Summary
Коллективная миграция клеток в развитии, заживлении ран и метастазах рака часто руководствуются градиентами факторов роста или сигнальными молекулами. Описана экспериментальная система, сочетающая в себе мастикную микроскопию с микрофлюидной системой и демонстрацию того, как количественно определить механику коллективной миграции под биохимическим градиентом.
Abstract
Клетки меняют модели миграции в ответ на химические раздражители, включая градиенты стимулов. Клеточная миграция в направлении химического градиента, известного как химиотаксис, играет важную роль в развитии, иммунном ответе, заживлении ран и метастазах рака. В то время как химиотаксис модулирует миграцию одиночных клеток, а также коллекции клеток in vivo, исследования in vitro сосредоточены на одноклеточных хемотаксисах, отчасти из-за отсутствия надлежащих экспериментальных инструментов. Чтобы заполнить этот пробел, описанный здесь является уникальной экспериментальной системой, которая сочетает в себе микрофлюиды и микропаттерны, чтобы продемонстрировать влияние химических градиентов на коллективную миграцию клеток. Кроме того, в систему включены масковая микроскопия и монослойная микроскопия стресса для характеристики изменений в клеточной силе как на субстрате, так и между соседними клетками. В качестве доказательства концепции, миграция микропаттернированных круговых островов Клетки собачьей почки Мадин-Дарби (MDCK) тестируется под градиентом фактора роста гепатоцитов (HGF), известного фактора рассеяния. Установлено, что клетки, расположенные вблизи более высокой концентрации HGF, мигрируют быстрее, чем клетки на острове клеток. На том же острове клеточная тяга схожа с обеих сторон, но межклеточный стресс значительно ниже на стороне более высокой концентрации HGF. Эта новая экспериментальная система может предоставить новые возможности для изучения механики химиотаксической миграции клеточных коллективов.
Introduction
Клеточная миграция в биологических системах является фундаментальным явлением, участвующим в формировании тканей, иммунный ответ, и заживление ран1,2,3. Клеточная миграция также является важным процессом при некоторых заболеваниях, таких как рак4. Клетки часто мигрируют как группа, а не индивидуально, что известно как коллективная миграция клеток4,5. Для клеток, чтобы двигаться коллективно, зондирование микросреды имеет важное значение6. Например, клетки воспринимают физико-химические стимулы и реагируют, изменяя подвижность, взаимодействие клеток и клеточные взаимодействия, что приводит к направленной миграции вдоль химического градиента7,8, 9,10. Основываясь на этой связи, быстрые достижения были сделаны в лаборатории на чип технологий, которые могут создавать хорошо контролируемые химические микросреды, такие как градиент химиоаттрактора11,12,13 . Хотя эти лаборатории-на-чип основе микрофлюиды ранее были использованы для изучения химиотаксиса клеточного ансамбля или клеточных сфероидов14,15,16,17, они были использованы в основном в контексте одноклеточной миграции18,19,20,21. Механизмы, лежащие в основе клеточного коллективного ответа на химический градиент, до сих пор не очень хорошо изучены14,22,23,24,25,26 . Таким образом, разработка платформы, позволяющей пространственно-временноконтролировать растворимые факторы, а также наблюдение за биофизическими клетками на месте поможет распутать механизмы коллективной миграции клеток.
Разработанная и описанная здесь многоканальная микрофлюидная система, которая позволяет образовывать градиент концентрации растворимых факторов, который модулирует миграцию узорчатых клеточных кластеров. В этом исследовании, гепатоцитов фактор роста (HGF) выбран для регулирования миграционного поведения Мадин-Дарби собачьих почек (MDCK) клеток. HGF, как известно, ослаблении целостности клеток и повышения подвижности клеток27,28. В микрофлюидной системе, Фурье трансформировать тяговой микроскопии и монослой стресс микроскопии также включены, что позволяет анализподвижности, контрактной силы и межклеточного напряжения индуцированных составных клеток в ответ на HGF Градиент. На том же острове клетки, расположенные вблизи более высокой концентрации HGF, мигрируют быстрее и показывают более низкие уровни межклеточного стресса, чем на стороне с более низкой концентрацией HGF. Полученные результаты свидетельствуют о том, что эта новая экспериментальная система подходит для изучения других вопросов в областях, связанных с коллективной клеточной миграцией под химическими градиентами различных растворимых факторов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Литография su-8 формы для трафаретов (толщина 250 мкм) и микроканальных частей (толщина 150 мкм), стеклянное травление (глубина 100 мкм), и литые изготовления были переданы на аутсорсинг путем отправки конструкций с помощью компьютерного программного обеспечения дизайна для производителей.
1. Изготовление полидиметилсилоксана (PDMS) трафарета и микроканала
- Дизайн микрошаблона трафарета и микроканала.
- Изготовить или аутсорсинг св-8 формы (толщина 250 мкм для трафаретов и 150 мкм для микроканалов) на кремниевых пластин (4 "диаметр).
- Подготовка PDMS смеси путем смешивания базы эластомер и лечебного агента в соотношении 10:1.
- Поместите 15 мл базового эластомера в коническую трубку 50 мл и добавьте 1,5 мл лечебного средства. Подготовьте два из них.
- Vortex смесь PDMS в течение 5 мин. Centrifuge смесь PDMS на 196 х г в течение 1 мин, чтобы удалить пузырьки.
- Чтобы изготовить трафарет PDMS, вылейте 1 мл смеси PDMS на вафельу, избегая при этом узорчатых областей СУ-8, чтобы PDMS касалась борта столбов СУ-8, но не верхней части модели СУ-8.
- Поместите вафельу на плоскую поверхность в течение более 30 минут при комнатной температуре (RT). Лечить PDMS в сухой духовке при температуре 80 градусов по Цельсию в течение более 2 ч.
- Тщательно снимите PDMS от формы SU-8 и обрезать тонкую мембрану PDMS с помощью 14 мм полого удара. Удалите пыль на поверхности частей PDMS с помощью липкой ленты и автоклавировать трафареты PDMS.
- Чтобы изготовить микроканал PDMS, залить 30 мл смеси PDMS на форму СУ-8.
- Дега в течение 30 минут в вакуумной камере и вылечить PDMS в сухой духовке при температуре 80 градусов по Цельсию в течение более 2 ч.
- Тщательно снимите PDMS от формы SU-8 и разрежьте PDMS до размера 24 мм х 24 мм. В каждом блоке PDMS создайте одну розетку и три выхода с помощью 1 мм биопсии.
2. Приготовление донного стекла с гелем полиакриламид (PA)
- Изготовление или аутсорсинг прямоугольных слайд-стекол (24 мм х 24 мм х 1 мм) с прямоугольной микроскважиной (6 мм х 12 мм, глубиной 100 мкм29)путем резки и травления стекол.
- Силанизировать поверхность нижнего стекла30.
- Подготовьте раствор связывания силана, смешивая 200 мл деионизированной воды (DIW), 80 л уксусной кислоты и 50 зл на 3-(триметоксизил) пропил-метакрилат (TMSPA) в течение 1 ч.
ВНИМАНИЕ: TMSPMA является горючей жидкостью. Следуйте рекомендациям в листах данных о материальной безопасности. Используйте только в химическом капоте дыма. - Удалите пыль с поверхности стекла липкой лентой и автоматически сняте стекло.
- Накройте выгравированную поверхность нижнего стекла 100 злителком раствора связывания и оставьте стекло на РТ на 1 ч.
- Промыть стекло с DIW 3x и дайте стеклу высохнуть при температуре окружающего воздуха или дует воздух.
- Подготовьте раствор связывания силана, смешивая 200 мл деионизированной воды (DIW), 80 л уксусной кислоты и 50 зл на 3-(триметоксизил) пропил-метакрилат (TMSPA) в течение 1 ч.
- Подготовка гель решение для PA гель31.
- Подготовьте свежий раствор 0,5 % (w/v) аммония persulfate (APS) путем растворения 5 мг APS в 1 мл DIW.
- Подготовьте раствор PA-геля, состоящий из 138 л из 40% раствора акриламида, 101 л 2% раствора бис-акриламида, 5 л раствора флуоресцентных частиц (0,2 мкм) и 655 л DIW.
ВНИМАНИЕ: Акриламид и бисакриламид растворы токсичны. Носите защитные перчатки, одежду и защиту глаз. Защитите раствор PA-геля, содержащий флуоресцентные частицы от света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Vortex флуоресцентный раствор шарика перед pipetting для того чтобы получить равномерное количество флуоресцентных шариков в партию. - После добавления 100 л раствора APS и 1 злтей тетраметилэтиленедиамиамин (TEMED), перенесите 10 зл смешанного раствора геля на прямоугольный микро-колодец и поместите сверху круговой крышкой (18 мм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы заполнить нижнее стекло с PA гель без пузырьков, поместите достаточное решение геля на паз нижнего стекла, тщательно слайд крышку над раствором геля и удалить любой избыток раствора геля.
ВНИМАНИЕ: Гель медленно вылечивается около 40 мин. Следующая процедура для центрифуги гелей должна быть проведена как можно скорее. - Переверните сборку пользовательского стекла, гель-раствора и крышки, затем центрифугу в течение 10 мин при 96 х г, чтобы принести флуоресцентные частицы в верхний слой PA gel.
- Снимите сборку с центрифуги и поместите ее на плоскую поверхность с обшивкой лицом вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с шага 2.3.6, ручка образцов в шкафу биобезопасности. - После 30 минут, переверните сборку и поместите его в 35 мм Петри блюдо, заполнить с 2 мл DIW, и (с помощью щипц) осторожно удалить крышку, сдвинув его в одну сторону.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лечебный гель PA может храниться в DIW в течение 1 месяца. Однако, как только коллаген покрыт на гель PA, он должен быть использован в эксперименте в течение 1 дня.
- Пальто коллагена на ГЕЛЬ PA.
- Растворите 1 мг/мЛ сульфосуччинимидиил 6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино) гексаноат (сульфо-САНПАХ) в теплом буфере HEPES 50 мм. Падение 200 л раствора на поверхность геля и активировать ультрафиолетовым светом (365 нм длина волны) в течение 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите сульфо-САНПАХ от света. - Промыть гель с 0,1 М 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазазетанетанесульфоновая кислота; БУФЕР HEPES 2x и с PBS 1x.
- Пальто PA гель с коллагеновым раствором (100 мкг/мл в PBS, крысиный хвост коллагена типа I) на 4 градуса Цельсия в одночасье. На следующий день, мыть с PBS 3x.
- Растворите 1 мг/мЛ сульфосуччинимидиил 6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино) гексаноат (сульфо-САНПАХ) в теплом буфере HEPES 50 мм. Падение 200 л раствора на поверхность геля и активировать ультрафиолетовым светом (365 нм длина волны) в течение 10 минут.
3. Микропаттернинг клеточных островов
- Подготовьте f-127(Таблица материалов)раствор (w/v) в PBS и погрузите автоматических трафарет PDMS в раствор F-127. Держите его в инкубаторе 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
- Подготовка клеточного раствора (2 х 106 клеток/мл) в средствах клеточной культуры, состоящей из: модифицированная среда Орла Dulbecco (DMEM) с 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS) и 1% антибиотико-антимикотических (AA).
- Вымойте трафарет PDMS с PBS 3x и удалить жидкость из трафарета PDMS и PA гель. Поместите трафарет PDMS на гель PA и добавьте PBS к трафарету.
- Удалите пузырьки в отверстиях трафарета PDMS, аккуратно протяните трубку. После удаления пузырьков, удалить PBS с поверхности трафарета PDMS.
- После ввода 200 зл клеточного раствора на трафарет PDMS, держать PA гель в инкубаторе в течение 1 ч так, чтобы клетки прикрепляются к PA гель.
- Аккуратно смойте сосмывайте клеточные растворы с помощью средств массовой информации клеточной культуры, удалите трафарет PDMS и добавьте больше носителей клеточной культуры. Проверьте образование клеточных островов под микроскопом.
4. Сборка геля PA с микроканалом PDMS
- Удалите пыль на микроканале PDMS с помощью липкой ленты, а затем автоклав.
- Обработайте поверхность микроканала PDMS кислородной плазмой (80 Вт, 50 кГц) на 30 с.
- После удаления любой жидкости на PA гель заполненные нижней стекла, место PDMS микроканал на верхней части нижнего стекла и положить сборку на пользовательских держатель стекла.
- Заполните микроканал средой клеточной культуры.
ВНИМАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы удалить все пузырьки, захваченных в каналах, мягко промывки теплых носителей с пипеткой. Кроме того, при удалении пузырьков, убедитесь, что не отсоединить микрошаблонированных клеточных островов.
5. Интегрированная микрофлюидная система
- Соедините трубки.
- Подготовка разъемов путем обрезки кончика иглы (18 G) и изгиб ат..90 ".
- Подготовьте трубные линии для трех входов и одной розетки.
- Для впускных труб соедините обрезанную иглу и линию мини-объемом 30 см с трехсторонним стоп-коном. Подготовьте три из них.
- Для аутлетовых труб соедините обрезанную иглу и линию мини-тома 75 см с трехсторонним стоп-коном. Подготовьте один из них.
- Заполните линии труб со средой, которая была разогрета в течение 1 ч.
ВНИМАНИЕ: Убедитесь в том, чтобы удалить все пузырьки, захваченные в трубах линий, мягко промывки теплых носителей со шприцем.
- Подготовьте резервуары, удалив поршень из шприцев и соединив линии впускных труб.
- Подключите иглы разъемы каждой линии труб в три входы и один выход микрофлюидного устройства.
- Заполните резервуары с 3 мл свежей средней или условной среды каждый.
- Для градиентного теста заполните левый впускной резервуар 20 нг/мл HGF в среде клеточной культуры.
- Для визуализации градиента концентрации добавьте флуоресцентный краситель 200 мкг/мл (родамин B-декект, 70 кДа) в левый впускной резервуар.
- Подключите линию розетки трубки к шприцу насоса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Режим работы шприца насоса является "вывод". Скорость потока изменяется в зависимости от емкости шприца и скорости работы шприца насоса.
- Поместите интегрированную микрофлюидную систему на стадию обычного эпифторного микроскопа.
ВНИМАНИЕ: Для создания щадящий градиент HGF в микрофлюидном канале скорость потока должна быть такой же медленной, как 0,1 л/мин. Это достаточно чувствительно, так что требует стабилизации в течение 2 ч, и необходимо проявлять осторожность, чтобы избежать физических нарушений во время эксперимента.
6. Приобретение изображений
- Сфотографировать каждые 10 минут до 24 ч с помощью автоматизированного микроскопа, размещенного в инкубаторе. В каждый момент времени, возьмите набор изображений с помощью 4x объектив в трех различных каналах, в том числе фазовое изображение для визуализации миграции клеток, зеленый флуоресцентное изображение, чтобы визуализировать флуоресцентные бусы, встроенные в PA гель, и красный флуоресцентное изображение, чтобы визуализировать градиент концентрации химического вещества.
- После принятия замедленного изображения, настоять 0,25% трипсин-EDTA раствор в микроканалы, чтобы отделить клетки от PA гель. После полного удаления клеток из геля, возьмите зеленое флуоресцентное изображение, чтобы использовать в качестве эталонного изображения для скопировки тяги.
7. Анализ данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Пользовательский код для анализа данных был разработан с помощью MATLAB, и детали были описаны в другом месте32,33,34,35,36.
- Для анализа фазовых изображений вычислите перемещения в двух последовательных фазовых изображениях с помощью велоциметрии изображения частиц36.
- Для Фурье трансформировать тяговую микроскопию сравните каждое зеленое флуоресцентное изображение с эталонным изображением и вычислите перемещения в каждом изображении с помощью велоциметрии изображения частиц36. Из перемещений, восстановить тяги, сделанные клетками на PA гель с помощью Fourier трансформировать трэктной микроскопии33,34,37.
- Из данных тяги, рассчитать стресс в монослой клеточного острова с помощью монослойной микроскопии стресса на основе методов конечного элемента32,34,38.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для изучения коллективной миграции под химическим градиентом, микрофлюидная система была интегрирована с масковой микроскопией(рисунок 1). Для построения интегрированной системы гель полиакриламид (PA) был отлит на специально вырезанном стекле, а клетки MDCK были посеяны в пределах микрошаблоньных островов, изготовленных трафаретом PDMS. Для этого эксперимента были созданы двенадцать островов клеток MDCK (четыре ряда на три колонны, диаметрю 700 мкм). После того, как клетки, прикрепленные к гелям PA, трафарет PDMS был удален, чтобы инициировать коллективную миграцию. Готовый микрофлюидный канал был помещен на верхней части гелей PA для создания микрофлюидного канала над клеточными островами(рисунок 1А).
Для установления градиента концентрации в микрофлюидном канале левый впуск был подключен к резервуару питания, содержащему раствор флуоресцентного красителя. Кроме того, средние и правые заливы были соединены с резервуарами снабжения, содержащими только носители. Затем розетка была подключена к шприц-насосу для удаления жидкости из микрофлюидного канала. Сэндвич из специально вырезанного стекла и микрофлюидный канал был вставлен на специально построенную сцену микроскопа. Образцы вместе с автоматизированным флуоресцентным микроскопом хранились в инкубаторе для визуализации живых клеток. На протяжении всех экспериментов, клетки были сохранены на 5% CO2 и 37 градусов по Цельсию. Градиент интенсивности флуоресцентного красителя был быстро установлен со скоростью потока 0,125 - 2 л/мин(рисунок 2А). Склон градиента зависел от скорости потока. Например, при скорости потока 0,125 л/мин градиент был разработан более чем на 1,5 мм, что является сопоставимым размером клеточных островов(рисунок 2B).
Затем было протестировано интегрированное устройство с ячейками. Острова клеток MDCK были микропаттернированы и собраны с микрофлюидным каналом, как описано выше. Во-первых, без применения какого-либо потока в микроканале, было обеспечено, что сотовый остров распространяется хорошо внутри устройства. В течение 12 ч остров расширился, и средняя скорость миграции составила 0,1-0,2 мкм/мин. Хотя между островами существуют различия в том, насколько остров расширился, все клетки выглядели здоровыми в состоянии без потока. Далее, поток был применен над этими островами, и было установлено, что при скорости потока 0,1 л/мин, клеточный остров широко распространился, и клетки поддерживали среднюю скорость миграции в размере 0,1-0,2 мкм/мин в течение 12 ч. Однако при увеличении скорости потока до 0,5 л/мин клетки не распространялись хорошо, а средняя скорость миграции снизилась до уровня ниже 0,1 мкм/мин. Кроме того, морфологии клеток появились разные и, как представляется, отделяется от ГЕЛи PA(Рисунок 3). На основе этих данных в качестве скорости потока для следующих экспериментов было выбрано 0,1 л/мин.
Для проверки влияния химического градиента на коллективную миграцию клеток, HGF был выбран32,34. Левая впускная бухта была соединена к 1) резервуару резервуара держащ средства культуры клетки с разрешением HGF (20 ng/mL) и 2) другие 2 входы с резервуарами держа средства культуры клетки. При скорости потока в 0,1 л/мин, поток над островами мигрирующих ячеек (четыре ряда на три колонны) был сохранен в течение 10 ч(рисунок 4). Как показано в отдельном эксперименте, концентрация HGF на левой колонке была близка к концентрации suppling раствора (20 нг/мл), а на правой колонке, это было близко к нулю. Концентрация HGF на средней колонке постепенно снижалась с левой половины до правой. При сравнении размеров клеточных островов после 10 ч, острова на правой колонне не сильно расширялись, но те, что на левой колонне, стали значительно больше и расширились во всех направлениях(рисунок 4А). Такие изменения в размерах острова были поддержаны траекториями клеток в пределах каждого острова(рисунок 4B). Интересно, что острова в средней колонне не расширялись вправо (где концентрация HGF была низкой), а преимущественно расширялись влево (где концентрация HGF была высокой). В то время как средняя скорость миграции в правой колонке практически не менялась, в левой и средней колонках средняя скорость миграции постепенно увеличивалась в течение первых 3 ч, а затем постепенно уменьшалась(рисунок 4С).
Для измерения сократительной силы и межклеточного стресса, масляная микроскопия37,39,40 и монослойная микроскопия стресса были объединены с микрофлюидным каналом33,35, 38. В течение 10 ч во время применения химического градиента, изображения флуоресцентных частиц были приняты в ГЕЛи PA, и сила (на единицу области), применяемой клетками на субстрате был проанализирован с помощью 4ier трансакционной микроскопии35, 37. Тяга была построена в полярных координатах. Синий цвет представляет собой силу к центру острова, а красный — силу вдали от центра.
В нулевое время все острова продемонстрировали одинаковое распределение тяги, с сильной внутренней тягой на краю и колебаниями внутри острова. Это колебание было похоже на то, что ранее было показано34,35,41. После 10 ч применения градиента HGF, в то время как степень расширения острова была разной в каждой колонке, распределение тяги было в значительной степени похоже на нулевое время(рисунок 5A). Средняя тяга не изменилась за 10 ч(рисунок 5С). При расчете монослойной нагрузки, однако, каждая колонка показала различные тенденции. В правой колонке (где концентрация HGF была низкой), среднее напряжение внутри островов сохранялось около 200 Па в течение 10 ч периода. В левой колонке (где концентрация HGF была высокой), среднее напряжение внутри островов постепенно снижалось с 230 Па до 100 Па более 10 ч, как ранее было показано32,34. В средней колонке (где концентрация HGF была высокой на левой половине и низко на правой половине острова), среднее напряжение было сохранено вокруг 150 Pa.
Рисунок 1: Схема интегрированной подготовки устройства. (A) Для изготовления интегрированного устройства, нижнее стекло с PA гель, на котором клетки острова были узорчатые с помощью трафарета PDMS был покрыт микроканалом PDMS. (B) Интегрированные устройства были исправлены с помощью пользовательского держателя для предотвращения утечки жидкости и диссоциации компонентов. (C) После того, как устройство заполнено жидкостью без пузырьков, резервуары были подключены к входам, и шприц насос был подключен к розетке. Все экспериментальные установки были помещены в систему визуализации живых клеток. (D) Схема показывает дизайн и состав микрофлюидных каналов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Установление cградиента. (A) Флуоресценция изображения родамина B-конъюгированный dextran (70 kDa) визуализировать градиент концентрации под потоком жидкости 0.125 л/мин, 0.5 л/мин, и 2 Л/мин. Усеянные круги указывают положение узорчатых островов клетки. (B) Профиль интенсивности флуоресценции изображения показывают, что градиент концентрации в устройстве был регулируется скоростью потока. Бары ошибок указывают на стандартное отклонение. Цветные полоски указывают на положение столбцов узорчатых клеток острова. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Миграция островов ячейки MDCK под потоком. ()Фазовые изображения на 12 ч острова ячейки MDCK при каждой скорости потока (0 л/мин, 0,1 л/мин, и 0,5 л/мин) показывают, что клеточные острова хорошо расширялись с низкой скоростью потока, но не расширялись с высокой скоростью потока. Пунктирные линии представляют границы на 0 ч. (B) Средняя и гистограмма клеточной скорости в пределах каждого острова каждые 10 минут на 12 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Миграция островов клетки MDCK под потоком и химическим градиентом. (A) Относительный диапазон интенсивности родамина B-конъюгированный dextran поддерживал постоянный градиент концентрации HGF в каждой колонке после стабилизации в течение 2 ч. (B) Фазовые изображения на 10 ч (пунктирная линия - граница острова ячейки на 0 ч) ячейки MDCK остров под градиентом HGF (слева направо: 20-0 нг/мл) показывает, что остров расширился больше, где концентрация HGF была выше. (C) Траектории путей миграции (цветовое кодирование указывает длину пути) ячеек на островах ячейки MDCK. Пунктирные линии и линии, разбитые, представляют границы каждого острова клеток на уровне 0 ч и 10 ч соответственно. (D) Средняя и гистограмма клеточной скорости в пределах каждого острова каждые 10 минут в течение 10 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Механические взаимодействия островов ячейки MDCK. (A) Карты тяги (взаимодействие ячейки-субстрата) на островах клетки на 0 h и 10 h под градиентом HGF. Карты были построены в радиальной координации, с внешней тягой с использованием теплого цвета и внутренней тяги с использованием холодного цвета. (B) Карты монослойного напряжения (взаимодействия клеток) на островах клетки на 0 h и 10 h под градиентом HGF. (C) Участок средней тяги (серый квадрат) и напряжения (синий круг) в пределах островов клетки под градиентом HGF над временем каждые 10 минут для 10 h. Цветовые полосы представляют среднеквартиль (25%-75%). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная фигура S1: Правильное распределение биса, необходимое для достаточного качества данных во время анализа силы тяги. Показаны примеры хороших (слева) и плохого (справа) качества флуоресцентных изображений из бисовой доски с увеличенными изображениями в белых коробках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Коллективная миграция составных клеток является важным процессом в процессе развития и регенерации, и мигрирующее направление часто руководствуется химическим градиентом факторов роста4,23. Во время коллективной миграции клетки продолжают взаимодействовать с соседними ячейками и лежащими в основе субстратами. Такие механические взаимодействия приводят к возникающим явлениям, таким как дуротаксис42,плитотаксис33и кенотаксис43. Однако, это исследование было выполнено с использованием одной концентрации факторов роста, таких как в сыворотке фетала крупного рогатого скота. Чтобы заполнить этот пробел, этот протокол описывает новую экспериментальную платформу, которая может измерять механические взаимодействия во время коллективной клеточной миграции под химическим градиентом.
Новая платформа сочетает в себе три экспериментальные системы, которые были широко использованы: микропаттернирование, масляная микроскопия и микрофлюиды. Во-первых, было проведено микропаттернирование клеточных островов для коллективной миграции. Во-вторых, для механических измерений мигрирующих клеток использовалась как магнитостроительная микроскопия, так и монослойная микроскопия. Наконец, для установления химического градиента по мигрирующим клеткам была использована платформа микрофлюиды. С помощью этой экспериментальной системы было продемонстрировано, что клетки на одном острове мигрируют по-разному в ответ на различные химические градиенты.
Как описано на рисунке 2,химический градиент образуется только на расстоянии 1 мм в середине микроканала. Острова в левой колонке подвергаются максимальной концентрации, а те, на правой колонке, подвергаются минимальной концентрации. В отличие от этого, острова в средней колонне подвергаются воздействию химического градиента. Таким образом, реакция клеточных островов измеряется по максимуму, минимуму и градиенту концентраций растворимого фактора в ходе одного и того же эксперимента. Используя этот массив клеточных островов, постепенное увеличение скорости клеточной миграции наблюдалось по мере увеличения концентрации HGF.
Для достижения высокого качества данных, Есть ключевые шаги в процедуре, которые требуют особого внимания. Гели PA в специальном стеклянном субстрате должны быть идеальными в отношении распределения флуоресцентных частиц и поверхностного покрытия коллагена. Это потому, что без высококачественных гелей PA, высококачественный набор данных для анализа тяги и монослойного анализа стресса не могут быть приобретены. Примеры высококачественных изображений бисины показаны на дополнительной рисунке 1. Микрофлюидические каналы очень малы, и пузыри легко в ловушке в них. Эти пузырьки не только нарушают поток, но также могут сметать клетки, если они начинают двигаться по течению. Поэтому очень важно заполнить микрофлюидные каналы без пузырьков. Для достижения стабильного градиента в микроканале очень важен баланс давления в трех бухтах. Чтобы избежать дисбаланса между ними, следует использовать крупные резервуары, чтобы можно было легко отрегулировать любые дисбалансы в начале эксперимента. Эта новая платформа поможет дальнейшее изучение механики коллективной миграции клеток под химическими градиентами, что является ключом к пониманию регенерации, метастазам рака и развитию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Грантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым корейским правительством (MSIP) (No. NRF-2017R1E1A1A1A01075103), Корейский университетский грант и программа BK 21 Plus. Он также был поддержан Национальными институтами здравоохранения (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL0071118, R01EY019696).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 1 M HEPES buffer solution | Gibco | 15630-056 | |
| 1 mm Biopsy punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| 100 mm petri dishes | SPL | 10100 | 100 mm diameter, 15 mm height |
| 14 mm hollow punch | ILJIN | 124-0571 | |
| 18 mm Ø Coverslip | Marienfeld-Superior | 111580 | Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| 2% bis-acrylamide solution | Bio-Rad | 1610142 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) | Sigma-Aldrich | 440159-500ML | |
| 3-way stopcock | Hyupsung | HS-T-61N | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 30 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-30 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 75 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-75 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| acetic acid | J.T. Baker | JT9508-03 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Bottom glass chip | MicroFIT | 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm) | |
| Collagen typeI, Rat tail | Corning | 354236 | |
| Custom glass holder | Han-Gug Mechatronics | custom-made | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Welgene | LM 001-11 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | w/o Magnesium, Calcium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| FluoSpheres amine-modified microspheres | Invitrogen | F8764 | 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515) |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Sigma-Aldrich | H1404-5UG | recombinant, human |
| JuLI stage live cell imaging system | NanoEnTek In | Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell | type II | ||
| Oxygen plasma system | Femto Science | CUTE-MPR | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| Rhodamine B isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | R9379-100MG | 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel |
| Steril hypodermic needle 18 G | KOVAX | Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line | |
| Sticky tape | 3M/Scotch | 810D | 33 m x 19 mm |
| SU-8 master molds | MicroFIT | 4” diameter, custom-made | |
| sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 | Store at -20°C. Store protected from moisture and light. |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS | |
| Syringe pump | Chemyx Inc. | model fusion 720 | withdraw fluid |
| Syringes | KOVAX | 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump | |
| tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| Ultraviolet (UV) lamp | UVP LLC | 95-0248-02 | 365 nm wavelength |
References
- Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. Cell migration: from tissue culture to embryos. Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6 (12), 1182-1190 (2005).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
- Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).
- DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
- Vogel, V. Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
- Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 543-549 (2013).
- Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
- Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. FASEB Journal. 20 (7), 811-827 (2006).
- Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays. Biophysical Journal. 101 (11), 2620-2628 (2011).
- Garcia, S., et al. Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device. Lab on a Chip. 15 (12), 2606-2614 (2015).
- Zhang, Z., et al. Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine. Small. 14 (42), 1703617 (2018).
- Ayuso, J. M., et al. Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device. PLoS ONE. 10 (10), 0139515 (2015).
- McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 679-688 (2016).
- Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).
- Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nature Biotechnology. 20 (8), 826-830 (2002).
- Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomedical Microdevices. 8 (2), 109-118 (2006).
- Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
- Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
- Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
- Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
- McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
- Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
- Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
- Farrell, J., et al. HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways. Journal of Proteome Research. 13 (6), 2874-2886 (2014).
- Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis. Molecular and Cellular Neuroscience. 48 (1), 38-50 (2011).
- Lin, Y. C., et al.
- Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
- Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
- Jang, H., et al. Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF. Lab on a Chip. 19 (9), 1579-1588 (2019).
- Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
- Jang, H., et al. Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer. Scientific Reports. 8, 45844 (2017).
- Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5 (6), 426 (2009).
- Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1254-1266 (2002).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS ONE. 8 (2), 55172 (2013).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 606-616 (2002).
- Notbohm, J., et al. Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion. Biophysical Journal. 110 (12), 2729-2738 (2016).
- Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
- Kim, J. H., et al. Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet. Nature Materials. 12 (9), 856-863 (2013).
