Summary
Här presenterar vi ett arbetsflöde för uttrycket, rening och Liposom bindning av SNX-bar heterodimerer i jäst.
Abstract
SNX-BAR proteiner är en evolutionärt bevarad klass av membran remodeling proteiner som spelar nyckelroller i sortering och handel med protein och lipider under endocytos, sortering inom endosomalt system, och autofagi. Central till SNX-bar proteinfunktion är förmågan att bilda homodimers eller heterodimerer att binda membran med mycket bevarade phox-Homology (px) och bar (bin/amphiphysin/RVS) domäner. Dessutom kan oligomerisering av SNX-bar dimerer på membran framkalla bildandet av membran tubuli och blåsor och denna verksamhet tros återspegla deras funktioner som päls proteiner för endosome-härledda transport bärare. Forskare har länge utnyttjat in vitro-bindande studier med hjälp av rekombinanta SNX-bar proteiner på syntetiska liposomer eller Giant små blåsor (guvs) att avslöja den exakta makeup av lipider behövs för att driva membran remodeling, vilket avslöjar deras verkningsmekanism. Men på grund av tekniska utmaningar med dubbla uttrycks system, toxicitet av SNX-bar proteinuttryck i bakterier, och dålig löslighet av enskilda SNX-bar proteiner, de flesta studier hittills har undersökt SNX-bar homodimers, inklusive icke-fysiologiska dimerer som bildas under uttryck i bakterier. Nyligen har vi optimerat ett protokoll för att övervinna de stora bristerna i ett typiskt bakteriellt uttrycks system. Med hjälp av detta arbetsflöde, visar vi hur man framgångsrikt uttrycka och rena stora mängder SNX-bar heterodimerer och hur man rekonstituerar dem på syntetiska liposomer för bindning och tubulation assays.
Introduction
Membran-bundna organeller såsom plasmamembranet, endoplasmatiska reticulum, den Golgi apparaten, Lysosomen (jäst vacuole), och endosome utgör endomembrane systemet i eukaryotiska cellen. De flesta organeller har förmågan att kommunicera och utbyta material med andra organeller genom vesikel transport bärare. Hur cellen samordnar förpackningen och bildandet av vesikel transport bärare inom endomembrane systemet är inte väl förstått. Emellertid, de proteiner och lipider som utgör mycket av den endomembrane systemet är kända för att komma från internalisera rutt blåsor från plasmamembranet (PM). Den endosome är den primära acceptor organell för dessa vesikler och består av flera sammankopplade uppsättningar av rörformiga organeller. Den huvudsakliga funktionen av endosome är att underlätta näringsämne förvärv, reglera protein och lipid omsättning, skydda mot patogener infektion, och att fungera som den primära påfyllning källa av lipider för plasmamembranet. Eftersom endosome tar emot merparten av Last proteiner och lipider från plasmamembranet, fungerar den som ett sorteringsfack genom att isolera Cargos till rörformiga endosomala transport bärare (ETCs). Alla proteiner som inte binds in i ETCs är kvar att brytas ned via endo-lysosomalt system. Dysregleringen av Last sortering i ETCS kan leda till förlust av näringsupptag, protein omsättning eller lipidhomeostas, vilket resulterar i många metabola, utvecklingsmässiga och neurologiska störningar1,2. Trots en central roll för ETCs på endosome är den bakomliggande mekanismen för hur endosome selektivt kan samordna förpackningen av en mängd heterogena laster i rörformiga bärare inte känd.
Den sortering nexin (SNX) familjen är en evolutionärt bevarad klass av proteiner som har visat sig vara kritiska för många vesikel transport reaktioner i cellen3,4,5. Sortering nexins rekryteras till endosome membranet och stöd i Last fångst via deras karakteristiska phox homologi (px) domän, som binder fosfatidylinositol-3-monofosfat (ptdins (3) P), en lipid berikad på endosome membranet. Däggdjur koda 33 SNX proteiner, som kan delas upp ytterligare i flera underfamiljer, beroende på närvaron av andra domäner1. Framför allt är SNX-BAR under familj den största underfamiljen bestående av tolv i mänskliga, medan i spirande jäst, Saccharomyces cerevisiae, underfamiljen reduceras till bara sju SNX-barer. SNX-BAR proteiner har både en PX-domän och en bin-Amphiphysin-RVS (BAR) domän som utlöser lipid reservoarer för att binda positiva krökning membran. Följaktligen har SNX-BAR familjen en naturlig affinitet för endosome och kan medla ETC formation via deras membran remodeling förmågor. In vitro, den remodeling egenskaper SNX-barer kan induceras genom tillsats av renade SNX-barer till syntetiska liposomer och efterföljande bildandet av smala, belagda tubuli kan visualiseras genom elektronmikroskopi. Med hjälp av dessa metoder, forskare har fastställt att både oligomerisering koncentration och sammandragning styrka verkar variera bland SNX-bar familj tyder på att de kunde stöd i både bildandet och uppdelning av ETCS.
SNX-staplarna kan klassificeras ytterligare genom sina exklusiva Dimerization egenskaper. In vitro bindnings analyser och strukturella studier har visat att SNX-BAR-proteiner endast kan bilda specifika homodimers eller heterodimers. Därför i princip kan varje potentiell SNX-bar dimer-Oligomer ge en tubuli päls för en Last-specifik handel väg och likaså den begränsade oligomerisering av andra SNX-bar protomers, kan också definiera distinkta export vägar. Men på grund av det stora antalet SNX-barer och mångfald inom SNX familjen, en en sortering nexin-en Last hypotes är högst osannolikt. Istället en samordnad ansträngning med hjälp av en mängd faktorer såsom SNX-barer, Last, lipid specificitet och andra beroenden är mer sannolikt. Likaså avslöjade nyare studier av jästen SNX4 familj bevis för ytterligare lipid specificitet, bortom PtdIns (3) P, att potentiera endosome transport bärare6. I denna studie, SNX-bar homodimer Mvp1-Mvp1 renades från bakterier och infödda heterodimerer Snx4-Atg20 och Vps5-Vps17 uttrycktes och renas i hög avkastning från jäst, medan endast Snx4-Atg20 konstaterades att företrädesvis binda Fosfatidylserin (PS) och bilda smala rör-liknande strukturer i Liposom bindande studier6. Medan andra på fältet har avslöjat viktiga egenskaper SNX-barer med recombinantly renade SNX-bar homodimers från bakterier, toxicitet i samband med att uttrycka SNX-bar heterodimerer i liknande system har hindrat deras inhemska karakterisering7,8,9,10. Därför, utan ett tillförlitligt system för att få ren recombinantly uttryckt infödda heterodimers, forskare måste avstå från dessa linjer av utredning. I figur 1, presenterar vi en fyrdel arbetsflöde till 1) konstruera en jäst stam överuttrycker SNX-bar heterodimerer för tandem affinitetsrening, 2) uttrycka och rena infödda SNX-bar heterodimerer, 3) förbereda små syntetiska liposomer, och 4) inrätta en Liposom tubulation eller sänkor analys, vilket ger ett viktigt verktyg för forskare att undersöka den växande katalog av sortering nexins finns i naturen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. jäst stam konstruktion
- Börja med TVY614 (pep4Δ:: LEU2 Prb1Δ:: Hisg prc1Δ:: HIS3)11 som den överordnade stammen. Denna stam är bristfällig för vakuolär proteaser, som bidrar till majoriteten av proteinnedbrytning efter cell Lys, och därmed möjliggör en renare och effektivare rening.
- Design primers12 och integrera tandem Affinity rening (TAP) tag vid C-terminus av ATG20 (SNX-bar ORF 1) med homolog rekombination. Använd polymeraskedjereaktion (PCR) för att bekräfta integrationer (figur 2).
- Utför en västerländsk blot av cell lysate mot TAP-taggen för att bekräfta korrekt integration13.
Anmärkning: Vi rekommenderar skörd 3 OD (1 OD ≈ 1 x 107 celler) av celler för SDS-sida och Western blot kontroll. Observera att integrationen av TAP-taggen bör ske innan de endogena initiativtagarna ersätts med GAL1 promotorn för att möjliggöra enklare TAP-taggverifiering via Western blot. - Byt ut endogena Snx4 (SNX-BAR ORF1) och Atg20 (SNX-BAR ORF 2) med otaggade GAL1 promotor med sekventiell homolog rekombination och Transformation steg för varje enskild ORF14.
- Använd kompletterande primers utanför integration platser till PCR bekräfta lyckade integrationer (figur 2). Detta kommer att resultera i en null fenotyp av riktade SNX-barer i avsaknad av galaktos i odlingssubstrat.
2. jäst induktion och SNX-BAR dimer rening
Anmärkning: Jästceller kan spridas på standard YPD (jästextrakt, Peptone, och 2% glukos) agar plattor som modifieringarna är kromosomalt integrerade.
- Inokulera en stor Svabb av celler i 50 ml av standard YP (jästextrakt och Peptone) medium med 2% raffinos och 0,1% glukos som kol källa i en kolv minst 4x volymen av kulturen och växa över natten i 30 ° c Shaker för att möjliggöra ordentlig luftning. Förvänta sig att tillväxten i detta medium kommer att vara långsammare jämfört med standard YPD.
- Nästa morgon, Använd 50 ml preculture att Inokulera i 1 L standard YP-medium med 2% raffinos och 0,1% glukos och växa för 4-5 h i 30 ° c shaker.
Anmärkning: Volymen av preculture används för att Inokulera 1 L kultur kan justeras beroende på OD600 av preculture. OD600 av 1 L kulturen efter inympning bör vara runt 0,2 för att möjliggöra minst två dubbleringar under 4-5 h tillväxt.- Använd en förbryllad fernbach kolv för tillväxt för att möjliggöra en ordentlig luftning räcker en volym kolv på 2,8 L. Mindre luftning kan resultera i långsammare tillväxt och mindre cellpellet vid skörd.
- Kontrollera OD600 att se till att kulturen är i logg fasen (0.5-1) efter 4-5 h tillväxt. Beroende på tillväxten av stammen, göra justeringar av tillväxt tiden för att möjliggöra minst två doublings. Tillsätt till 2% galaktos och växa över natten i 30 ° c shaker.
Anmärkning: OD600 efter natt tillväxten kan variera, men kulturen bör vara mättad. Observera att celler inte behöver tas bort från 0,1% glukos före tillsats av 2% galaktos för detta tillväxt protokoll. Vi rekommenderar att man skördar 3 OD av icke inducerade och inducerade celler i detta steg för SDS-PAGE och Western blot för verifiering (figur 3A, B, Lane 1-2). - Skörd celler genom centrifugering vid 4500 x g för 15 min. En svängig skopa rotor som rymmer 1 L volym kulturen kan användas här.
- Överför jästpelleten till ett 50 mL koniskt rör; ett andra centrifugeringssteg kan utföras efter behov. Cellpelleten kommer i allmänhet att vara runt 10-15 mL i volym mätt med gradering och kan användas omedelbart eller lagras vid-80 ° c.
- Omsuspendera pelleten i 15 mL renings buffert (50 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mm Dithiothreitol (dTT), proteashämmare cocktail) för att göra den slutliga volymen runt 30 ml.
- Chill en homogenisator 4 ° c före användning och jämvikt det med rening buffert. Lyse celler med hjälp av en mekanisk cell disruptor eller Homogenisatorer. Ladda provet i Homogenisatorer och lyse på 20000-25000 PSI för 2-3 rundor; Observera att som celler blir lyserade, mer inmatnings tryck krävs för att upprätthålla 20000-25000 psi. Samla in cellen lysate i en 50 mL koniskt rör på is.
Anmärkning: Om ytterligare prover måste lyseras bör homogenisatorn rengöras grundligt och jämställas innan nästa prov laddas. Håll alla cell celllysat på is. - Omedelbart rensa cellen lysate på 35 000 x g för 1 h vid 4 ° c. Överför försiktigt supernatanten till nya röret. Observera att lipider från cell lysis flyter till toppen under centrifugering och kommer inte att påverka rening.
Anmärkning: Vi rekommenderar att du sparar 0,5-1% av lysate och pellet för prover SDS-PAGE. Typiskt, inga större skillnader observeras och en extra västerländsk blot kan göras för att bekräfta TAP protein löslighet (figur 4, körfält 1 och 2, respektive). - Equilibrate 300 μL av IgG sepharose pärlor med rening buffert. Lägg till den rensade cellen lysate och inkubera i 2 h, rotera vid 4 ° c.
- Samla pärlor i en 10 mL kromatografikolonn och Tillåt obunden lysat att flöda igenom.
- Tvätta pärlor med 10 mL tvättbuffert (50 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mm DTT), tillsätta 1 ml i taget och gör det möjligt att flöda igenom helt.
Anmärkning: Vi rekommenderar att du sparar 2% av de bundna IgG-pärlorna för provet SDS-PAGE. Typiskt, vi observerar fyra stora band; två SNX-BAR proteiner och IgG tunga och lätta kedjor (figur 4, Lane 3). Vi rekommenderar att du sparar motsvarande mängder "eluate" och "IgG-pärlor efter TEV" för att jämföra TEV-klyvning. - Samla pärlor och överföra dem till en microcentrifug röret. Tillsätt 500 μL total volym med färsk tvättbuffert och 2 μL 10 mg/mL TEV-proteas och inkubera över natten, rotera vid 4 ° c.
- Nästa morgon, ta bort supernatanten helt med en 27 G nål och bedöma protein renhet med 10% polyakrylamid SDS-sida (figur 4, Lane 4).
Anmärkning: Vi erhåller vanligtvis 500 μL av 0,5-1 mg/mL 95% ren heterodimer (figur 4, Lane 4). Ytterligare rening med hjälp av calmodulin harts kan också göras, men vi ser vanligtvis en betydande minskning av avkastningen och rekommenderar att stanna här om renhet är > 90%. TEV stör inte Liposom bindnings analyser, men TEV kan dessutom avlägsnas med hjälp av ni-NTA agaros pärlor15. - För att koncentrera, överföra provet till ett 0,5 mL centrifugalfilter med 10 KDa cutoff och centrifugera enligt tillverkarens anvisningar till 50 μL eller mindre. Kvantifiera de koncentrerade proteinerna med hjälp av Bradford protein assay. Förvaras vid 4 ° c och Använd inom en vecka.
3. Liposom förberedelse
- Köp kommersiellt tillgängliga lipider: Fosfatidylserin (PS), PI3P, ergosterol, och fosfatidylkolin (PC). Om det behövs, Omsuspendera i rekommenderat lösningsmedel för att göra lager lipider.
Anmärkning: Lipider återsuspenderas i en metanol/kloroformblandning enligt tillverkarens rekommendationer. Se till att lipidlagren är tydliga och värms till rumstemperatur innan du använder. Återsuspenderade lipider kan lagras under argon gas och förseglas med vax film (eller motsvarande) vid-20 ° c för 6-12 månader eller tills förlust av aktivitet observeras. - Beräkna den volym som krävs för varje lipidlager för att skapa en blandning med önskad lipidsammansättning (se tabell 1). Antag totalt 1 mol av lipider i lipidblandningen.
- Utför detta steg i ett kemiskt draghuv. Rengör glas sprutor genom att dra upp en full sprutvolym av kloroform och kasta den i en avfallsbehållare. Upprepa två gånger till. Använd endast glas sprutor eller pipetter vid överföring av kloroform. Vid utarbetandet av kloroform, dra på proppen långsamt för att förhindra införandet av gasbubblor i sprutan.
- Använd glas sprutor för att överföra lager lipider som beräknats i en ren glas kultur röret att göra en slutlig lipid blandning av 1% PI3P, 20% ergosterol, 30% PS, PC (tabell 1). Beroende på lösningsmedel varje lipid återsuspenderas i, blandningen kan vända grumlig vid tillsättning av varje lipid.
Anmärkning: För att variera koncentrationen av PS (0-30%), justera volymerna därefter och kompensera med varierande PC (tabell 1). - Torka försiktigt ner lipidblandningen med kvävgas riktad mot lipidblandningen i en cirkelrörelse för att torka lipider jämnt. Använd lågt gas flöde för att hålla lipiderna längst ner i glasröret under torkningsprocessen. Wrap glaset kultur röret med folie, lämnar öppningen avtäckt, och ytterligare torka i vakuum för 1 h.
- Tillsätt 400 μL bindningsbuffert (50 mM Tris pH 7,4, 300 mM NaCl, 1 mM MgCl2) för att helt Dehydrera lipider för att göra en slutlig Liposom koncentration på 2,5 mm.
Anmärkning: Den slutliga Liposom koncentrationen kan justeras genom att tillsätta mer eller mindre bindningsbuffert. Till exempel kan 200 μL bindningsbuffert tillsättas för att producera en liposomkoncentration på 5 mM vid behov (se nedan).- Omsuspendera lipider genom att skaka på medellång hastighet på en virvel vid rumstemperatur i 30 min. buffert bör vara grumlig som lipider är återavslutad.
- Överför resuspenderade liposomer till ett microcentrifugerör. Från denna punkt på, kan plastpipett tips användas som lipider inte längre återsuspenderas i kloroform. Observera att Liposom lösningen bör se grumlig.
- Frys-Tina liposomer sju till åtta gånger genom att dränka microcentrifug röret först i flytande kväve, sedan i en 37 ° c vattenbad. Den Liposom blandningen ska visas helt fryst och fast genom ögat innan upptinning.
- Utför åtgärder som involverar kloroform i ett kemiskt rök skydd. Rengör två 1 mL glas sprutor genom att dra upp och kasta hela sprutans volym av kloroform, tre gånger vardera, för att avlägsna eventuella rester av lipider. Jämvikt varje glasspruta med ultrarent vatten genom att upprätta två spruta volymer, sedan jämvikt med bindning buffert genom att upprätta två spruta volymer.
- Montera mini-extrudern enligt tillverkarens rekommendationer. Equilibrate 1 200 nm membran och två delar av filter stöder (se tabell över material) genom att dränka varje i bindning buffert.
- Sandwich membranet mellan filtret stöder och placera i mini-extrudern. För att minska dödvolymen i den monterade mini-extrudern och för att se till att monteringen är lufttät, passera en volym av bindande buffert jämförbar med volymen av Liposom blandningen genom mini-extruder med hjälp av 1 mL glas sprutor.
- Använd en av de 1 mL glas sprutor och dra upp Liposom blandningen. Invertera microcentrifugeröret för att samla den sista av liposomblandningen i röret locket för att dra upp i glaset sprutan.
- Extrudera liposomer genom att passera genom 200 nm membranet 19-21 gånger. Samla extruderade liposomer i nya en microcentrifug röret.
Anmärkning: Extruderade liposomer bör visas mindre molnigt än liposomer före extrudering. Liposomer bör användas samma dag och lagras på is. Den sista extrudering bör placera liposomer i sprutan motsatsen till en den började i.
4. SNX-BAR Liposom bindning och Tubulation
- Preclear renat protein vid 100 000 x g i en första för 20 min vid 4 ° c innan du utför Liposom bindning och sedimentering experiment. Ta bort supernatanten och överför den till ett nytt microcentrifugerör; stör inte pelleten om det finns en sådan.
- För att utföra Liposom bindning och tubulationstester, inkubera 4 μM renat Snx4-Atg20 och 2,5 mM liposomer i en total reaktions volym av 20 μL, varierande volymen av liposomer tillsätts.
Anmärkning: I samma experiment bör samma volym liposomer användas. - Inkubera reaktionen vid 30 ° c i 30 min.
Anmärkning: Vi föreslår att maximera mängden 2,5 mM liposomer läggas till varje reaktion genom att använda inte mindre än 10 μL liposomer för att möjliggöra visualisering under sedimentation. Om 10 μL 2,5 mM liposomer används i en 20 μL reaktion, kommer den slutliga koncentrationen av liposomer att vara 1,25 mM. Om de renade proteinerna späds ut och mer volym krävs för 4 μM protein, kan lipiderna återsuspenderas i 200 μL under rehydreringssteget för att fördubbla koncentrationen av liposomer (se steg 3,6); emellertid, detta kommer att kräva att känna till protein koncentrationen innan du gör liposomer. -
Visualisera och kvantifiera Liposom tubulation.
- Processen Liposom bindande reaktioner omedelbart för elektronmikroskopi analys. Spot prover på en kolbelagd koppar mesh rutnät och negativ fläck med 1% uranyl acetat (figur 5B)16.
- Analysera prover på ett transmissionselektronmikroskop (200 kV).
- Använd bildanalysprogram vara för att mäta och kvantifiera tubuli diameter. För att exakt kvantifiera tubuli diameter av en enda tubuli, ta tre diameter mätningar längs längden av en tubuli och genomsnitt (figur 5B).
Anmärkning: Tvåvägsanalys av variansen användes för att fastställa statistisk signifikans (figur 5E). Uranylacetat är både radioaktivt och giftigt. Korrekt labb säkerhetscertifiering krävs för att utföra det här steget.
-
Liposom bindning och sedimentation.
- Överför reaktionen (20 μl, från steg 4,3) till ett polykarbonatcentrifugrör och Använd en kompatibel rotor för att snurra på 100 000 x g i en första under 20 min vid 4 ° c. Ta försiktigt bort supernatanten och överför till nya microcentrifugeröret. Observera att pelleten ska vara intakt.
- Omsuspendera pelleten i SDS-PAGE 40 μL prov buffert och överför till ett nytt microcentrifugerör. Tillsätt 20 μL provbuffert till supernatanten. Fyll på motsvarande mängd pellets och supernatanten i en 10% polyakrylamid SDS-PAGE gel och utför Coomassie färgning för att visualisera SNX-staplar bundna till liposomer (figur 5a).
- För att kvantifiera mängden SNX-BAR-komplex i pelletfraktionen, kvantifiera bandintensitet med densitometri och kvantifiera andelen SNX-BAR-proteiner i pelletfraktionen.
Anmärkning: Två vägs analys av variansen användes för att fastställa statistisk signifikans (figur 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll beskriver en metod för reproducerbara och robust produktion av endogena jäst SNX-bar komplex som kan användas för nedströms membran remodeling analyser (figur 1). Byggandet av jäststammen som används för rening utnyttjar effektiviteten av homolog rekombination i spirande jäst, möjliggör ändringar på genomisk loci av riktade SNX-barer (figur 2). Denna design har två fördelar, (i) som valet inte krävs för att bibehålla ändringarna, standard YP medium kan användas, vilket möjliggör tillväxt till en högre cell densitet och därmed högre produktion av protein och (II) uttrycks nivåer av riktade SNX-barer kommer att bli ännu, optimera produktionen av heterodimer komplexa. Före tillsats av galaktos kommer de riktade SNX-BARs uppvisar en null fenotyp och därmed kan resultera i en tillväxtfel eller andra kända defekter som är specifika för de riktade SNX-barer. Dessutom är tillväxten i 2% raffinos och 0,1% glukos långsammare än tillväxt i 2% glukos. Därför kan tillväxtperioden före galaktose induktion kräva optimering för varje enskild stam. För att kontrollera korrekt induktion av SNX-BAR uttryck, en västerländsk blot mot kranen taggen är sannolikt krävs eftersom proteinnivåer av SNX-barer inte kan upptäckas via Coomassie fläck (figur 3). Men eftersom endast en medlem i SNX-BAR-komplexet har en tagg, kan uttrycket för det otaggade proteinet inte bekräftas om inte alla steg i reningen är slutförda. Efter rening av SNX-BAR heterodimer, bör banden mellan de två SNX-barer verkar vara i 1:1 stochiometric förhållande och det bör finnas lite eller ingen kontaminerande band (figur 4, Lane 4). Om det finns ytterligare kontaminerande band, och start jästen stam är redan proteas-bristfällig, mer proteashämmare kan tillsättas under cell lysis. Dessutom kan ett andra reningssteg med hjälp av calmodulinharts utföras.
När man utför membran remodeling analyser (figur 5), måste samma beredning av liposomer och renade proteiner användas i samma experiment. Om flera renings preparat av protein krävs för att nå den önskade koncentrationen, kombinera allt protein renas före genomföra experiment. Liposomer ska göras och användas inom samma dag (tabell 1). Vid utförandet av liposomsedimenteringstester är det viktigt att det renade proteinet är precleared med samma sedimenteringsbetingelser på 100 000 x g i 20 minuter omedelbart före inkuberingen med liposomer som utfällt protein kan skeva resultat. Dessutom bör den Liposom pelleten stanna intakt efter sedimentation.
Bild 1: SNX-bar bindnings analys flödesschema. Kortfattat, i steg 1-2, vi ingenjör gal initiativtagare till två SNX-bar genomisk loci, ersätter var och en av de endogena initiativtagarna och ingenjör en C-Terminal Tap tag i en av de två SNX-bar loci. Därefter, i steg 3-7, inducerar vi cellerna med galaktos och renar SNX-bar heterodimerer till homogenitet. I steg 8-12 beräknar vi och förbereder små liposomer. Slutligen kan vi kombinera SNX-bar heterodimerer med små liposomer och utföra två analyser; Steg 14a-16a involverar membran tubulation och 14b-16a involverar sedimenteringstest. Se text för mer information. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: SNX-bar integrationsstrategi. Två SNX-BAR loci var riktade för GAL uttryck med homolog rekombination. SNX-BAR ORF1 (Atg20) var dessutom riktad för att uttrycka en C-Terminal TAP tagg. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: verifiering av Galaktosininduktion. (a-B) För att kontrollera GAL induktion av Atg20-TAP, rekommenderar vi en SDS-sida och Western blot analys av cell extrakt induceras med 2% galaktos (A, B, Lane 2) och uninduced (A, B, Lane 1). (C) Western blot membran är också strippad och sonderade med anti-pgk1 för en lastning kontroll. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: exempel på rening av Atg20-Snx4 heterodimers. Jästceller konstruerade för att uttrycka Atg20-Tap och Snx4 som drivs av galaktos initiativtagare inducerades med 2% galaktos, lyserat och bunden med hjälp av IgG sepharose, och eluerade med TeV proteas. Prover från varje reningssteg visas i 10% SDS-PAGE. Lane 1: inducerad supernatanten av lysate. Lane 2: inducerad pellet av lysate. Lane 3: prov av bundna proteiner till IgG sepharose. Lane 4: TeV eluatet av ren Atg20-Snx4 heterodimerer från IgG sepharose. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativ Liposom bindning och tubulationstest. (A) SNX-bar heterodimers, Atg20-Snx4 och Vps5-Vps17 från jäst, uttrycktes, renas, och bunden till syntetiska liposomer som beskrivs i texten. Observera att Mvp1 bildar homodimers och uttrycktes i bakterier. B) EM-mikrografer av Snx4-Atg20 Liposom tubulationstest och tubulmätningar (infällda). (C) SNX-bar bindning till varierande Liposom kompositioner kvantifierades genom densitometri. Grafen indikerar medelvärde och standardfel för medelvärdet. * * p < 0,002. D tubuldiametrarna kvantifierades och diagram enligt beskrivningen i texten. Skala bar = 200 nm. Felstaplar representerar tvåvägsanalys av varians. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Typisk Liposom sammansättning | DOPC | DOP: er | Ergosterol | PI3P-C16 |
| Mw | 786,1 | 810,0 | 396,7 | 957,0 |
| mol fraktion | 49% | 30 | 20 | 1 |
| Stock mM | 32,0 | 12,0 | 25,0 | 1,0 |
| Massa (mg) | 385,2 | 243,0 | 79,3 | 9,6 |
| Koncentration (mg/mL) | 25,2 | 9,7 | 9,9 | 1,0 |
| Volym till RXN (mL) | 15,3 | 25,0 | 8,0 | 10,0 |
Tabell 1: Liposom recept. Syntetiska liposomer bereddes med hjälp av en kombination av DOPC, DOPS, ergosterol, och PI3P. Vi beräknar den slutliga koncentrationen till 1 mol av lipid. Vår standardsammansättning omfattar 20% ergosterol, 1% PI3P, DOPS (upp till 30%), och varierande mängder DOPC. Tabell innehåller en typisk formulering för 400 μL av 30% DOPS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här demonstrerar vi ett optimerat arbetsflöde för att rena SNX-bar dimerer i jäst och två analyser för att utvärdera deras biofysiska egenskaper på syntetiska liposomer. Den största fördelen jämfört med typiskt rekombinant proteinuttryck i Escherichia coli eller andra system är förmågan att jämnt uttrycka SNX-bar proteiner i en infödd värd, vilket undviker toxicitet och olöslighet problem som finns i renande SNX-barer i andra system. Det är också anmärkningsvärt att vårt system inte kräver molekylär kloning eller härborrning av flera uttryck vektorer17. Vår Dual SNX-BAR jäst stammar drivs av kromosomalt konstruerade galaktose initiativtagare, vilket garanterar även uttryck vid induktion. En viktig faktor är att i avsaknad av galaktos, kommer det att finnas liten eller ingen uttryck för riktade SNX-barer, vilket resulterar i en null fenotyp. Dessutom finner vi att SNX-barer tenderar att tolerera C-terminalen Taggar väl, vilket gör att vi kan lägga till TAP tag på C-Terminus. Men beroende på proteinet som taggas, kan en N-Terminal TAP tag också användas12. Dessutom, eftersom SNX-BARs endast bildar 1:1 dimers, endast ett protein krävs för att märkas för rening ändamål. Emellertid, vissa SNX-barer som normalt bildar heterodimerer i cellen har visat sig bilda homodimers under icke-fysiologiska koncentrationer7. Därför är det viktigt att vid rening av heterodimer, den stökiometriska förhållandet mellan de två SNX-barer bör vara 1:1, som kan verifieras genom att köra en alikvot av det renade komplexet på en SDS-PAGE gel och utför Coomassie färgning. När konstruerad, dessa jäststammar kan sparas i evighet som 15% (v/v) glycerol lager vid-80 ° c och/eller dessutom ändras för att fråga ytterligare bindande partners. Vårt arbetsflöde tar normalt 2-3 veckor för stam konstruktion och 3-4 dagar för uttryck och rening och 1 dag för Liposom bindande analyser. Vi tror att detta arbetsflöde kan hjälpa forskare att ytterligare förstå lipidspecificitet SNX-bar proteiner med hjälp av infödda bar proteiner på syntetiska liposomer eller Giant små blåsor (guvs) och avslöjar den exakta makeup av lipider behövs för att driva membran remodeling, vilket avslöjar deras verkningsmekanism.
Kritiska steg
Under våra första försök att rena SNX-bar heterodimerer från icke-proteas bristfällig celler, fann vi ofta minskade skördar och nedbrytningsprodukter. Därför, under de första stegen av stam konstruktion, vi tror att det är viktigt att börja med en förälder jäst stam som är bristfällig för en eller flera av de stora vakuolär proteinaser. I synnerhet fann vi jäst stam TVY614, som är utarmat för pep4, prb1, och prc1, att vara den mest optimala. Med hjälp av TVY614 stammen får vi rutinmässigt > 90% ren Snx4-Atg20 heterodimerer (figur 4 och figur 5A). Dock kan nödvändigheten för alla tre proteinaser som skall ableras vara SNX-BAR kombinationsspecifika. Till exempel, Vps5-Vps17 heterodimerer har framgångsrikt renats i icke-proteas bristfällig stammar10 och när vi inkluderade tillägg av en PEP4 ablation, vi observerar måttliga ökningar i avkastning och renhet (figur 5a). Därför, beroende på användarens underordnade program och behovet av renhet eller valbara markörer, kan det finnas flexibilitet när du utformar uttryck stammar.
Ordningen för gen konstruktion är också viktig. Vi rekommenderar C-terminally TAP taggning SNX-BAR ORF 1 första, för att bekräfta uttrycket av Western blot utan behov av galaktose induktion (figur 1). Under galaktosininduktion är det viktigt att förkonditionera cellerna över natten i 2% raffinos och 0,1% glukos. Underlåtenhet att pre-tillstånd cellerna resulterar i extremt långsam tillväxt eller celldöd. Emellertid, det är också viktigt för cellerna att tömma resterande glukos under natten tillväxt, annars galaktose induktion kan påverkas negativt. Det rekommenderas också att kontrollera flera isolat av Western blot att utvärdera uttryck homogenitet av kranen taggade SNX-BAR proteiner. Vi skärmen vanligtvis 2-3 isolat och plocka den mest robust uttrycker kandidat.
Modifiering, alternativa metoder och framtida tillämpningar
I steg 2,8 kräver tandem affinitet rening (TAP) vanligtvis en tvåstegs affinitetsrening med hjälp av IgG och calmodulin pärlor efter TEV klyvning12. Men i detta protokoll, vi eluera SNX-bar dimerer av TeV proteashämmare med mycket hög avkastning och renhet. Vi finner efterföljande affinitetsrening med hjälp av calmodulin pärlor ger inkonsekvent och minskad avkastning, så vi rekommenderar att stoppa efter TEV klyvning. Den TEV eluatet som innehåller SNX-BAR proteiner och hans (6)-märkta TEV proteashämmare kan ytterligare renas genom ni-NTA agaros pärlor. Emellertid, vi tycker också att detta steg kan minska övergripande SNX-BAR protein avkastning och är onödigt, eftersom TEV proteashämmare inte stör Liposom bindning eller tubulation assays. Därför, om de renade SNX-BARs kommer att användas för någon annan applikation, rekommenderar vi att användaren bedömer effekten av TEV proteashämmare i sina analyser.
Hittills har vi lyckats använda detta protokoll och de beskrivna modifieringarna för att rena Snx4-Atg20 och Vps5-Vps17 heterodimerer i jäst och har framgångsrikt bedömt deras lipidspecificitet på syntetiska liposomer. Men vi tror att protokollet kan framgångsrikt anpassas till någon av SNX-BARs i jäst. Det är också möjligt att använda systemet för att producera rekombinanta SNX-BAR proteiner från alla andra organismer. Detta skulle dock kräva ett ytterligare steg av stam konstruktion för att integrera en exogen gen Locus i jästgenomet. Vi tror också att systemet kan byggas ut för att rena multimeric komplex inklusive Last proteiner. Sålunda, vi tror att vårt uttrycks system kan sträcka sig bortom förstå Lipiden anger SNX-barer. Framtida tillämpningar kommer att göra det möjligt för forskare att rekonstruera hela Last fångst komplex på liposomer för att förstå hur full församlingar kan påverka membran remodeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Forskning som rapporterats i denna publikation stöddes av det nationella institutet för allmänna medicinska vetenskaper vid National Institutes of Health under tilldelning nummer GM060221 och delvis av det nationella institutet för allmänna medicinska vetenskaper av de nationella instituten Hälsotillstånd under tilldelnings nummer T32GM007223. RC stöddes delvis av UNC-Charlotte fakultetens forskningsstipendium program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm PC Membranes | Avanti | 610006 | |
| 10 mL Poly-Prep Chromatography column (Bio-Rad) | Bio-Rad | 731-1550 | |
| 27 G needle | BD Biosciences | 301629 | |
| Amicon Ultra Centrifugal Filter with 10K cutoff | Amicon | UFC501024 | |
| Avestin EmulsiFlex-C3 Homogenizer | Avestin | EF-C3 | |
| BCA assay | Pierce | 23225 | |
| Beckman Optima MAX-XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 393315 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | |
| DOPC | Avanti | 850375 | |
| DOPS | Avanti | 840035 | |
| Ergosterol (Sigma) | Sigma | 47130-U | |
| Extruder Set with Block 0.2 μL/1 mL | Avanti | 610000 | |
| FEI Tecnai F20 transmission electron microscope (200 kV) | |||
| Glass culture tubes | VWR | 47729-570 | |
| IgG sepharose beads (GE Healthcare) | GE Healthcare | 17-0969-01 | |
| Microlter glass syringes | Hamilton | 7637-01 | |
| New Brunswick Excella E25 | Eppendorf | M1353-0000 | or equivalent shaking 30 °C |
| Ni-NTA Magnetic Agarose Beads | Pierce | 78605 | |
| Optima XE-90 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94516 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-076 | |
| PI3P | Echelon | P-3016 | or Echelon equivalent |
| Polycarbonate bottle assembly | Beckman Coulter | 355622 | |
| TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Type 45 Ti Rotor | Beckman Coulter | ||
| Vacuum Desiccator, Bottom and Lid with Socket Valve | VWR | 75871-436 | |
| Vacuum Pump Alcatel (Pascal 2005 C1) | A&J Vacuum | PN07050 | |
| Vortex with foam holder | VWR | 10153-838 | |
| VWR KIT MICROTUBE | VWR | 12620-880 |
References
- Teasdale, R. D., Collins, B. M. Insights into the PX (phox-homology) domain and SNX (sorting nexin) protein families: structures, functions and roles in disease. The Biochemical Journal. 441 (1), 39-59 (2012).
- Zhang, H., et al. The Retromer Complex and Sorting Nexins in Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 79 (2018).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harbor perspectives in Biology. 6 (2), (2014).
- Chi, R. J., Harrison, M. S., Burd, C. G. Biogenesis of endosome-derived transport carriers. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (18), 3441-3455 (2015).
- Wang, J., et al. Endosomal receptor trafficking: Retromer and beyond. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (8), 578-590 (2018).
- Ma, M., et al. Lipid trafficking by yeast Snx4 family SNX-BAR proteins promotes autophagy and vacuole membrane fusion. Molecular Biology of the Cell. , (2018).
- van Weering, J. R., et al. Molecular basis for SNX-BAR-mediated assembly of distinct endosomal sorting tubules. The EMBO Journal. 31 (23), 4466-4480 (2012).
- Chi, R. J., et al. Fission of SNX-BAR-coated endosomal retrograde transport carriers is promoted by the dynamin-related protein Vps1. The Journal of Cell Biology. 204 (5), 793-806 (2014).
- Purushothaman, L. K., Arlt, H., Kuhlee, A., Raunser, S., Ungermann, C. Retromer-driven membrane tubulation separates endosomal recycling from Rab7/Ypt7-dependent fusion. Molecular Biology of the Cell. 28 (6), 783-791 (2017).
- Purushothaman, L. K., Ungermann, C. Cargo induces retromer-mediated membrane remodeling on membranes. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2709-2719 (2018).
- Wurmser, A. E., Emr, S. D. Phosphoinositide signaling and turnover: PtdIns(3)P, a regulator of membrane traffic, is transported to the vacuole and degraded by a process that requires lumenal vacuolar hydrolase activities. The EMBO journal. 17 (17), 4930-4942 (1998).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods in Molecular Biology. 498, 297-307 (2009).
- Zhang, L., et al. Morphology and structure of lipoproteins revealed by an optimized negative-staining protocol of electron microscopy. Journal of Lipid Research. 52 (1), 175-184 (2011).
- Yong, X., et al. Expression and purification of the SNX1/SNX6 complex. Protein Expression and Purification. 151, 93-98 (2018).
