Kollektive celle migrasjon i utvikling, sår helbredelse, og kreft metastasering er ofte guidet av graderinger av vekstfaktorer eller signalering molekyler. Beskrevet her er et eksperimentelt system som kombinerer trekkraft mikroskopi med et mikrovæskebasert system og en demonstrasjon av hvordan å kvantifisere mekanikken i kollektiv migrasjon under biokjemiske gradient.
Celler endre migrasjon mønstre som svar på kjemiske stimuli, inkludert graderinger av stimuli. Cellular migrasjon i retning av en kjemisk gradient, kjent som chemotaxis, spiller en viktig rolle i utviklingen, immunforsvaret respons, sår helbredelse, og kreft metastasering. Mens chemotaxis modulerer migrering av enkeltceller, samt samlinger av celler in vivo, fokuserer in vitro forskning på enkelt celle chemotaxis, delvis på grunn av mangelen på riktig eksperimentelle verktøy. For å fylle dette gapet, beskrevet her er en unik eksperimentell system som kombinerer materialer og micropatterning å demonstrere virkningene av kjemiske graderinger på kollektiv celle migrasjon. Videre er trekkraft mikroskopi og monolag stress mikroskopi innlemmet i systemet for å karakterisere endringer i cellulær kraft på underlaget så vel som mellom naboceller. Som proof-of-konseptet, er migrasjon av micropatterned sirkulære øyer av Madin-Darby canine nyre (MDCK) celler testet under en gradient på hepatocytter vekstfaktor (HGF), en kjent spredning faktor. Det er funnet at celler som ligger i nærheten av høyere konsentrasjon av HGF migrere raskere enn de på motsatt side i en celle øy. Innenfor samme øy, er cellulær trekkraft lik på begge sider, men intercellulære stress er mye lavere på siden av høyere HGF konsentrasjon. Denne romanen eksperimentelle systemet kan gi nye muligheter til å studere mekanikken i chemotactic migrasjon av mobilnettet kollektiver.
Cellular migrasjon i biologiske systemer er et grunnleggende fenomen som er involvert i vevs dannelse, immunresponsen, og sår helbredelse1,2,3. Cellular migrasjon er også en viktig prosess i enkelte sykdommer som kreft4. Celler overføres ofte som en gruppe i stedet for enkeltvis, som kalles kollektiv celle migrering4,5. For celler til å flytte kollektivt, sensing av mikromiljøet er viktig6. For eksempel celler oppfatter fysikalsk stimuli og svare ved å endre motilitet, celle-substrat interaksjoner, og celle-celle interaksjoner, noe som resulterer i retningsbestemt migrasjon langs en kjemisk gradient7,8, 9,10. Basert på denne forbindelsen, har raske fremskritt blitt gjort i Lab-on-a-chip teknologier som kan skape godt kontrollerte kjemiske microenvironments som gradient av en chemoattractant11,12,13 . Stund disse laboratorium-opp på-en-flis-basert materialer ha tidligere blitt pleide studere chemotaxis av det cellular ensemble eller cellular spheroids14,15,16,17, de har vært brukt hovedsakelig i sammenheng med single-celle migrasjon18,19,20,21. Mekanismer underliggende en cellulær kollektiv reaksjon på en kjemisk gradient er fortsatt ikke godt forstått14,22,23,24,25,26 . Dermed vil utviklingen av en plattform som muliggjør spatiotemporal kontroll av løselige faktorer, samt in situ observasjon av cellenes Biofysiske, bidra til å avdekke mekanismene bak kollektiv celle migrasjon.
Utviklet og beskrevet her er et multi-ledet mikrovæskebasert system som muliggjør generering av en konsentrasjon gradient av oppløselige faktorer som modulerer migrasjon av mønstrede celle klynger. I denne studien er hepatocytter vekstfaktor (HGF) valgt til å regulere trekk atferden til Madin-Darby canine nyre (MDCK) celler. HGF er kjent for å dempe celle-celle integritet og forbedre motilitet av cellene27,28. I mikrovæskebasert systemet, Fourier Transform traction mikroskopi og monolag stress mikroskopi er også innarbeidet, som tillater analyse av motilitet, kontraktile kraft, og intercellulære spenning indusert av konstituerende celler som svar på en HGF Gradering. Innenfor samme øy, celler som ligger nær høyere konsentrasjon av HGF migrere raskere og vise lavere intercellulære stress nivåer enn de på siden med lavere HGF konsentrasjon. Resultatene tyder på at denne nye eksperimentelle systemet er egnet til å utforske andre spørsmål i felt som involverer kollektive cellulære migrasjon under kjemiske graderinger av ulike oppløselige faktorer.
Kollektiv migrasjon av konstituerende celler er en viktig prosess under utvikling og regenerering, og migrerer retningen er ofte guidet av kjemisk gradient av vekstfaktorer4,23. Under kollektiv migrasjon, celler holde samspill med nærliggende celler og underliggende underlag. Slike mekaniske interaksjoner gir opphav til emergent fenomener som durotaxis42, plithotaxis33, og kenotaxis43. Imidl…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Research Foundation of Korea (NRF) stipend finansiert av den koreanske regjeringen (MSIP) (nr. NRF-2017R1E1A1A01075103), Korea University Grant, og BK 21 Plus-programmet. Det ble også støttet av National Institutes of Health (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).
0.25% trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
1 M HEPES buffer solution | Gibco | 15630-056 | |
1 mm Biopsy punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
100 mm petri dishes | SPL | 10100 | 100 mm diameter, 15 mm height |
14 mm hollow punch | ILJIN | 124-0571 | |
18 mm Ø Coverslip | Marienfeld-Superior | 111580 | Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
2% bis-acrylamide solution | Bio-Rad | 1610142 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) | Sigma-Aldrich | 440159-500ML | |
3-way stopcock | Hyupsung | HS-T-61N | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
30 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-30 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
75 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-75 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
acetic acid | J.T. Baker | JT9508-03 | |
Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
Bottom glass chip | MicroFIT | 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm) | |
Collagen typeI, Rat tail | Corning | 354236 | |
Custom glass holder | Han-Gug Mechatronics | custom-made | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Welgene | LM 001-11 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | w/o Magnesium, Calcium |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
FluoSpheres amine-modified microspheres | Invitrogen | F8764 | 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515) |
Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Sigma-Aldrich | H1404-5UG | recombinant, human |
JuLI stage live cell imaging system | NanoEnTek In | Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2) | |
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell | type II | ||
Oxygen plasma system | Femto Science | CUTE-MPR | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
Rhodamine B isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | R9379-100MG | 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel |
Steril hypodermic needle 18 G | KOVAX | Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line | |
Sticky tape | 3M/Scotch | 810D | 33 m x 19 mm |
SU-8 master molds | MicroFIT | 4” diameter, custom-made | |
sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 | Store at -20°C. Store protected from moisture and light. |
Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS | |
Syringe pump | Chemyx Inc. | model fusion 720 | withdraw fluid |
Syringes | KOVAX | 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump | |
tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Ultraviolet (UV) lamp | UVP LLC | 95-0248-02 | 365 nm wavelength |