Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Traction mikroskopi integrert med materialer for chemotactic kollektiv migrasjon

doi: 10.3791/60415 Published: October 13, 2019

Summary

Kollektive celle migrasjon i utvikling, sår helbredelse, og kreft metastasering er ofte guidet av graderinger av vekstfaktorer eller signalering molekyler. Beskrevet her er et eksperimentelt system som kombinerer trekkraft mikroskopi med et mikrovæskebasert system og en demonstrasjon av hvordan å kvantifisere mekanikken i kollektiv migrasjon under biokjemiske gradient.

Abstract

Celler endre migrasjon mønstre som svar på kjemiske stimuli, inkludert graderinger av stimuli. Cellular migrasjon i retning av en kjemisk gradient, kjent som chemotaxis, spiller en viktig rolle i utviklingen, immunforsvaret respons, sår helbredelse, og kreft metastasering. Mens chemotaxis modulerer migrering av enkeltceller, samt samlinger av celler in vivo, fokuserer in vitro forskning på enkelt celle chemotaxis, delvis på grunn av mangelen på riktig eksperimentelle verktøy. For å fylle dette gapet, beskrevet her er en unik eksperimentell system som kombinerer materialer og micropatterning å demonstrere virkningene av kjemiske graderinger på kollektiv celle migrasjon. Videre er trekkraft mikroskopi og monolag stress mikroskopi innlemmet i systemet for å karakterisere endringer i cellulær kraft på underlaget så vel som mellom naboceller. Som proof-of-konseptet, er migrasjon av micropatterned sirkulære øyer av Madin-Darby canine nyre (MDCK) celler testet under en gradient på hepatocytter vekstfaktor (HGF), en kjent spredning faktor. Det er funnet at celler som ligger i nærheten av høyere konsentrasjon av HGF migrere raskere enn de på motsatt side i en celle øy. Innenfor samme øy, er cellulær trekkraft lik på begge sider, men intercellulære stress er mye lavere på siden av høyere HGF konsentrasjon. Denne romanen eksperimentelle systemet kan gi nye muligheter til å studere mekanikken i chemotactic migrasjon av mobilnettet kollektiver.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cellular migrasjon i biologiske systemer er et grunnleggende fenomen som er involvert i vevs dannelse, immunresponsen, og sår helbredelse1,2,3. Cellular migrasjon er også en viktig prosess i enkelte sykdommer som kreft4. Celler overføres ofte som en gruppe i stedet for enkeltvis, som kalles kollektiv celle migrering4,5. For celler til å flytte kollektivt, sensing av mikromiljøet er viktig6. For eksempel celler oppfatter fysikalsk stimuli og svare ved å endre motilitet, celle-substrat interaksjoner, og celle-celle interaksjoner, noe som resulterer i retningsbestemt migrasjon langs en kjemisk gradient7,8, 9,10. Basert på denne forbindelsen, har raske fremskritt blitt gjort i Lab-on-a-chip teknologier som kan skape godt kontrollerte kjemiske microenvironments som gradient av en chemoattractant11,12,13 . Stund disse laboratorium-opp på-en-flis-basert materialer ha tidligere blitt pleide studere chemotaxis av det cellular ensemble eller cellular spheroids14,15,16,17, de har vært brukt hovedsakelig i sammenheng med single-celle migrasjon18,19,20,21. Mekanismer underliggende en cellulær kollektiv reaksjon på en kjemisk gradient er fortsatt ikke godt forstått14,22,23,24,25,26 . Dermed vil utviklingen av en plattform som muliggjør spatiotemporal kontroll av løselige faktorer, samt in situ observasjon av cellenes Biofysiske, bidra til å avdekke mekanismene bak kollektiv celle migrasjon.

Utviklet og beskrevet her er et multi-ledet mikrovæskebasert system som muliggjør generering av en konsentrasjon gradient av oppløselige faktorer som modulerer migrasjon av mønstrede celle klynger. I denne studien er hepatocytter vekstfaktor (HGF) valgt til å regulere trekk atferden til Madin-Darby canine nyre (MDCK) celler. HGF er kjent for å dempe celle-celle integritet og forbedre motilitet av cellene27,28. I mikrovæskebasert systemet, Fourier Transform traction mikroskopi og monolag stress mikroskopi er også innarbeidet, som tillater analyse av motilitet, kontraktile kraft, og intercellulære spenning indusert av konstituerende celler som svar på en HGF Gradering. Innenfor samme øy, celler som ligger nær høyere konsentrasjon av HGF migrere raskere og vise lavere intercellulære stress nivåer enn de på siden med lavere HGF konsentrasjon. Resultatene tyder på at denne nye eksperimentelle systemet er egnet til å utforske andre spørsmål i felt som involverer kollektive cellulære migrasjon under kjemiske graderinger av ulike oppløselige faktorer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Merk: litografi av SU-8 muggsopp for sjablonger (tykkelse = 250 μm) og MicroChannel deler (tykkelse = 150 μm), glass etsing (dybde = 100 μm), og støpt fabrikasjon ble outsourcet ved å sende design ved hjelp av dataassistert designprogramvare til produsenter.

1. fabrikasjon av Polydimethylsiloxan (PDMS) sjablong og MicroChannel

  1. Design Micropattern av sjablongen og MicroChannel.
  2. Dikte eller outsource SU-8 muggsopp (tykkelse på ~ 250 μm for sjablonger og ~ 150 μm for microchannels) på silisium wafere (4 "diameter).
  3. Forbered PDMS blanding ved å blande basen elastomer og herding agent i et forhold på 10:1.
    1. Plasser 15 mL av basis elastomer i et 50 mL konisk rør og tilsett 1,5 mL herding middel. Forbered to av disse.
    2. Vortex PDMS blandingen i 5 min. sentrifuger PDMS-blandingen ved 196 x g for 1 min for å fjerne bobler.
  4. Å dikte PDMS sjablong, helle ~ 1 mL av PDMS blandingen på kjeks, samtidig unngå SU-8 mønstret regioner slik at PDMS berører siden av SU-8 søyler, men ikke toppen av SU-8 mønster.
    1. Plasser platen på et flatt underlag i over 30 minutter ved romtemperatur (RT). Cure PDMS i en tørr ovn ved 80 ° c i over 2 timer.
    2. Forsiktig skrelle av PDMS fra SU-8 mold og trim den tynne PDMS membranen ved hjelp av en 14 mm hul punch. Fjern støvet på overflaten av PDMS brikker ved hjelp av klebrig tape og autoklav PDMS sjablonger.
  5. Å dikte PDMS MicroChannel, helle ~ 30 mL PDMS blanding over SU-8 mold.
    1. Degas i 30 min i et vakuum kammer og kurere PDMS i en tørr ovn ved 80 ° c i over 2 timer.
    2. Forsiktig skrelle av PDMS fra SU-8 mold og skjær PDMS til en størrelse på 24 mm x 24 mm. I hver PDMS blokk, opprette en stikkontakt og tre viker med en 1 mm biopsi punch.

2. tilberedning av bunn glass med polyakrylamid (PA) gel

  1. Produksjon eller outsource rektangulære skyve briller (24 mm x 24 mm x 1 mm) med en rektangulær mikro-brønn (6 mm x 12 mm, 100 μm dybde29) ved å skjære og etsing briller.
  2. Silanize overflaten av et bunn glass30.
    1. Forbered en bind silan løsning ved å blande 200 mL deionisert vann (DIW), 80 μL av eddiksyre og 50 μL av 3-(trimethoxysilyl) propyl akrylat (TMSPMA) for 1 time.
      FORSIKTIG: TMSPMA er en brennbar væske. Følg anbefalingene i datablad for materialsikkerhet. Skal kun brukes i et kjemisk avtrekks deksel.
    2. Fjern støvet fra overflaten av glasset med klebrig tape og autoklav glasset.
    3. Dekk til etset overflate av bunnen glass med 100 μL av bind silan løsningen og la glasset på RT for 1 t.
    4. Skyll glasset med DIW 3x og la glasset tørke ved omgivelsesluft temperatur eller ved å blåse luft.
  3. Forbered en gel løsning for PA gel31.
    1. Forbered en ny løsning på 0,5% (w/v) ammonium persulfate (APS) ved å oppløse 5 mg APS i 1 mL DIW.
    2. Klargjør PA-gel-løsningen bestående av 138 μL av 40% akrylamid oppløsning, 101 μL av 2% BIS-akrylamid-oppløsning, 5 μL av fluorescerende partikkel oppløsning (0,2 μm) og 655 μL av DIW.
      FORSIKTIG: akrylamid og bisacrylamide løsninger er giftige. Bruk vernehansker, klær og vernebriller. Beskytt PA gel-løsningen som inneholder fluorescerende partikler fra lys.
      Merk: Vortex den fluorescerende perle løsningen før pipettering for å oppnå et ensartet antall fluorescerende perler per batch.
    3. Etter å ha lagt til 100 μL av APS-løsningen og 1 μL av tetrametyletylendiamin (TEMED), overfører du 10 μL av blandet gel-oppløsning på den rektangulære mikro-brønnen og plasserer på toppen av en sirkulær dekkglass (18 mm).
      Merk: for å fylle det nederste glasset med PA gel uten bobler, plasser tilstrekkelig gel løsning på sporet av bunnen glass, forsiktig Skyv dekkglass over gel løsning og Fjern eventuell overflødig gel løsning.
      FORSIKTIG: gelen er langsomt kurert i ca 40 min. Følgende prosedyre for sentrifugering gels bør utføres så snart som mulig.
    4. Vend monteringen av tilpasset glass, gel løsning, og dekkglass, deretter sentrifuger for 10 min på 96 x g for å bringe fluorescerende partikler til det øverste laget av pa gel.
    5. Fjern forsamlingen fra sentrifuge og plasser den på den flate overflaten med dekkglass vendt nedover.
      Merk: fra og med trinn 2.3.6 håndterer du prøvene i et biosafety kabinett.
    6. Etter 30 min, snu forsamlingen og legg den i en 35 mm Petri parabol, fyll med 2 mL DIW, og (ved hjelp av tang) forsiktig fjerne dekkglass ved å skyve den til den ene siden.
      Merk: herdet PA-gel kan oppbevares i DIW i 1 måned. Men når kollagen er belagt på PA gel, bør det brukes i et eksperiment innen 1 dag.
  4. Coat kollagen på PA gel.
    1. Oppløse 1 mg/mL sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2'-nitrophenylamino) hexanoate (sulfo-SANPAH) i varm 50 mM HEPES buffer. Slipp 200 μL av oppløsningen på gel overflaten og Aktiver av UV-lys (365 NM bølgelengde) i 10 min.
      Merk: Beskytt sulfo-SANPAH mot lys.
    2. Skyll gelen med 0,1 M [4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic yre; HEPES] buffer 2x og med PBS 1x.
    3. Coat PA gel med kollagen løsning (100 mikrogram/mL i PBS, rotte tail kollagen type I) ved 4 ° c over natten. Vask den påfølgende dagen med PBS 3x.

3. Micropatterning av celle øyer

  1. Klargjør F-127 (tabell med materialer) løsning [2% (w/v) i PBS] og senk den autoklaveres PDMS-sjablongen i F-127-løsningen. Oppbevar den på et 37 ° c inkubator for 1 time.
  2. Forbered celle løsning (2 x 106 celle/ml) i cellekultur medier bestående av: Dulbecco er modifisert Eagle ' s medium (DMEM) med 10% fosterets storfe serum (FBS) og 1% antibiotika-ANTIMYKOTISK (AA).
  3. Vask PDMS sjablongen med PBS 3x og fjerne væske fra både PDMS sjablongen og PA gel. Plasser PDMS sjablongen på PA gel og legge PBS til sjablongen.
  4. Fjern bobler i hullene på PDMS sjablong ved pipettering forsiktig. Etter fjerning av bobler, fjerne PBS fra overflaten av PDMS sjablongen.
  5. Etter å sette 200 μL av celle løsning på PDMS sjablong, holde PA gel i en inkubator for 1 h, slik at cellene festes til PA gel.
  6. Vask forsiktig av celle løsning med cellekultur medier, Fjern PDMS-sjablongen, og Legg til flere cellekultur medier. Sjekk dannelsen av celle øyer under et mikroskop.

4. montering av PA gel med PDMS MicroChannel

  1. Fjern støv på PDMS MicroChannel ved hjelp av klebrig tape, deretter autoklav.
  2. Unn overflaten av PDMS-MicroChannel med oksygen plasma (80 W, 50 kHz) for 30 s.
  3. Etter å ha fjernet noe væske på PA gel-fylte bunn glass, plasserer PDMS MicroChannel på toppen av bunnen glass og sette forsamlingen på tilpasset glass holderen.
  4. Fyll MicroChannel med cellekultur medium.
    FORSIKTIG: Pass på at du fjerner alle boblene som er fanget i kanalene, ved å skylle varme medier forsiktig med en pipette. Også, mens du fjerner bobler, pass på å ikke løsne micropatterned celle øyer.

5. integrert mikrovæskebasert system

  1. Koble til slanger.
    1. Forbered kontakter ved å trimme tuppen av nåler (18 G) og bøye den 90 °.
    2. Forbered slange linjer for tre innganger og en stikkontakt.
      1. For innløpsslange, koble trimmet nål og en 30 cm mini-volum linje med en tre-veis stopcock. Forbered tre av disse.
      2. For utløps slange, koble trimmet nål og en 75 cm mini-volum linje med en tre-veis stopcock. Forbered en av disse.
      3. Fyll slange linjene med mediet som er forvarmet til 1 time.
        FORSIKTIG: Pass på at du fjerner alle boblene som er fanget i slange linjene, ved å skylle varmt utskriftsmaterialet forsiktig med en sprøyte.
    3. Forbered reservoarer ved å fjerne stempler fra sprøyter og forbindelses slanger.
    4. Plugg nåle kontaktene på hver slange inn i tre innganger og ett utløp på den mikrovæskebasert enheten.
  2. Fyll reservoarene med 3 mL frisk medium eller betinget medium hver.
    1. For graderings testen fyller du venstre innløps reservoar med 20 ng/mL HGF i cellekultur mediet.
    2. For visualisering av konsentrasjon gradient, tilsett en 200 μg/mL fluorescerende fargestoff (rhodamine B-dextran, 70 kDa) til venstre innløps reservoar.
    3. Koble utløps slange linjen til en sprøyte pumpe.
      Merk: sprøyte pumpens driftsmodus er "tilbaketrekking". Strømningshastigheten endres i henhold til kapasiteten til sprøyten og driftshastigheten til sprøyte pumpen.
  3. Plasser det integrerte mikrovæskebasert systemet på scenen i et konvensjonelt epifluorescent mikroskop.
    FORSIKTIG: for å generere en mild gradering av HGF i mikrovæskebasert-kanalen, bør strømningshastigheten være så langsom som 0,1 μL/min. Dette er tilstrekkelig følsom, slik at det krever stabilisering for 2 t, og forsiktighet må tas for å unngå fysisk forstyrrelse under eksperimentet.

6. image oppkjøpet

  1. Ta bilder hver 10 min for opptil 24 h ved hjelp av en automatisert mikroskop plassert i en inkubator. På hver timepoint, ta et sett med bilder ved hjelp av en 4X objektiv linse i tre forskjellige kanaler, inkludert fase bildet for å visualisere celle migrasjon, grønt fluorescerende bilde for å visualisere fluorescerende perler innebygd i PA gel, og rødt fluorescerende bilde for å visualisere konsentrasjon gradient av en kjemisk.
  2. Etter å ha tatt tidsforløpbilder, sette mot 0,25% Trypsin-EDTA løsning i microchannels å løsne celler fra PA gel. Etter fullstendig fjerning av celler fra gelen, ta et grønt fluorescerende bilde som skal brukes som en referanse bilde for trekkraft mikroskopi.

7. data analyse

Merk: en egendefinert kode for dataanalyse ble utviklet ved hjelp av MATLAB, og detaljer har blitt beskrevet andre steder32,33,34,35,36.

  1. For fase bildeanalyse beregner du forskyvninger i to påfølgende fase bilder ved hjelp av partikkel bilde velocimetry36.
  2. For Fourier Transform trekkraft mikroskopi, sammenligne hver grønne fluorescerende bilde med referanse bildet og beregne forskyvninger i hvert bilde ved hjelp av partikkel bilde velocimetry36. Fra forskyvninger, gjenopprette trekkraft laget av celler på pa gel bruker Fourier Transform traction mikroskopi33,34,37.
  3. Fra traction data, beregne stress innenfor monolag av Cell Island bruker monolag stress mikroskopi basert på begrenset element metoder32,34,38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For å utforske kollektiv migrasjon under en kjemisk gradient, ble et mikrovæskebasert system integrert med trekkraft mikroskopi (figur 1). Å bygge det integrerte systemet, polyakrylamid (PA) gel ble støpt på tilpasset cut glass, og MDCK celler ble sådd innenfor micropatterned øyer laget av en PDMS sjablong. For dette eksperimentet ble tolv øyer av MDCK celler (fire rader av tre kolonner, diameter på ~ 700 μm) opprettet. Etter celler knyttet til PA gels, ble PDMS sjablongen fjernet for å initiere kollektiv migrering. Den pre-laget mikrovæskebasert kanalen ble plassert på toppen av PA gels å bygge mikrovæskebasert kanal over mobilnettet øyer (figur 1A).

Til da etablere en konsentrasjon gradient innenfor mikrovæskebasert kanalen, ble venstre innløpet koblet til forsynings reservoaret inneholder en fluorescerende fargestoff løsning. I tillegg var midt-og høyre innløp koblet til forsynings reservoarene som inneholdt bare medier. Deretter ble uttaket koblet til sprøyte pumpen for å fjerne væske fra den mikrovæskebasert kanalen. Den sandwich av tilpasset-cut glass og mikrovæskebasert kanalen ble satt inn på spesialbygde mikroskop scenen. Prøvene sammen med automatiserte fluorescerende mikroskop ble holdt i en inkubator for levende celle bilde. Gjennom eksperimentene ble celler holdt på 5% CO2 og 37 ° c. En gradient av intensiteten av fluorescerende fargestoff ble raskt etablert med en strømningshastighet på 0,125-2 μL/min (figur 2a). Skråningen av gradient avhengig av strømningshastigheten. For eksempel, ved en strømningshastighet på 0,125 μL/min, ble graderingen utviklet over 1,5 mm, som er den sammenlignbare størrelsen på celle øyene (figur 2B).

Deretter ble den integrerte enheten med celler testet. Øyene MDCK celler ble micropatterned og satt sammen med mikrovæskebasert kanalen som beskrevet ovenfor. Først, uten å påføre noen flyt i MicroChannel, ble det sørget for at mobilnettet øya spredte seg godt innenfor enheten. Over en 12 h periode, øya utvidet, og gjennomsnittlig migrasjon hastigheten var ~ 0.1-0.2 μm/min. Mens det var variasjoner blant øyene om hvor mye øya utvidet, så alle celler friske i no-flow tilstand. Deretter ble strømmen brukt over disse øyene, og det ble funnet at en strømningshastighet på 0,1 μL/min, mobilnettet øya spredte seg godt, og cellene opprettholdt en gjennomsnittlig migrasjon hastighet på ~ 0.1-0.2 μm/min for 12 h. Men ved å øke strømningshastigheten til 0,5 μL/min, celler ikke spre seg godt, og gjennomsnittlig migrasjon hastighet redusert til under 0,1 μm/min. Videre, morfologier av cellene dukket forskjellige og syntes å være frakobling fra PA gels (Figur 3). Basert på disse dataene ble 0,1 μL/min valgt som strømningshastighet for følgende eksperimenter.

For å teste virkningene av en kjemisk gradient på kollektive celle migrasjon, HGF ble valgt32,34.  Den venstre innløpet var koblet til 1) forsynings reservoaret Holding cellekultur Media med HGF løsning (20 ng/mL) og 2) de andre 2 viker med reservoarer holde cellekultur medier. Med en strømningshastighet på 0,1 μL/min, flyt over migrere celle øyene (fire rader med tre kolonner) ble opprettholdt i 10 h (Figur 4). Som vist i et eget eksperiment, var HGF-konsentrasjonen i venstre kolonne nær konsentrasjonen av supplerer-oppløsningen (20 ng/mL), og på høyre kolonne var dette nesten null. HGF-konsentrasjonen på den midterste søylen sank gradvis fra venstre halvdel til høyre halvdel. Når man sammenligner størrelsen på celle øyene etter 10 h, hadde øyene på høyre kolonne ikke utvide mye, men de på venstre kolonne ble betydelig større og utvidet i alle retninger (Figur 4A). Slike endringer i øya størrelse ble støttet av baner av celler innenfor hver øy (Figur 4B). Interessant, hadde øyene i den midterste kolonnen ikke utvide mot høyre (der HGF konsentrasjonen var lav), men utvidet fortrinnsvis mot venstre (der HGF konsentrasjonen var høy). Mens det var liten endring i gjennomsnittlig migrasjon hastighet i høyre kolonne, i venstre og midtre kolonne, gjennomsnittlig migrasjon hastigheten økt gradvis for de første 3 h, deretter gradvis redusert (Figur 4C).

For å måle kontraktile kraft og intercellulære stress, grep mikroskopi37,39,40 og monolag stress mikroskopi ble kombinert med mikrovæskebasert Channel33,35, i 38. I løpet av 10 h under påføring av den kjemiske gradient, bilder av fluorescerende partikler ble tatt i PA gels, og kraften (per enhet område) brukt av celler på underlaget ble analysert ved hjelp Fourier Transform traction mikroskopi35, i 37. Traction ble plottet i polare koordinater. Blå representerer kraften mot midten av øya, og rødt representerer kraften bort fra sentrum.

På tidspunktet null, alle øyene viste lignende trekkraft distribusjoner, med sterk innover trekkraft på kanten og svingninger i øya. Denne svingningene var lik det som tidligere var vist34,35,41. Etter 10 h for å anvende HGF gradient, mens graden av øya ekspansjon var forskjellig i hver kolonne, var trekkraft distribusjoner i stor grad lik tid null (figur 5A). Den gjennomsnittlige trekkraft ikke endres for 10 h (figur 5C). Ved beregning av monolag stress, derimot, viste hver kolonne ulike trender. I høyre kolonne (der HGF konsentrasjon var lav), gjennomsnittlig spenning innenfor øyene ble opprettholdt rundt 200 pa gjennom en 10 h periode. I venstre kolonne (der HGF konsentrasjon var høy), gjennomsnittlig spenning innenfor øyene gradvis redusert fra 230 pa til 100 pa over 10 h, som tidligere vist32,34. I den midterste kolonnen (der HGF-konsentrasjonen var høy på venstre halvdel og lavt på høyre halvdel av øya), ble den gjennomsnittlige spenningen opprettholdt rundt 150 pa.

Figure 1
Figur 1: skjematisk fremstilling av den integrerte enhets forberedelsen. (A) å dikte den integrerte enheten, en bunn glass med pa gel på hvilke celle øyer ble mønstret ved hjelp av en PDMS sjablong var dekket med en PDMS MicroChannel. (B) de integrerte enhetene ble fikset ved hjelp av en egendefinert holder for å hindre væskelekkasje og komponent dissosiasjon. (C) etter at enheten er fylt med væske uten bobler, var reservoarene koblet til innløp, og en sprøyte pumpe var koblet til uttaket. Alle eksperimentelle set-ups ble plassert på en live celle Imaging system. (D) skjematisk viser design og sammensetning av mikrovæskebasert kanaler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: etablering av chemical gradient. (A) fluorescens bilder av rhodamine B-bøyd dextran (70 KDA) visualisere konsentrasjonen gradient under væskestrømmen av 0,125 μL/min, 0,5 μL/min, og 2 μL/min. prikkete sirkler angir posisjonen til de mønstrede celle øyene. (B) intensiteten profilen av fluorescens bildet viser at konsentrasjonen gradient i enheten ble justerbar av strømningshastigheten. Feilfelt angir standardavvik. De fargede stolpene angir Kol onne plasseringene til den mønstrede celle øya. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: migrering av MDCK celle øyer underflyt. (A) fase bildene ved 12 h på MDCK celle øy ved hver strømningshastighet (0 μL/min, 0,1 μL/min, og 0,5 μL/min) viser at celle øyene ekspanderte godt ved en lav strømningshastighet, men ikke ekspanderte ved en høy strømningshastighet. Stiplede linjer representerer grensene på 0 h. (B) gjennomsnittet og histogrammet av mobilnettet hastighet innenfor hver øy hver 10 min for 12 h. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: migrasjon av MDCK celle øyer underflyt og kjemisk gradient. (A) den relative intensiteten utvalg av rhodamine B-bøyd dextran opprettholdt en konstant HGF konsentrasjon gradient i hver kolonne etter stabilisering for 2 h. (B) fase bilder ved 10 h (stiplet linje = Cell Island grensen på 0 h) av MDCK celle øya under HGF gradient (fra venstre til høyre: 20-0 ng/mL) viser at øya utvidet mer der HGF konsentrasjon var høyere. (C) baner av overføringsbaner (fargekoding angir banelengden) av celler i MDCK. Stiplede linjer og stiplede linjer representerer hver celle øyas grenser ved henholdsvis 0 h og 10 t. (D) Mean og histogram av mobilnettet hastighet innenfor hver øy hver 10 min for 10 h. please Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: mekaniske interaksjoner av MDCK celle øyer. (A) kartene av trekkraft (celle-substrat interaksjon) i cellen øyene ved 0 h og 10 h under HGF gradient. Kartene ble plottet i radial koordinering, med ytre trekkraft ved hjelp av varme farger og innover grep ved hjelp av kald farge. (B) kartene av monolag spenning (celle-celle interaksjoner) i cellen øyene ved 0 h og 10 h under HGF gradient. (C) tomten av gjennomsnittlig trekkraft (grå firkant) og spenning (blå sirkel) i cellen øyene under HGF gradient over tid hver 10 min for 10 timer. Fargebåndene representerer midten av kvartilen (~ 25% – 75%). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 1
Supplerende figur S1: riktig perle fordeling kreves for tilstrekkelig datakvalitet under traction Force analyse. Eksempler på god (venstre) og dårlig (høyre) kvalitet fluorescerende perle bilder med forstørrede bilder i de hvite boksene er vist. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kollektiv migrasjon av konstituerende celler er en viktig prosess under utvikling og regenerering, og migrerer retningen er ofte guidet av kjemisk gradient av vekstfaktorer4,23. Under kollektiv migrasjon, celler holde samspill med nærliggende celler og underliggende underlag. Slike mekaniske interaksjoner gir opphav til emergent fenomener som durotaxis42, plithotaxis33, og kenotaxis43. Imidlertid ble denne forskningen utført ved hjelp av en enkelt konsentrasjon av vekstfaktorer, slik som i Foster storfe serum. For å fylle gapet, beskriver denne protokollen en ny eksperimentell plattform som kan måle mekaniske interaksjoner under kollektive cellulære migrasjon under en kjemisk gradient.

Den nye plattformen kombinerer tre eksperimentelle systemer som har blitt brukt mye: micropatterning, traction mikroskopi, og materialer. Først ble micropatterning av celle øyer for kollektiv migrasjon utført. For det andre, både trekkraft mikroskopi og monolag stress mikroskopi ble brukt for mekaniske målinger av migrere celler. Til slutt ble en materialer plattform brukt til å etablere kjemisk gradient over migrere celler. Med dette eksperimentelle systemet, ble det demonstrert at celler innenfor en enkelt øy migrere forskjellig som svar på ulike kjemiske graderinger.

Som beskrevet i figur 2danner den kjemiske graderingen bare over en avstand på 1 mm i midten av MicroChannel. Øyer i venstre kolonne blir utsatt for maksimal konsentrasjon, og de på høyre kolonne er eksponert for minimum konsentrasjon. I kontrast er øyer i den midterste kolonnen eksponert for kjemisk gradient. På denne måten måles responsen fra celle øyene ved maksimum, minimum, og en gradering av konsentrasjoner av en oppløselig faktor under samme eksperiment. Ved hjelp av denne array av celle øyer, en gradvis økning i mobilnettet migrasjon hastighet ble observert som HGF konsentrasjon økt.

For å oppnå høykvalitets data, er det viktige trinn i prosedyren som krever spesiell oppmerksomhet. PA gels i en tilpasset glass substrat må være perfekt om fordelingen av fluorescerende partikler og overflatebelegg av kollagen. Dette er fordi uten høy kvalitet PA gels, et høykvalitets datasett for trekkraft analyse og monolag stress analyse kan ikke anskaffes. Eksempler på perle bilder av høy kvalitet vises i supplerende figur 1. De mikrovæskebasert kanalene er svært små, og bobler er lett fanget i dem. Disse boblene forstyrrer ikke bare flyten, men kan også feie celler bort hvis de begynner å bevege seg langs flyten. Derfor er det avgjørende å fylle mikrovæskebasert kanaler uten bobler. For å oppnå en stabil stigning i MicroChannel, er balansen av trykk innenfor de tre viker svært viktig. For å unngå ubalanse mellom dem, bør store reservoarer brukes slik at eventuelle ubalanser i begynnelsen av et eksperiment kan lett bli justert. Denne nye plattformen vil hjelpe videre utforskning av mekanikken i kollektiv celle migrasjon under kjemiske graderinger, som er nøkkelen til å forstå regenerering, kreft metastasering, og utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Research Foundation of Korea (NRF) stipend finansiert av den koreanske regjeringen (MSIP) (nr. NRF-2017R1E1A1A01075103), Korea University Grant, og BK 21 Plus-programmet. Det ble også støttet av National Institutes of Health (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
1 M HEPES buffer solution Gibco 15630-056
1 mm Biopsy punch Integra Miltex 33-31AA-P/25
100 mm petri dishes SPL 10100 100 mm diameter, 15 mm height
14 mm hollow punch ILJIN 124-0571
18 mm Ø Coverslip Marienfeld-Superior 111580 Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
2% bis-acrylamide solution Bio-Rad 1610142 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) Sigma-Aldrich 440159-500ML
3-way stopcock Hyupsung HS-T-61N CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
30 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-30 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
35 mm cell culture dish Corning 430165
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
75 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-75 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
acetic acid J.T. Baker JT9508-03
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad 1610700
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062
Bottom glass chip MicroFIT 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm)
Collagen typeI, Rat tail Corning 354236
Custom glass holder Han-Gug Mechatronics custom-made
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Welgene LM 001-11
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Biowest L0615-500 w/o Magnesium, Calcium
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140-179
FluoSpheres amine-modified microspheres Invitrogen F8764 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515)
Hepatocyte Growth Factor (HGF) Sigma-Aldrich H1404-5UG recombinant, human
JuLI stage live cell imaging system NanoEnTek In Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell type II
Oxygen plasma system Femto Science CUTE-MPR
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G
Rhodamine B isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich R9379-100MG 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel
Steril hypodermic needle 18 G KOVAX Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line
Sticky tape 3M/Scotch 810D 33 m x 19 mm
SU-8 master molds MicroFIT 4” diameter, custom-made
sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) Thermo Scientific 22589 Store at -20°C. Store protected from moisture and light.
Sylgard 184 Elastomer Kit Dow Corning PDMS
Syringe pump Chemyx Inc. model fusion 720 withdraw fluid
Syringes KOVAX 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump
tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Ultraviolet (UV) lamp UVP LLC 95-0248-02 365 nm wavelength

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. Cell migration: from tissue culture to embryos. Development. 141, (10), 1999-2013 (2014).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6, (12), 1182-1190 (2005).
  3. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2, (2), 329-333 (2007).
  4. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, (7), 445-457 (2009).
  5. Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, (2), 97-109 (2016).
  6. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12, (5), 308-319 (2011).
  7. Vogel, V. Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
  8. Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis. Current Opinion in Cell Biology. 25, (5), 543-549 (2013).
  9. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22, (1), 104-115 (2012).
  10. Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. FASEB Journal. 20, (7), 811-827 (2006).
  11. Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays. Biophysical Journal. 101, (11), 2620-2628 (2011).
  12. Garcia, S., et al. Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device. Lab on a Chip. 15, (12), 2606-2614 (2015).
  13. Zhang, Z., et al. Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine. Small. 14, (42), 1703617 (2018).
  14. Ayuso, J. M., et al. Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device. PLoS ONE. 10, (10), 0139515 (2015).
  15. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11, (1), 1-12 (2017).
  16. Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (6), 679-688 (2016).
  17. Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (2019).
  18. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nature Biotechnology. 20, (8), 826-830 (2002).
  19. Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomedical Microdevices. 8, (2), 109-118 (2006).
  20. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6, (3), 389-393 (2006).
  21. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35, (8), 2454-2461 (2014).
  22. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20, (1), 9-18 (2011).
  23. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17, (12), 575-579 (2007).
  24. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11, (1), 1-12 (2017).
  25. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20, (1), 9-18 (2011).
  26. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17, (12), 575-579 (2007).
  27. Farrell, J., et al. HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways. Journal of Proteome Research. 13, (6), 2874-2886 (2014).
  28. Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis. Molecular and Cellular Neuroscience. 48, (1), 38-50 (2011).
  29. Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear and Soft matter Physics. 82, 4 Pt 1 041918 (2010).
  30. Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
  31. Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8, (34), 21893-21902 (2016).
  32. Jang, H., et al. Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF. Lab on a Chip. 19, (9), 1579-1588 (2019).
  33. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10, (6), 469-475 (2011).
  34. Jang, H., et al. Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer. Scientific Reports. 8, 45844 (2017).
  35. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, (6), 426 (2009).
  36. Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283, (4), 1254-1266 (2002).
  37. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 282, (3), 595-605 (2002).
  38. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS ONE. 8, (2), 55172 (2013).
  39. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76, (4), 2307-2316 (1999).
  40. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282, (3), 606-616 (2002).
  41. Notbohm, J., et al. Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion. Biophysical Journal. 110, (12), 2729-2738 (2016).
  42. Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353, (6304), 1157-1161 (2016).
  43. Kim, J. H., et al. Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet. Nature Materials. 12, (9), 856-863 (2013).
Traction mikroskopi integrert med materialer for chemotactic kollektiv migrasjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jang, H., Kim, J., Shin, J. H., Fredberg, J. J., Park, C. Y., Park, Y. Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration. J. Vis. Exp. (152), e60415, doi:10.3791/60415 (2019).More

Jang, H., Kim, J., Shin, J. H., Fredberg, J. J., Park, C. Y., Park, Y. Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration. J. Vis. Exp. (152), e60415, doi:10.3791/60415 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter