Children’s Research Institute för deras mycket hjälp med att optimera detta protokoll. Vi erkänner också tacksamt Ms Chi Phan och Ms Jhomary Alegria-Berrocal vid University of Minnesota för gammaretroviral produktion, och Ms Kim Weisgrau vid University of Wisconsin-Madison för isolering av rhesus makak PBMC.
Gammaretrovirus preparation | |||
0.025% Trypsin, 0.01% EDTA | Gibco | R-001-100 | |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
6 well plates, treated | CytoOne | CC7682-7506 | |
DMEM | Gibco | 10569-010 | |
Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | transfection reagent |
Opti-Mem | Invitrogen | 31985070 | reduced serum media |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | A gift from Dr. Patrick Salmon |
pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5 | custom order from GenScript | ||
RD114 | A gift from Dr. Ed Berger | ||
T75 flasks | CytoOne | CC7682-4875 | |
VSV-G | pMD.G | A gift from Dr. Scott McIvor | |
T cell stimulation | |||
6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
Anti-CD28 | NHP Reagent Resource | Clone: CD28.2 | |
Anti-macaque CD3 | NHP Reagent Resource | Clone: FN18 | |
Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells | WNPRC | Primary cells | |
For Fibronectin coating | |||
6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
BSA (Fraction V) | HyClone | SH 30574.02 | |
RetroNectin (1 mg/ml) | TaKaRa | T100A | |
For T cell Expansion | |||
G-Rex 6 Well Plate | Wilson Wolf | P/N 80240M | Plates with gas permeable wells |
Media Components | |||
b mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
IL-2 | NCI Preclinical Repository | ||
Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
X-Vivo-15 medium | Lonza | 04-418Q | |
Variations of Media used | |||
Basic medium: | X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | ||
Expansion medium: | Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol | ||
Growth medium: | Basic medium + 50 IU/ml IL-2 | Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use. | |
Cell counting | |||
Countess cell counting chambers | Invitrogen | AMQAF1000 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | |
Trypan blue, 0.4% solution | Invitrogen | T10282 | |
Flow Cytometry | |||
Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20186 | for conjugation of MBL antibody |
anti-CD28-BV605 | BD Biosciences | 562976 | |
anti-CD3-AF700 | BD Biosciences | 557917 | |
anti-CD4-FITC | BD Biosciences | 556615 | |
anti-CD8-BV788 | BD Biosciences | 563824 | |
anti-CD95-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 561655 | |
anti-CXCR5-PE | eBioscience | 12-1985-42 | |
anti-MBL | Invitrogen | MA1-40145-S6 | |
Flow Analysis software | FlowJo, LLC | FlowJo v10 | |
Flow Cytometer | Beckman | CytoFlex | |
Live/Dead Near IR | Invitrogen | L10119 | |
Other equipment | |||
Aerosolve canisters to contain aerosol leakage | Beckman | SX4750 | Safety equipment |
Beckman Allegra Centrifuge | Beckman | Sterilgard e3 | |
Cell culture incubator | Thermo Fisher | Everlast 247 | |
Class II Laminar flow hood | Baker | Heracell Vios 160i | |
Extra-Safe Disposable lab coat | Fisher Scientific | 359232 | Personal protective equipment |
Microplate carriers with biocertified covers | Beckman | SX4750A | Safety equipment |
Rocking platform | Benchmark | C10228 | |
Swinging bucket rotor | Beckman | X13-R | |
X-Gen Nitrile gloves | Genesee | Personal protective equipment |