Summary
Her præsenterer vi en arbejdsgang for udtryk, rensning og Liposom binding af SNX-BAR Heterodimere i gær.
Abstract
SNX-BAR proteiner er en evolutionært bevaret klasse af membran remodeling proteiner, der spiller nøgleroller i sortering og handel med protein og lipiderne under endokytose, sortering inden for endosomale system, og autophagy. Central til SNX-BAR protein funktion er evnen til at danne homodimers eller Heterodimere, der binder membraner ved hjælp af stærkt bevaret phox-Homology (PX) og BAR (bin/Amphiphysin/RVS) domæner. Desuden kan oligomerisering af snx-bar dimerer på membraner fremkalde dannelsen af membran tubuler og vesikler, og denne aktivitet menes at afspejle deres funktioner som pels proteiner til endosome-afledte transportvirksomheder. Forskere har længe udnyttet in vitro bindende undersøgelser ved hjælp af rekombinant snx-bar proteiner på syntetiske Liposomer eller gigantiske af vesikler (guvs) at afsløre den præcise makeup af lipider er nødvendige for at drive membran Remodeling, og dermed afsløre deres virkningsmekanisme. Men på grund af tekniske udfordringer med Dual Expression systemer, toksicitet af snx-bar protein ekspression i bakterier, og dårlig Opløselighed af individuelle snx-bar proteiner, de fleste undersøgelser til dato har undersøgt snx-bar homodimers, herunder ikke-fysiologiske dimerer, der dannes under ekspression i bakterier. For nylig har vi optimeret en protokol for at overvinde de store mangler ved et typisk bakterielt udtryks system. Ved hjælp af denne arbejdsgang viser vi, hvordan man med held udtrykker og renser store mængder af SNX-BAR Heterodimere, og hvordan man rekonstruere dem på syntetiske Liposomer til bindende og tubulations assays.
Introduction
Membranbundne organeller såsom plasma membranen, endoplasmatiske reticulum, Golgi-apparatet, lysosom (gær vakuole) og endosome udgør endomembrane-systemet i eukaryote-cellen. De fleste organeller har evnen til at kommunikere og udveksle materiale med andre organeller gennem vesikle transport bærere. Hvordan cellen koordinerer emballering og dannelse af vesikle transport bærere inden for endomembrane systemet er ikke godt forstået. Men de proteiner og lipider, som udgør meget af endomembrane systemet er kendt for at stamme fra internalisere endokytiske vesikler fra plasma membranen (PM). Endosome er den primære acceptor organelle for disse vesikler og består af flere sammenkoblede sæt af rørformede organeller. Den vigtigste funktion af endosome er at lette næringsstof erhvervelse, regulere protein og lipid omsætning, beskytte mod patogen infektion, og til at fungere som den primære genopfylde kilde til lipider til plasma membranen. Da endosome modtager hovedparten af last proteiner og lipider fra plasma membranen, fungerer det som sorterings kammer ved at isolere Cargos i rørformede endosomale transport bærere (ETCs). Eventuelle proteiner, der ikke er opdelt i ETCs, er overladt til at blive forringet via endo-lysosomal-systemet. Dysreguleringen af sortering af lasten i ETCs kan føre til tab af næringsstofoptagelse, protein omsætning eller lipid homøostase, hvilket resulterer i talrige metaboliske, udviklingsmæssige og neurologiske lidelser1,2. Men til trods for den centrale ETCs-rolle i endosome er den underliggende mekanisme for, hvordan endosome selektivt kan koordinere emballeringen af en lang række heterogene laster i rørformede bærere, ikke kendt.
Den sortering nexin (snx) familie er en evolutionært bevaret klasse af proteiner, der har fundet at være kritisk for mange vesikelprotein transport reaktioner i cellen3,4,5. Sortering nexins er rekrutteret til endosome membran og støtte i Cargo Capture via deres karakteristiske phox Homologi (px) domæne, som binder phosphatidylinositol-3-monophosphat (ptdins (3) P), en lipid beriget på endosome membran. Pattedyr indkode 33 SNX proteiner, som kan yderligere opdeles i flere underfamilier, i henhold til tilstedeværelsen af andre domæner1. Især snx-bar familien er den største under familie bestående af tolv mennesker, mens der i spirende gær, Saccharomyces cerevisiae, under familien er reduceret til bare syv snx-barer. SNX-BAR proteiner har både en PX domæne og en bin-Amphiphysin-RVS (BAR) domæne, der udløser lipid reservoirer til at binde positive krumning membraner. Derfor SNX-BAR familie har en naturlig affinitet for endosome og kan mægle osv dannelse via deres membran remodeling evner. In vitro, remodeling egenskaber af SNX-BARs kan induceres ved tilsætning af renset SNX-BARs til syntetiske Liposomer og den efterfølgende dannelse af smalle, coatede tubuler kan visualiseres ved elektronmikroskopi. Ved hjælp af disse metoder, forskerne har fastslået, at både oligomerisering koncentration og konstriktion styrke synes at variere blandt snx-bar familie tyder på, at de kunne støtte i både dannelse og bedriftssammenlægning af ETCs.
Snx-BARs kan yderligere klassificeres ved deres eksklusive denne egenskaber. In vitro-bindende analyser og strukturelle undersøgelser har vist, at SNX-BAR proteiner kun kan danne specifikke homodimers eller Heterodimere. Derfor kan hver potentiel SNX-BAR dimer-oligomer i princippet give en tubulær frakke til en fragt specifik smugler vej, og ligeledes, den begrænsede oligomerisering af de andre SNX-BAR protomers, også definere særskilte eksportveje. Men på grund af det store antal SNX-barer og mangfoldighed inden for SNX-familien er en enkelt sortering nexin-One Cargo-hypotese højst usandsynlig. I stedet en koordineret indsats ved hjælp af en lang række faktorer, såsom SNX-barer, last, lipid specificitet og andre afhængigheder er mere sandsynligt. Ligeledes, nylige undersøgelser af gær SNX4 familie afslørede beviser for yderligere lipid specificitet, ud over PtdIns (3) P, at forstærke endosome transport luftfartsselskaber6. I denne undersøgelse, snx-bar homodimer Mvp1-Mvp1 blev renset fra bakterier og indfødte heterodimers Snx4-Atg20 og Vps5-Vps17 blev udtrykt og renset i højt udbytte fra gær, mens kun Snx4-Atg20 blev fundet at fortrinsvis binde Phosphatidylserin (PS) og danne smalle rør-lignende strukturer i Liposom bindende undersøgelser6. Mens andre i marken har afsløret vigtige egenskaber af snx-barer ved hjælp af rekombinant renset snx-bar homodimers fra bakterier, toksicitet forbundet med at udtrykke snx-bar Heterodimere i lignende systemer har hindret deres indfødte karakterisering7,8,9,10. Derfor, uden et pålideligt system til at opnå ren rekombinant udtrykte indfødte Heterodimere, skal forskerne give afkald på disse linjer for undersøgelse. I figur 1præsenterer vi en fire-del arbejdsproces til 1) konstruere en gærstamme overudtrykker snx-bar Heterodimere for tandem affinitet rensning, 2) udtrykke og rense indfødte snx-bar Heterodimere, 3) forberede af syntetiske Liposomer, og 4) oprette en liposomtubulation eller sedimentations assay, der giver et vigtigt redskab for forskere til at undersøge det voksende katalog af sortering nexiner findes i naturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. gær stamme konstruktion
- Begynd med TVY614 (pep4Δ:: LEU2 Prb1Δ:: hisg prc1Δ:: HIS3)11 som den overordnede stamme. Denne stamme er mangelfuld for vakuolære proteaser, som bidrager til størstedelen af protein nedbrydning efter cellelyse, og derfor giver mulighed for en renere og mere effektiv rensning.
- Design primere12 og Integrer tandem affinitet rensning (TAP) tag ved C-endestation af Atg20 (snx-bar ORF 1) ved hjælp af homologe rekombination. Brug polymerasekæde reaktion (PCR) til at bekræfte integrationer (figur 2).
- Udfør en vestlig skamplet af celle lysat mod TAP tag for at bekræfte korrekt integration13.
Bemærk: Vi anbefaler høst 3 OD (1 OD ≈ 1 x 107 celler) af celler til SDS-side og Western blot verifikation. Bemærk, at integrationen af TAP-tagget skal ske, før de endogene initiativtagere udskiftes med GAL1-arrangøren for at give mulighed for lettere TAP-kode bekræftelse via Western blot. - Erstat endogene Snx4 (SNX-BAR ORF1) og Atg20 (SNX-BAR ORF 2)-initiativtagere med utagget GAL1-promotor ved hjælp af sekventielle homologe rekombinationog Transformations trin for hver enkelt ORF14.
- Brug ledsage primere uden for integrations stederne til PCR Bekræft vellykkede integrationer (figur 2). Dette vil resultere i en null fænotype af de målrettede SNX-BARs i fravær af galactose i vækstmediet.
2. gær induktion og SNX-BAR dimer rensning
Bemærk: Gærceller kan overføres på standard YPD (gærekstrakt, peptone og 2% glukose) agar plader, da ændringerne er kromosomalt integreret.
- Podning en stor vatpind af celler i 50 mL standard YP (gær ekstrakt og peptone) medium med 2% raffinose og 0,1% glucose som kulstofkilde i en kolbe mindst 4X mængden af kulturen og vokse natten over i 30 ° c shaker for at tillade korrekt beluftning. Forventer, at væksten i dette medium vil være langsommere i forhold til standard YPD.
- Næste morgen, brug 50 mL preculture til at inokulere i 1 L af standard YP medium med 2% raffinose og 0,1% glucose og vokse til 4-5 h i 30 °C shaker.
Bemærk: Den prækulturmængde, der anvendes til at inokulere 1 L kultur, kan justeres afhængigt af OD600 i prekulturen. OD600 af 1 L kultur efter inokulation bør være omkring 0,2 for at give mulighed for mindst to dobblings i løbet af 4-5 h vækst.- Brug en forbløffet Fernbach-kolbe til vækst for at tillade korrekt beluftning, en 2,8 L volumen kolbe er tilstrækkelig. Mindre beluftning kan resultere i langsommere vækst og mindre celle pellet ved høst.
- Kontroller OD600 for at sikre, at kulturen er i logfasen (0,5-1) efter 4-5 h vækst. Afhængigt af væksten af stammen, foretage justeringer af væksten tid til at give mulighed for mindst to doublings. Tilsæt 2% galactose og vokse natten over i 30 °C shaker.
Bemærk: OD600 efter natten vækst kan variere, men kulturen skal være mættet. Bemærk, at cellerne ikke behøver at blive fjernet fra 0,1% glucose før tilsætning af 2% galactose for denne vækst protokol. Vi anbefaler høst 3 OD af uinduceret og induceret celler på dette trin for SDS-PAGE og Western blot for verifikation (figur 3A, B, Lane 1-2). - Høst cellerne ved centrifugering ved 4500 x g i 15 min. Her kan du anvende en svingende skovl rotor, der rummer 1 L volumen kulturen.
- Overføre gærpellet til et 50 mL konisk rør; der kan udføres et andet Centrifugerings trin efter behov. Celle pellet vil normalt være ca. 10-15 mL i volumen målt ved graduerings markeringer og kan anvendes straks eller opbevares ved-80 °C.
- Resuspension pellet i 15 mL rensning buffer (50 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mm dithiothreitol (DTT), proteasehæmmer cocktail) at gøre den endelige volumen omkring 30 ml.
- Chill en homogenisator 4 °C før brug og ækvibrere det med rensning buffer. Lyse celler ved hjælp af en mekanisk celleforstyrrende stof eller homogenisator. Indlæs prøve i homogenisator og lysere ved 20000-25000 psi for 2-3 runder; Bemærk, at som celler bliver lysed, mere input tryk er nødvendig for at opretholde 20000-25000 PSI. Saml celle lysatet i et 50 mL konisk rør på is.
Bemærk: Hvis yderligere prøver skal lyseres, skal homogenisator rengøres grundigt og ækvibreres, før den næste prøve indlæses. Opbevar alle celle lysater på is. - Fjern straks celle lysatet ved 35.000 x g i 1 time ved 4 °c. Overfør forsigtigt supernatanten til nyt rør. Bemærk, at lipiderne fra celle lysis vil flyde til toppen under centrifugering og vil ikke påvirke rensning.
Bemærk: Vi anbefaler at gemme 0,5-1% af lysatet og pellet til SDS-side prøver. Der observeres typisk ingen større forskelle, og en yderligere vestlig skamplet kan gøres for at bekræfte TAP-proteinopløselighed (henholdsvisfigur 4, vognbane 1 og 2). - Ækvibrere 300 μL IgG sepharose perler med rense buffer. Tilsæt til det ryddede celle lysat og Inkuber i 2 timer, roterende ved 4 °C.
- Saml perler i en 10 mL kromatografikolonne og lad ubundet lysat flyde igennem.
- Vask perler med 10 mL vaskebuffer (50 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mm DTT), tilsætning af 1 ml ad gangen og gør det muligt at flyde helt igennem.
Bemærk: Vi anbefaler at gemme 2% af de bundne-IgG perler til SDS-side prøve. Typisk, vi observere fire store bands; to SNX-BAR proteiner og IgG tunge og lette kæder (figur 4, Lane 3). Vi anbefaler at spare tilsvarende mængder af ' eluat ' og ' IgG perler efter TEV ' for at sammenligne for TEV spaltning effektivitet. - Saml perler og overfør dem til et mikrocentrifuge glas. Tilsæt 500 μL total volumen med frisk vaskebuffer og 2 μL 10 mg/mL TEV proteasehæmmere og Inkuber natten over ved 4 °C.
- Næste morgen, Fjern supernatanten helt ved hjælp af en 27 G nål og Vurder protein renhed med 10% polyacrylamid SDS-side (figur 4, Lane 4).
Bemærk: Vi får typisk 500 μL 0,5-1 mg/mL 95% ren heterodimer (figur 4, Lane 4). Yderligere rensning ved hjælp af calmodulin harpiks kan også gøres, men vi typisk se en betydelig reduktion i udbyttet og anbefale at stoppe her, hvis renhed er > 90%. TEV forstyrrer ikke Liposom bindings assays, men TEV kan desuden fjernes ved hjælp af ni-NTA agantet perler15. - Til koncentratet overføres prøven til et 0,5 mL centrifugal filter med 10 KDa-udskæring og centrifugeres i henhold til producentens anvisninger til 50 μL eller derunder. Kvantificere de koncentrerede proteiner ved hjælp af Bradford protein assay. Opbevares ved 4 °C og anvendes inden for en uge.
3. liposome præparat
- Køb kommercielt tilgængelige lipider: Phosphatidylserin (PS), PI3P, ergosterol, og phosphatidylcholin (PC). Hvis det er nødvendigt, resuspension i anbefalede opløsningsmiddel til at gøre bestanden lipider.
Bemærk: Lipider opslæmninger i en methanol/chloroform blanding pr. producentens anbefalinger. Sørg for, at lipid bestande er klare og varmet til stuetemperatur før du bruger. Opslæmmede lipider kan opbevares under argon gas og forsegles med voks folie (eller tilsvarende) ved-20 °C i 6-12 måneder, eller indtil der observeres tab af aktivitet. - Beregn den mængde, der kræves af hver lipidbestand, for at skabe en blanding med den ønskede lipidsammensætning (Se tabel 1). Antag i alt 1 mole af lipider i lipid blandingen.
- Udfør dette trin i en kemisk røg hætte. Rengør glas sprøjter ved at tegne en hel sprøjte mængde chloroform og kassere den i en affaldsbeholder. Gentag to gange. Brug kun glas sprøjter eller pipetter, når du overfører chloroform. Når du udarbejder chloroform, træk proppen langsomt for at forhindre indslæbning af gasbobler i sprøjten.
- Brug glas sprøjter til at overføre lager lipider som beregnet til et rent glas kulturrør for at lave en endelig lipid-blanding af 1% PI3P, 20% ergosterol, 30% PS, PC (tabel 1). Afhængig af opløsningsmidler hver lipid er ophængt i, kan blandingen blive uklar ved tilsætning af hver lipid.
Bemærk: For at variere koncentrationerne af PS (0-30%), justeres volumener i overensstemmelse hermed og kompenseres med varierende PC (tabel 1). - Omhyggeligt tørre lipid blandingen ved hjælp af nitrogen gas rettet mod lipid blandingen i en cirkulær bevægelse til tørre lipider ensartet. Brug lav gasstrøm til at holde lipiderne i bunden af glasrøret under tørringsprocessen. Wrap glas kultur røret med folie, forlader åbningen afdækket, og yderligere dehydrat i vakuum for 1 h.
- Tilsæt 400 μL bindings buffer (50 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl2) for helt at dehydrere lipider for at lave en endelig Liposom koncentration på 2,5 mm.
Bemærk: Endelige Liposom koncentration kan justeres ved at tilføje mere eller mindre bindende buffer. For eksempel kan der tilsættes 200 μL bindings buffer for at producere en Liposom koncentration på 5 mM, hvis det er nødvendigt (se nedenfor).- Gensuspension af lipider ved at ryste på medium hastighed på en hvirvel ved stuetemperatur i 30 min. buffer skal fremstå uklar, da lipider er resuspenderet.
- Overfør opslæmmede Liposomer til et mikrocentrifuge glas. Fra dette punkt kan plastik pipettespidser anvendes, da lipider ikke længere resuspenderes i chloroform. Bemærk, at Liposom-opløsningen skal se uklar ud.
- Fryse-tø Liposomer syv til otte gange ved at nedsænke mikrocentrifuge røret først i flydende nitrogen, derefter i et 37 °C vandbad. Liposom blandingen skal fremstå helt frosset og fast i øjet før optøning.
- Udfør trin, der involverer chloroform i en kemisk røg hætte. Rengør to 1 mL glas sprøjter ved at trække og kassere hele sprøjte mængderne af chloroform, tre gange hver, for at fjerne eventuelle rester af lipiderne. Hver glassprøjte med ultrarent vand skal være ækvibreret ved at tegne to sprøjte volumener og derefter ækvibrere med bindings buffer ved at tegne to sprøjte volumener.
- Saml mini-ekstrudere i henhold til producentens anbefalinger. Equilibrate 1 200 Nm membran og to stykker filter understøtter (Se tabel over materialer) ved at nedsænke hver i bindings buffer.
- Sandwich membranen mellem filteret støtter og sted i mini-ekstruderne. For at reducere den døde volumen i den samlede mini-ekstrudering og for at sikre, at samlingen er lufttæt, skal du passere en bind buffer svarende til volumenet af Liposom blandingen gennem mini-ekstrudering ved hjælp af 1 mL glas sprøjter.
- Brug en af de 1 mL glas sprøjter, og træk lipoen-blandingen op. Vend mikrocentrifuge røret for at samle den sidste af Liposom blandingen i rørhætten for at trække i glassprøjten.
- Extrude Liposomer ved at passere gennem 200 Nm membranen 19-21 gange. Opsaml ekstruderede Liposomer i et nyt mikrocentrifuge glas.
Bemærk: Ekstruderede Liposomer bør synes mindre overskyet end Liposomer før ekstrforsion. Liposomer bør anvendes samme dag og opbevares på is. Den sidste ekstrudering bør placere Liposomer i sprøjten modsat den, den begyndte i.
4. SNX-BAR Liposome bindende og Tubulation
- Preclear renset protein ved 100.000 x g i en ultracentrifuge for 20 min ved 4 °c før udførelse Liposom bindende og sedimentering eksperimenter. Fjern supernatanten, og overfør den til et nyt mikrocentrifuge glas. Du må ikke forstyrre pellet, hvis der er en.
- For at udføre Liposom binding og tubulations assays, inkuberer du 4 μM renset Snx4-Atg20 og 2,5 mM Liposomer i en samlet reaktions volumen på 20 μL, varierende mængden af Liposomer tilsat.
Bemærk: I samme eksperiment bør det samme volumen af Liposomer anvendes. - Reaktionen inkubates ved 30 °C i 30 min.
Bemærk: Vi foreslår at maksimere mængden af 2,5 mM Liposomer føjet til hver reaktion ved at bruge ikke mindre end 10 μL Liposomer for at give mulighed for visualisering under sedimentering. Hvis der anvendes 10 μL 2,5 mM Liposomer i en reaktion på 20 μL, vil den endelige koncentration af Liposomer være 1,25 mM. Hvis de rensede proteiner fortyndes, og der kræves mere volumen for 4 μM protein, kan lipiderne resuspenderes i 200 μL under rehydrerings trinnet for at fordoble koncentrationen af Liposomer (Se trin 3,6); Dette vil dog kræve at kende proteinkoncentrationen forud for at gøre liposomerne. -
Visualisere og kvantificere Liposom tubulation.
- Behandl Liposom bindende reaktioner med det samme for elektronmikroskopi analyse. Spot prøver på et kulstof belagt kobber mesh gitter og negativ plet ved hjælp af 1% ammoniumuranylcarbonat acetat (figur 5B)16.
- Analysér prøver på et transmissions elektronmikroskop (200 kV).
- Brug billedanalyse software til at måle og kvantificere tubulær diameter. For nøjagtigt at kvantificere tubulær diameteren af en enkelt tubulus, skal der tages tre diameter målinger langs længden af en tubulus og gennemsnittet (figur 5B).
Bemærk: To-vejs analyse af variansen blev anvendt til at bestemme Statistisk signifikans (figur 5E). Uranyl acetat er både radioaktivt og giftigt. Korrekt laboratorie sikkerhedscertificering er påkrævet for at udføre dette trin.
-
Liposom binding og sedimentering.
- Reaktionen overføres (20 μL, fra trin 4,3) til et polycarbonat centrifugeglas, og der anvendes en kompatibel rotor til at spinne ved 100.000 x g i en ultracentrifuge i 20 min ved 4 °c. Fjern forsigtigt supernatanten og overfør den til et nyt mikrocentrifuge glas. Bemærk, at pellet skal forblive intakt.
- Resuspension af pellet i SDS-side 40 μL af prøve buffer og overførsel til et nyt mikrocentrifuge glas. Tilsæt 20 μL prøve buffer til supernatanten. Læg tilsvarende mængder pellet og supernatanten i en 10% polyacrylamid SDS-SIDERS gel, og Udfør Coomassie-farvning for at visualisere SNX-BARs, der er bundet til Liposomer (figur 5a).
- For at kvantificere mængden af SNX-BAR kompleks i pellet fraktionen, kvantificere bånd intensiteter ved hjælp densitometri og kvantificere andelen af SNX-BAR proteiner i pellet fraktion.
Bemærk: To-vejs analyse af variansen blev anvendt til at bestemme Statistisk signifikans (figur 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol beskriver en metode til reproducerbar og robust produktion af endogene gær SNX-søjle komplekser, der kan anvendes til downstream membran remodeling assays (figur 1). Opførelsen af gærstammen anvendes til rensning udnytter effektiviteten af homologe rekombination i spirende gær, giver mulighed for modifikationer på genomisk loci af de målrettede SNX-BARs (figur 2). Dette design har to fordele, (i) som udvælgelse er ikke påkrævet for at opretholde de ændringer, standard YP medium kan anvendes, giver mulighed for vækst til en højere celletæthed og dermed højere produktion af protein og (II) ekspression niveauer af de målrettede SNX-barer vil være endnu, optimering af produktionen af heterodimer kompleks. Forud for tilsætning af galactose, de målrettede SNX-BARs vil udvise en null fænotype og dermed kan resultere i en vækst defekt eller andre kendte defekter, der er specifikke for de målrettede SNX-BARs. Desuden er væksten i 2% raffinose og 0,1% glukose langsommere end vækst i 2% glukose. Derfor kan vækstperioden før galactose induktion kræve optimering for hver bestemt stamme. For at kontrollere, om der er korrekt induktion af SNX-BAR-ekspression, kræves der sandsynligvis en Western blot mod TAP-mærket, da protein niveauerne i SNX-barerne ikke kan påvises via Coomassie Stain (figur 3). Men da kun ét medlem af SNX-BAR-komplekset har et mærke, kan ekspression af ukodede proteiner ikke bekræftes, medmindre alle trin i rensningen er afsluttet. Efter rensning af SNX-BAR heterodimer, bør båndene af de to SNX-BARs synes at være i 1:1 stochiometrisk forhold, og der bør være lidt at ingen kontaminerende bands (figur 4, Lane 4). Hvis der er yderligere kontaminerende bånd, og start gærstammen allerede er proteasehæmmere-mangelfuld, kan flere proteasehæmmere tilsættes under celle lysis. Desuden kan der udføres et andet rensningstrin med calmodulin harpiks.
Ved udførelse af membran remodeling assays (figur 5), skal den samme præparat af Liposomer og rensede proteiner anvendes i samme eksperiment. Hvis flere oprensnings præparater af protein er nødvendige for at nå den ønskede koncentration, kombinere alle proteinet renset før udførelse eksperiment. Liposomer skal laves og anvendes inden for samme dag (tabel 1). Ved udførelse af Liposom sedimenterings analyser er det afgørende, at det oprensede protein er præclearet ved hjælp af de samme sedimenterings betingelser på 100.000 x g i 20 minutter umiddelbart før Inkuber med Liposomer, da fældet protein kan skævvride resultaterne. Desuden bør Liposom pellet forblive intakt efter sedimentering.
Figur 1: SNX-bar binding analyse flow chart. Kort sagt, i trin 1-2, ingeniør vi gal promotorer i to snx-bar genomisk loci, erstatter hver af de endogene promotorer og ingeniør en C-Terminal Tap tag i en af de to snx-bar loci. Næste, i trin 3-7, inducerer vi cellerne med galactose og renser SNX-BAR Heterodimere til homogenitet. I trin 8-12 beregner og forbereder vi af Liposomer. Endelig kan vi kombinere snx-bar Heterodimere med af Liposomer og udføre to assays; Trin 14a-16a involverer membran tubulation og 14b-16a involverer sedimenterings analysen. Se teksten for at få flere oplysninger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: integrationsstrategi for SNX-bar. To SNX-BAR loci var målrettet mod GAL udtryk ved hjælp af homologe rekombination. SNX-BAR ORF1 (Atg20) var desuden målrettet til at udtrykke en C-Terminal TAP tag. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: kontrol af galactose induktion. (A-B) For at verificere GAL induktion af Atg20-TAP, anbefaler vi en SDS-side og Western blot analyse af celleekstrakter induceret med 2% galactose (A, B, Lane 2) og uinduceret (A, B, Lane 1). (C) Western blot membran er også strippet og probed med anti-pgk1 for en lastning kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: eksempel rensning af Atg20-Snx4 Heterodimere. Gærceller konstrueret til at udtrykke Atg20-Tap og Snx4 drevet af galactose promotorer blev induceret med 2% galactose, lyseres og bundet ved hjælp af IgG sepharose, og elueret med TEV protease. Prøver fra hvert trin af rensning er vist i 10% SDS-side. Lane 1: induceret supernatanten af lysate. Lane 2: induceret pellet af lysate. Lane 3: prøve af bundne proteiner til IgG sepharose. Lane 4: TEV eluatet af Pure Atg20-Snx4 heterodimers fra IgG sepharose. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentativ Liposom binding og tubulations analyse. A) snx-bar Heterodimere, Atg20-Snx4 og Vps5-Vps17 fra gær, blev udtrykt, renset, og bundet til syntetiske Liposomer som beskrevet i tekst. Bemærk, at Mvp1 danner homodimers og blev udtrykt i bakterier. (B) EM mikrografer af Snx4-Atg20 Liposom tubulations analyse og tubulus målinger (inset). (C) snx-bar binding til varierende Liposom kompositioner blev kvantificeret ved densitometri. Graf indikerer middelværdi og standardfejl af middelværdien. * * p < 0,002. D) tubulære diametre blev kvantificeret og graferet som beskrevet i teksten. Scale bar = 200 Nm. Fejllinjer repræsenterer tovejs analyse af variansen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Typisk Liposome sammensætning | DOPC | DOPS | Ergosterol | PI3P-C16 |
| Mw | 786,1 | 810,0 | 396,7 | 957,0 |
| mol fraktion | 49% | 30 | 20 | 1 |
| Stock mM | 32,0 | 12,0 | 25,0 | 1,0 |
| Masse (mg) | 385,2 | 243,0 | 79,3 | 9,6 |
| Koncentration (mg/mL) | 25,2 | 9,7 | 9,9 | 1,0 |
| Volumen til RXN (mL) | 15,3 | 25,0 | 8,0 | 10,0 |
Tabel 1: Liposome opskrift. Syntetiske Liposomer blev fremstillet ved hjælp af en kombination af DOPC, DOPS, ergosterol, og PI3P. Vi beregner den endelige koncentration til 1 mol af lipid. Vores standardsammensætning omfatter 20% ergosterol, 1% PI3P, DOPS (op til 30%) og varierende mængder af DOPC. Tabel indeholder en typisk formulering for 400 μL af 30% DOPS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her demonstrerer vi en optimeret arbejdsgang for at rense SNX-BAR-dimere i gær og to assays for at evaluere deres biofysiske egenskaber på syntetiske Liposomer. Den største fordel i forhold til typisk rekombinant protein udtryk i Escherichia coli eller andre systemer er evnen til jævnt at udtrykke snx-bar proteiner i en indfødt vært, således at undgå toksicitet og inopløselighed spørgsmål fundet i RENSENDE Snx-barer i andre systemer. Det er også bemærkelsesværdigt, at vores system ikke kræver Molekylær kloning eller den husly af flere udtryk vektorer17. Vores dobbelte SNX-BAR gærstammer drives af kromosomalt konstruerede galactose-promotorer, hvilket sikrer et jævnt udtryk ved induktion. En vigtig overvejelse er, at i mangel af galactose, vil der være lidt at ingen udtryk for de målrettede SNX-BARs, hvilket resulterer i en null fænotype. Desuden finder vi, at SNX-BARs har tendens til at tolerere C-Terminal Tags godt, så vi kan tilføje TAP tag på C-Terminus. Men afhængigt af det protein, der mærkes, kan der også anvendes et N-terminal TAP-tag12. Desuden, da SNX-BARs kun form 1:1 dimers, kun ét protein er forpligtet til at blive mærket til rensning formål. Men nogle SNX-BARs, der normalt danner Heterodimere i cellen, har vist sig at danne homodimers under ikke-fysiologiske koncentrationer7. Derfor er det afgørende, at den støkiometriske ratio af de to SNX-BARs ved rensning af heterodimeren skal være 1:1, hvilket kan verificeres ved at køre en alikvot af det rensede kompleks på en SDS-side gel og udføre Coomassie farvning. Når de er konstrueret, kan disse gær stammer gemmes i al evighed som 15% (v/v) glycerol bestand ved-80 °C og/eller Derudover modificeret til at forespørge yderligere bindende partnere. Vores workflow tager typisk 2-3 uger for stamme byggeri og 3-4 dage for ekspression og rensning og 1 dag for Liposom bindende assays. Vi mener, at denne arbejdsgang kan hjælpe forskerne til yderligere at forstå lipidspecificiteten af snx-bar proteiner ved hjælp af indfødte bar proteiner på syntetiske Liposomer eller gigantiske af vesikler (guvs) og afsløre den præcise makeup af lipider er nødvendige for at drive membran Remodeling, og dermed afsløre deres virkningsmekanisme.
Kritiske trin
Under vores første forsøg på at rense SNX-BAR Heterodimere fra ikke-protease mangelfulde celler, vi ofte fundet reducerede udbytter og nedbrydningsprodukter. Derfor, under de indledende trin af stammen byggeri, vi mener, det er afgørende at begynde med en forældre gær stamme, der er mangelfuld for en eller flere af de store vakuolar proteinaser. Især fandt vi gær stamme TVY614, som er opbrugt for pep4, prb1, og prc1, at være den mest optimale. Ved hjælp af TVY614 stamme, vi rutinemæssigt opnå > 90% ren Snx4-Atg20 Heterodimere (figur 4 og figur 5A). Dog kan nødvendigheden af alle tre proteinaser, der skal ablateret være snx-bar kombination specifik. For eksempel, Vps5-Vps17 Heterodimere er blevet renset i ikke-protease mangelfulde stammer10 og da vi omfattede tilsætning af en PEP4 ablation, vi observere beskedne stigninger i udbytte og renhed (figur 5a). Derfor, afhængigt af brugerens downstream-applikationer og behovet for renhed eller valgbar markører, kan der være fleksibilitet ved udformningen af udtryks stammer.
Rækkefølgen af genbyggeri er også vigtig. Vi anbefaler C-terminalt Tryk på tagging SNX-BAR ORF 1 først for at bekræfte udtryk ved Western blot uden behov for galactose induktion (figur 1). Under induktion af galactose er det afgørende at pre-condition cellerne natten over i 2% raffinose og 0,1% glucose. Manglende pre-condition cellerne resulterer i ekstremt langsom vækst eller celledød. Men, det er også afgørende for cellerne til at nedbryder den resterende glukose i løbet af natten vækst, ellers galactose induktion kan påvirkes negativt. Det anbefales også at kontrollere flere isolater af Western blot at evaluere udtryk homogenitet af TAP Tagged SNX-BAR proteiner. Vi screener typisk 2-3 isolater og vælger den mest robust udtrykte kandidat.
Ændring, alternative tilgange og fremtidige anvendelser
I trin 2,8 kræver tandem-affinitet rensning (TAP) typisk en to-trins affinitets rensning ved hjælp af IgG-og calmodulin-perler efter TEV-kavalergang12. Men i denne protokol, vi elueres snx-bar dimerer ved TEV proteasehæmmere med meget høj udbytte og renhed. Vi finder efterfølgende affinitet rensning ved hjælp af calmodulin perler producerer inkonsekvente og reducerede udbytter, derfor anbefaler vi at stoppe efter TEV spaltning. TEV eluatet indeholdende SNX-BAR proteiner og hans (6)-mærkede TEV proteasehæmmere kan renses yderligere af ni-NTA agerede perler. Men vi finder også dette trin kan reducere samlede snx-bar proteinudbytte og er unødvendig, da TEV proteasehæmmere ikke forstyrrer Liposom bindende eller tubulation assays. Derfor, hvis de oprensede SNX-BARs vil blive brugt til enhver anden applikation, anbefaler vi, at brugeren vurdere virkningen af TEV proteasehæmmere i deres assays.
Hidtil har vi haft succes med at bruge denne protokol og de beskrevne modifikationer til at rense Snx4-Atg20 og Vps5-Vps17 Heterodimere i gær og har med succes vurderet deres lipid specificitet på syntetiske Liposomer. Men vi mener, at protokollen kan med succes tilpasses til nogen af de SNX-barer i gær. Det er også muligt at bruge systemet til at producere rekombinant SNX-BAR proteiner fra andre organismer. Dette ville dog kræve et yderligere trin af stammen konstruktion for at integrere en eksogen gen locus i gærgenomet. Vi mener også, at systemet kan udvides til at rense multimeriske komplekser, herunder last proteiner. Således mener vi vores ekspressionssystem kan strække sig ud over at forstå lipid specificerer af SNX-BARs. Fremtidige applikationer vil give forskerne mulighed for at rekonstruere hele lasten Capture komplekser på Liposomer at forstå, hvordan fuld forsamlinger kan påvirke membran remodeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under tildeling nummer GM060221 og til dels af National Institute of General Medical Sciences af de nationale institutter Sundhedstilstand under tildelings nummer T32GM007223. R.C. blev delvist støttet af UNC-Charlotte Fakultets Forskningstilskuds program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 G needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| Ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 μL/1 mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 °C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 |
References
- Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
- Zhang, H., et al. The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).
- Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
- Wang, J., et al. Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).
- Ma, M., et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion. Molecular Biology of the Cell. , (2018).
- van Weering, J. R., et al. Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules. The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).
- Chi, R. J., et al. Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1. The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).
- Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).
- Purushothaman, L. K., Ungermann, C. Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).
- Wurmser, A. E., Emr, S. D. Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).
- Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
- Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).
