Vi skitserer en 9-dages protokol for transduktion og udvidelse af rhesus macaque perifere blod mononukleare celler, som giver celler med fremragende co-udtryk for gener af interesse i tilstrækkeligt antal til infusion undersøgelser af celleeffekt.
Nye immunterapier til behandling af smitsomme sygdomme og kræft involverer ofte transduktion af cellulære populationer med gener, der koder for sygdomsmodificerende proteiner. For eksempel, kimære antigen receptor (CAR)-T celler til behandling af kræft og virusinfektioner indebærer transduktion af T-celler med syntetiske gener kodning CAR molekyler. CAR molekyler gør T-celler specifikt genkende og dræbe kræft eller viralt inficerede celler. Celler kan også være co-transduceret med andre gener af interesse. For eksempel kan celler være co-transduceret med gener kodning proteiner, der er målrettet celler til bestemte steder. Her præsenterer vi en protokol til at transduceprimære perifere blod mononukleare celler (PBMCs) med gener, der koder en virus-specifik CAR og B-celle follikel homing molekyle chemokinreceptor type 5 (CXCR5). Denne procedure tager ni dage og resulterer i transinducerede T-cellepopulationer, der opretholder en central hukommelsefænotype. Vedligeholdelse af en central hukommelse eller mindre differentieret fænotype har vist sig at associere sig med persistens af celler efter infusion. Desuden viser celler, der er produceret med denne metode, høje niveauer af levedygtighed, høje niveauer af samekspression af de to transinducerede gener og store nok mængder celler til immunterapeutisk infusion. Denne ni-dages protokol kan anvendes bredt til CAR-T celle og andre T-celle immunterapi tilgange. De metoder, der er beskrevet her, er baseret på undersøgelser, der er præsenteret i vores tidligere publikationer.
Cellulære immunterapier er ved at opstå som et nyt middel til behandling af sygdomme, herunder kræft og smitsomme sygdomme. Disse immunterapi metoder involverer ofte genetisk manipulere terapeutiske celler til at udtrykke specifikke molekyler. For eksempel er kimære antigen receptor (CAR) T-celler manipuleret til at udtrykke en CAR molekyle, der har en ekstracellulær domæne, der specifikt binder molekyler på syge celler og et signaldomæne, der udløser immunceller til at dræbe den syge celle. CAR T-celler anvendes med succes i kræftimmunterapier og har været særligt effektive til behandling af B-celle leukæmi1,2,3. CAR-T celler er også ved at blive udviklet til behandling af virusinfektioner såsom HIV. HIV-specifikke CAR’er er målrettet mod kuvertproteiner på overfladen af viralt inficerede celler4. Immunoterapeutiske celler kan også manipuleres til at udtrykke homing molekyler til at målrette terapeutiske celler til specifikke væv steder. Vi har udviklet vektorer, der transduce både en virus-specifikke CAR samt lymfoide follikel homing molekyle CXCR55.
Viral replikering af visse vira, herunder human immundefektvirus (HIV) og simian immundefektvirus (SIV), er koncentreret i B-cellefollikler i sekundære lymfoide væv6. B-celle follikler er noget immun privilegerede steder, hvor lave niveauer af virus-specifikke CTL tillader løbende viral replikation7,8. Af disse grunde er målretning mod HIV/SIV-specifikke T-celler i follikelen gennem ekspression af CXCR5 en strategi for eliminering af det follikulære reservoir af viralt inficerede celler9,10. Konkret er vi rettet mod SIV-specifikke CAR T-celler til B-cellefollikler via CXCR5 co-udtryk.
I denne protokol beskriver vi en metode til at transducere CAR/CXCR5 og udvide PBMC’er til at producere CAR/CXCR5 T-celler af tilstrækkelige mængder til terapeutisk infusion. Celler transduceret med disse metoder opretholde en central hukommelse fænotype. Undersøgelser har vist, at celler med en mindre differentieret fænotype, såsom centrale hukommelse T-celler og T-hukommelse stamceller bedre fortsætter end mere differentierede celler11,12. Desuden har mange protokoller, der er designet til at producere adoptivoverførte celler, relativt lange dyrkningstider, der resulterer i celler, der har en mere differentieret fænotype og reduceret persistens13. Desuden, adoptivløst overførte celler med lange kultur gange akkumuleret i lungerne i stedet for mål lymfoide væv i rhesus makak14,15. I de metoder, vi beskriver og demonstrerer her, gennemfører og udvider vi hurtigt rhesus macaque PBMC’er til at producere transinducerede T-celler, der opretholder en central hukommelsesfænotype.
Både CD4- og CD8 T-celler er inkluderet i vores immunterapitilgang. Denne blandede cellepopulation blev valgt, fordi fraværet af CD4+ T-celler i CD8+ T-celleproduktet i kliniske forsøg var korreleret med en fejl i infunderede CD8 T-celler til at vare ved 16. De metoder, der er beskrevet her, begynder med at aktivere PBMC’er med anti-CD3- og anti-CD28-antistoffer , som kraftigt stimulerer T-cellereceptoren og giver et cotimulatorisk signal for at undgå klonanteri17,18.
Efter aktivering transinduceres cellerne med en gammaretroviral vektor, der koder en virusspecifik CAR og lymfehomingsmolekylet CXCR5. Transinducerede celler udvides derefter ved hjælp af plader, der er konstrueret til ikke-klæbende celleformering, og som har en gasgennemtrængelig membran i bunden. Denne membran tillader gasudveksling i bunden af brønden, der fører til forbedret celleoverlevelse og næringsstoftilgængelighed19. Ved hjælp af disse metoder kan der produceres tilstrækkelige funktionelle celler inden for en 9-dages tidsramme for in vivo-infusionsundersøgelser. Mens denne protokol er designet til at transducing og udvide rhesus makak T-celler, med mindre ændring af de artsspecifikke aktiverende antistoffer, kan det bruges med celler fra andre arter. Disse metoder er baseret på vores tidligere offentliggjorte undersøgelser9,20.
Denne protokol skitserer en T-celle immunterapi produktionsstrategi, som udnytter en gammaretroviral vektor til at transduce rhesus makak PBMC fører til T-celle befolkning, der udtrykker en antiviral CAR samt follikulære homing receptor, CXCR5. Med i alt 8 dages ex vivo kulturtid produceres levedygtige, funktionelle CAR T-celler i en mængde, der ligger inden for det offentliggjorte område10,,21,22, der anvendes til infusion til ikke-menneskelige primater til præklinisk e-test.,
Transduktionsprotokollens succes afhænger både af sunde, stimulerede PBMC’er og af kvalitetspræparater af gammaretrovirus. For at opnå en vellykket stimulering og transduktion er det vigtigt, at der udvises passende forsigtighed ved nedfrysning og transport af PBMC’erne efter indsamlingen. Ideelt set, hvis cellerne er indsamlet off site, de sendes i flydende nitrogen og hurtigt placeret i langsigtet flydende kvælstof opbevaring. PBMC’er skal være mitotically aktive for at kunne transinduceres med en gammaretrovirus. Man bør overvåge visuelt for klyngedannelse af cellerne efter stimulation med anti-CD3/anti-CD28. Hvis en manglende aktivering aktiveres korrekt, vil det medføre lav effektivitet i transduktionen. Det er også vigtigt at overvåge levedygtigheden i de stimulerede celler. Dårlig levedygtighed efter stimulering trin fører normalt til en mindre vellykket transduktion. Uanset om viruspræparater produceres i laboratoriet eller outsources, bør de opbevares ved -80 °C i enkeltbrugsaliquots for at undgå fryseoptøningscyklusser, der kan beskadige virusset og forringe transduktionseffektiviteten. Virussen skal titered således, at ensartede mængder af virus kan anvendes i hvert eksperiment. Når du bruger virus til transduktion, tø virus hurtigt og opbevares på is, indtil det er nødvendigt. Valget af promotor- og kuvertproteiner kan alle påvirke transduktionseffektiviteten og ekspressionen af transgene i målcellerne. Således skal en MOI være empirisk bestemt. Desuden har brugen af et medie designet til at understøtte T-celler og plader med gasgennemtrængelige brønde til ekspansion ført til en fremragende udvidelse af de transinducerede celler. Der er dog dyr til dyr variabilitet i cellen ekspansion sats. Vi anbefaler en forsøgsundersøgelse for at bestemme evnen af en bestemt celle præparat, der skal transduceret og udvidet. Ekspansionsniveauerne er ensartede i både små og store transduktioner.
Med brugen af denne protokol har vi produceret op til 2,5 x 109 celler til infusion i forsøgsdyr. Selv om vi har fundet det unødvendigt at opskalere protokollen på nuværende tidspunkt, er brugen af 6 brøndplader en begrænsning af storstilet celleforberedelse, og protokollen vil kræve ændringer for at producere et større antal celler. Eksempler på potentielle ændringer omfatter udførelse af transduktion en fibronectin-belagt kulturpose for at øge antallet af transinducerede celler og for at udnytte et større gasgennemtrængeligt dyrkningsfartøj til ekspansionstrinnet. Selv om vi endnu ikke har foretaget disse ændringer, de udnytter kommercielt tilgængelige produkter og er gennemførlige ændringer til den nuværende protokol.
Ved hjælp af denne metode har vi produceret transinducerede celler fra PBMC isoleret fra ikke-inficerede dyr, SIV-inficerede dyr og fra SIV-inficerede dyr behandlet med antiretroviral behandling (ART). Men vi har bemærket en reduktion i transduktionseffektiviteten i ART-behandlede celler20. Denne reduktion skyldes formentlig hæmning af omvendt transkriptase og/eller integrase af stofferne. Transduktioner af celler fra ART-behandlede dyr vil kræve ændringer af denne protokol, såsom at reducere de intracellulære niveauer af ART narkotika ved at stoppe ART i flere dage før indsamling af PBMC eller ved brug af en alternativ vektor, som ikke er påvirket af ART narkotika almindeligt i brug.
Det er vigtigt, at celler, der produceres til immunterapi, er af en minimalt differentieret fænotype, så de vil fortsætte efter infusion12. Selv om mange protokoller for adoptivoverførsel af celler kræver lange dyrkningstider, er en reduceret ex vivo kulturtid blevet korreleret med både en reduktion i differentiering og en forbedring af CAR T-cellefunktionen13. Den relativt hurtige tidsramme for denne transduktions- og ekspansionsprotokol gør det muligt at opretholde den ønskede centralhukommelsefænotype, mens der stadig produceres tilstrækkeligt mange celler til test af deres immunterapeutiske potentiale20.
Målet med produktionsstrategien for denne T-celle immunterapi produkt er at fremstille T-celler, der vil genkende SIV-inficerede celler, vil trafikken til det sted, viral replikation i B-celle follikel og vil fortsætte i dyret resulterer i en langsigtet funktionel kur uden behov for antiretrovirale lægemidler. For oversættelse til et humant immunterapiprodukt kan denne protokol ændres til at transducere humane T-celler ved hjælp af humant specifikke antistoffer og cytokiner og gennemførelse af GMP-standarder med det endelige mål at producere en funktionel kur mod Hiv.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af NIH-tilskud 5R01AI0969666-06S1 (PS, EF og EB), 1UM1AI26617 (PS, EF og EB), P51OD011106/P51RR000167 (ER), MN REACH-tilskud 5U01HL127479-03 (PS), 1R01A1 43380-01 (PS og EB), 1UM14126617 (PS og EF) samt midler fra NIAID Division of Intramural Research og NIH Intramural AIDS Targeted Antiviral Program. Anti-CD3 og anti-CD28, der anvendes i disse undersøgelser blev leveret af NIH Nonhuman Primate Reagens Resource (R24 OD010976, U24 AI126683). IL-2, der blev anvendt i disse undersøgelser, blev leveret af NCI’s prækliniske depot. Vi takker vores samarbejdspartnere i denne CD4-MBL CAR / CXCR5 projekt, Dr. Elizabeth Connick ved University of Arizona, Dr. Edward A Berger på NIAID, NIH, Dr. Eva G Rakasz på Wisconsin National Primate Research Center og Dr. Geoff Hart og Ms Preethi Haran ved University of Minnesota, Dr. Leslie Kean på Harvard Medical School og Dr. Catherine Bollard på Children’s Research Institute. Vi takker også Dr. Scott McIvor ved University of Minnesota, Dr. Christopher Peterson på Fred Hutchinson Cancer Center, Dr. Matthew Trivett på NIH, Dr. Agne Taraseviciute på Seattle Children’s Hospital, og Dr. Conrad Russell Cruz på The Children’s Research Institute for deres meget hjælpsomme bistand til at optimere denne protokol. Vi har også taknemmeligt anerkender Ms Chi Phan og Ms Jhomary Alegria-Berrocal ved University of Minnesota for gammaretroviral produktion, og Ms Kim Weisgrau ved University of Wisconsin-Madison for isolering af rhesus makak PBMC.
Gammaretrovirus preparation | |||
0.025% Trypsin, 0.01% EDTA | Gibco | R-001-100 | |
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
6 well plates, treated | CytoOne | CC7682-7506 | |
DMEM | Gibco | 10569-010 | |
Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | transfection reagent |
Opti-Mem | Invitrogen | 31985070 | reduced serum media |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | A gift from Dr. Patrick Salmon |
pMSGV1 containing CAR P2A CXCR5 | custom order from GenScript | ||
RD114 | A gift from Dr. Ed Berger | ||
T75 flasks | CytoOne | CC7682-4875 | |
VSV-G | pMD.G | A gift from Dr. Scott McIvor | |
T cell stimulation | |||
6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
Anti-CD28 | NHP Reagent Resource | Clone: CD28.2 | |
Anti-macaque CD3 | NHP Reagent Resource | Clone: FN18 | |
Phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | |
Rhesus macaque PBMC or CD8 T cells | WNPRC | Primary cells | |
For Fibronectin coating | |||
6 well plates, untreated | CytoOne | CC7672-7506 | |
BSA (Fraction V) | HyClone | SH 30574.02 | |
RetroNectin (1 mg/ml) | TaKaRa | T100A | |
For T cell Expansion | |||
G-Rex 6 Well Plate | Wilson Wolf | P/N 80240M | Plates with gas permeable wells |
Media Components | |||
b mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
Heat-inactivated FBS | Hyclone | Sh30088.03 | |
IL-2 | NCI Preclinical Repository | ||
Penicillin/Streptomycin/Glutamine | Gibco | 10378-016 | |
X-Vivo-15 medium | Lonza | 04-418Q | |
Variations of Media used | |||
Basic medium: | X-Vivo 15 medium, 10% heat-inactivated FBS, 1 x Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine | ||
Expansion medium: | Growth medium + 50 mM b mercaptoethanol | ||
Growth medium: | Basic medium + 50 IU/ml IL-2 | Completion of media by addition of anti-CD28, IL-2 or b-mercaptoethanol should occur on the day of use. | |
Cell counting | |||
Countess cell counting chambers | Invitrogen | AMQAF1000 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | T10282 | |
Trypan blue, 0.4% solution | Invitrogen | T10282 | |
Flow Cytometry | |||
Alexa Fluor 647 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20186 | for conjugation of MBL antibody |
anti-CD28-BV605 | BD Biosciences | 562976 | |
anti-CD3-AF700 | BD Biosciences | 557917 | |
anti-CD4-FITC | BD Biosciences | 556615 | |
anti-CD8-BV788 | BD Biosciences | 563824 | |
anti-CD95-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 561655 | |
anti-CXCR5-PE | eBioscience | 12-1985-42 | |
anti-MBL | Invitrogen | MA1-40145-S6 | |
Flow Analysis software | FlowJo, LLC | FlowJo v10 | |
Flow Cytometer | Beckman | CytoFlex | |
Live/Dead Near IR | Invitrogen | L10119 | |
Other equipment | |||
Aerosolve canisters to contain aerosol leakage | Beckman | SX4750 | Safety equipment |
Beckman Allegra Centrifuge | Beckman | Sterilgard e3 | |
Cell culture incubator | Thermo Fisher | Everlast 247 | |
Class II Laminar flow hood | Baker | Heracell Vios 160i | |
Extra-Safe Disposable lab coat | Fisher Scientific | 359232 | Personal protective equipment |
Microplate carriers with biocertified covers | Beckman | SX4750A | Safety equipment |
Rocking platform | Benchmark | C10228 | |
Swinging bucket rotor | Beckman | X13-R | |
X-Gen Nitrile gloves | Genesee | Personal protective equipment |