Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Tractie microscopie geïntegreerd met microfluïdica voor Chemotactische collectieve migratie

Published: October 13, 2019 doi: 10.3791/60415
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 3, 1
1Department of Biomedical Sciences, Korea University, 2Department of Mechanical Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3Department of Environmental Health, Harvard T.H. Chan School of Public Health

Summary

Collectieve Celmigratie in ontwikkeling, wondgenezing en kanker metastasen wordt vaak geleid door de gradiënten van groeifactoren of signalering van moleculen. Hier beschreven is een experimenteel systeem dat tractie microscopie combineert met een microfluïdisch systeem en een demonstratie van het kwantificeren van de mechanica van collectieve migratie onder biochemische gradiënt.

Abstract

Cellen veranderen migratiepatronen in reactie op chemische stimuli, met inbegrip van de hellingen van de stimuli. Cellulaire migratie in de richting van een chemische gradiënt, bekend als chemotaxis, speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling, de immuunrespons, wondgenezing en kanker metastasen. Terwijl chemotaxis de migratie van enkelvoudige cellen en verzamelingen van cellen in vivo moduleert, is in vitro onderzoek gericht op eencellige chemotaxis, deels als gevolg van het ontbreken van de juiste experimentele gereedschappen. Om die kloof te dichten, hier beschreven, is een uniek experimenteel systeem dat microfluïdica en micropatterning combineert om de effecten van chemische gradiënten op collectieve Celmigratie aan te tonen. Bovendien worden tractie microscopie en monolaag stress microscopie in het systeem opgenomen om veranderingen in cellulaire kracht op het substraat en tussen naburige cellen te karakteriseren. Als proof-of-concept, de migratie van micro patroon circulaire eilanden van Madin-Darby Canine nier (MDCK) cellen wordt getest onder een gradiënt van hepatocyte groeifactor (HGF), een bekende verstrooiing factor. Het is gevonden dat cellen in de buurt van de hogere concentratie van HGF sneller migreren dan die aan de andere kant binnen een celeiland. Binnen hetzelfde eiland, cellulaire tractie is vergelijkbaar aan beide zijden, maar intercellulaire stress is veel lager aan de kant van hogere HGF concentratie. Dit nieuw experimentele systeem kan nieuwe mogelijkheden bieden om de mechanica van Chemotactische migratie door cellulaire collectieven te bestuderen.

Introduction

Cellulaire migratie in biologische systemen is een fundamenteel fenomeen betrokken bij weefselvorming, de immuunrespons, en wondgenezing1,2,3. Cellulaire migratie is ook een belangrijk proces in sommige ziekten zoals kanker4. Cellen migreren vaak als een groep in plaats van afzonderlijk, die bekend staat als collectieve cel migratie4,5. Voor cellen om collectief te bewegen, is de detectie van de micro-omgeving essentieel6. Cellen waarnemen bijvoorbeeld fysisch-chemische stimuli en reageren door veranderende beweeglijkheid, celsubstraat interacties en celcelinteracties, resulterend in directionele migratie langs een chemische gradiënt7,8, 9,10. Op basis van deze verbinding zijn er snelle ontwikkelingen gemaakt in lab-on-a-chip-technologieën die goed gecontroleerde chemische micro omgevingen kunnen creëren, zoals de gradiënt van een chemoaantretant11,12,13 . Hoewel deze Lab-op-een-chip-gebaseerde microfluïdica eerder zijn gebruikt om chemotaxis van het cellulaire Ensemble of cellulaire sferoïden14,15,16,17te bestuderen, zijn meestal gebruikt in de context van eencellige migratie18,19,20,21. Mechanismen die aan een cellulaire collectieve respons op een chemische gradiënt ten grondslag liggen, zijn nog steeds niet goed begrepen14,22,23,24,25,26 . Zo zal de ontwikkeling van een platform dat de spatiotemporele controle van oplosbare factoren mogelijk maakt, evenals in situ observatie van cellen biofysische, helpen om de mechanismen achter collectieve Celmigratie te ontrafelen.

Ontwikkeld en beschreven hier is een multi-channeled microfluïdisch systeem waarmee het genereren van een concentratie gradiënt van oplosbare factoren die de migratie van patroon celclusters moduleert. In deze studie wordt hepatocyte growth factor (HGF) gekozen om het migratie gedrag van Madin-Darby Canine nier (MDCK) cellen te reguleren. Hgf staat erom bekend dat de celcelintegriteit wordt verzwakt en de beweeglijkheid van cellen27,28wordt verbeterd. In het microfluïdische systeem worden ook Fourier-transformatie tractie microscopie en monolaag stress microscopie verwerkt, waardoor de beweeglijkheid, de contracactielkracht en de intercellulaire spanning geïnduceerd door samenstellende cellen in reactie op een hgf Verloop. Binnen hetzelfde eiland migreren cellen in de buurt van de hogere concentratie van HGF sneller en vertonen lagere intercellulaire stress niveaus dan die op de zijkant met lagere HGF-concentratie. De resultaten suggereren dat dit nieuwe experimentele systeem geschikt is om andere vragen te onderzoeken op gebieden met betrekking tot collectieve cellulaire migratie onder chemische gradiënten van verschillende oplosbare factoren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Opmerking: lithografie van SU-8 mallen voor stencils (dikte = 250 μm) en micro kanaal onderdelen (dikte = 150 μm), glas etsen (diepte = 100 μm), en gegoten fabricage werden uitbesteed door het verzenden van ontwerpen met behulp van computer-aided design software naar fabrikanten.

1. fabricage van Polydimethylsiloxaan (PDMS) stencil en Microchannel

  1. Ontwerp het micro patroon van stencil en micro kanaal.
  2. Fabriceren of uitbesteden SU-8 mallen (dikte van ~ 250 μm voor stencils en ~ 150 μm voor microkanalen) op silicium wafers (4 "diameter).
  3. Bereid het PDMS-mengsel door het basis elastomeer en het Uithardings middel te mengen in een verhouding van 10:1.
    1. Plaats 15 mL basis elastomeer in een conische buis van 50 mL en voeg 1,5 mL Uithardings middel toe. Bereid twee van deze.
    2. Vortex het PDMS mengsel gedurende 5 min. Centrifugeer het PDMS mengsel bij 196 x g gedurende 1 minuut om bubbels te verwijderen.
  4. Voor het fabriceren van PDMS stencil, giet ~ 1 mL van de PDMS mengsel op de wafer, terwijl het vermijden van SU-8 patroon regio's, zodat de PDMS raakt de zijkant van de SU-8 pilaren, maar niet de top van de SU-8 patroon.
    1. Plaats de wafer op een vlakke ondergrond gedurende meer dan 30 minuten bij kamertemperatuur (RT). Genees de PDM'S in een droge oven bij 80 °C gedurende meer dan 2 uur.
    2. Schil de PDM'S voorzichtig van de SU-8 mal en trim het dunne PDMS membraan met een 14 mm holle Punch. Verwijder het stof op het oppervlak van de PDMS stukken met behulp van plakband en autoclaaf de PDMS stencils.
  5. Voor het fabriceren van PDMS Micro Channel, giet ~ 30 mL PDMS mengsel over de SU-8 mal.
    1. Degas gedurende 30 min in een vacuümkamer en genezen de PDM'S in een droge oven bij 80 °C gedurende meer dan 2 uur.
    2. Schil de PDM'S voorzichtig van de SU-8 mal en snijd de PDM'S op een grootte van 24 mm x 24 mm. Maak in elk blok van de PDMS één uitlaat en drie inlaten met een 1 mm biopsie Punch.

2. bereiding van het bodem glas met gel van polyacrylamide (PA)

  1. Vervaardiging of uitbesteden rechthoekige glij bril (24 mm x 24 mm x 1 mm) met een rechthoekige micro-put (6 mm x 12 mm, 100 μm diepte29) door snijden en etsen van glazen.
  2. Silanize het oppervlak van een bodem glas30.
    1. Bereid een BIND silaan oplossing door het mengen van 200 mL gedeïoniseerd water (DIW), 80 μL azijnzuur en 50 μL 3-(trimethoxysilyl) Propylmethacrylaat (TMSPMA) voor 1 uur.
      Let op: TMSPMA is een brandbare vloeistof. Volg de aanbevelingen in materiaalveiligheidsinformatiebladen. Alleen gebruiken in een chemische rook afzuigkap.
    2. Verwijder het stof van het oppervlak van het glas door plakband en autoclaaf het glas.
    3. Bedek het geëtste oppervlak van het bodem glas met 100 μL van de BIND silaan oplossing en laat het glas bij RT gedurende 1 uur.
    4. Spoel het glas af met DIW 3x en laat het glas drogen bij de omgevingslucht temperatuur of door lucht te blazen.
  3. Bereid een geloplossing voor de PA gel31.
    1. Bereid een nieuwe oplossing van 0,5% (w/v) ammonium persulfate (APS) door het oplossen van 5 mg APS in 1 mL DIW.
    2. Bereid de PA-gel oplossing uit 138 μL van 40% acrylamideoplossing, 101 μL van 2% bis-acrylamide oplossing, 5 μL fluorescerende deeltjes oplossing (0,2 μm) en 655 μL DIW.
      Let op: acrylamide en bisacrylamide oplossingen zijn giftig. Draag beschermende handschoenen, kleding en oogbescherming. Bescherm de PA-gel oplossing met fluorescerende deeltjes tegen licht.
      Opmerking: Vortex de fluorescerende kraal oplossing voor pipetteren om een uniform aantal fluorescerende kralen per partij te verkrijgen.
    3. Na toevoeging van 100 μL van de APS-oplossing en 1 μL tetramethylethyleendiamine (TEMED), breng 10 μL gemengde geloplossing over op de rechthoekige micro-put en leg bovenop een ronde dekslip (18 mm).
      Let op: om het onderste glas te vullen met PA-gel zonder bubbels, plaats voldoende gel-oplossing op de groef van het onderste glas, schuif de afdekplaat voorzichtig over de geloplossing en verwijder eventuele overtollige geloplossing.
      Let op: de gel wordt langzaam genezen gedurende ongeveer 40 min. De volgende procedure voor het centrifugeren van gels moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd.
    4. Draai de samenstelling van het aangepaste glas, de gel-oplossing en de afdekplaat om en Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 96 x g om fluorescerende deeltjes naar de bovenste laag van PA-gel te brengen.
    5. Verwijder de montage van de centrifuge en plaats deze op het vlakke oppervlak met de afdek zijde naar beneden.
      Opmerking: begin met stap 2.3.6, behandel samples in een bioveiligheid Cabinet.
    6. Na 30 min, draai de assemblage en plaats het in een 35 mm Petri schaaltje, vul met 2 mL DIW, en (met behulp van de Tang) voorzichtig verwijderen van de dekslip door te schuiven naar één kant.
      Opmerking: uitgeharde PA-gel kan gedurende 1 maand in DIW worden opgeslagen. Echter, zodra collageen is gecoat op de PA gel, het moet worden gebruikt in een experiment binnen 1 dag.
  4. Coat collageen op de PA gel.
    1. Los 1 mg/mL sulfosuccinimidyl 6-(4 '-azido-2'-nitrofenylamino) hexanoaat (sulfo-SANPAH) op in warme 50 mM HEPES-buffer. Druppel 200 μL van de oplossing op het geloppervlak en Activeer deze met UV-licht (365 nm golflengte) gedurende 10 min.
      Opmerking: Bescherm de sulfo-SANPAH tegen licht.
    2. Spoel de gel af met 0,1 M [4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonzuur; HEPES] buffer 2x en met PBS 1x.
    3. Mantel de PA-gel met collageen oplossing (100 μg/mL in PBS, rat tail collageen type I) bij 4 °C 's nachts. Was de volgende dag met PBS 3x.

3. micropatterning van de celeilanden

  1. Bereid F-127 (Inhoudsopgave) oplossing [2% (w/v) in PBS] en dompel de geautoclaveerd PDMS stencil in de F-127-oplossing. Bewaar het in een incubator van 37 °C voor 1 uur.
  2. Bereid de celoplossing voor (2 x 106 cellen/ml) in celkweek media bestaande uit: dulbecco's gemodificeerde eagle's medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibioticum-antimycotic (AA).
  3. Was de PDMS stencil met PBS 3x en verwijder de vloeistof uit de PDMS stencil en PA gel. Plaats de PDMS stencil op de PA gel en voeg PBS toe aan het stencil.
  4. Verwijder bubbels in de gaten van PDMS stencil door zachtjes te pipetteren. Verwijder, na het verwijderen van bubbels, PBS uit het oppervlak van de PDMS stencil.
  5. Na het plaatsen van 200 μL celoplossing op PDMS stencil, houd de PA gel in een incubator voor 1 h zodat cellen hechten aan de PA gel.
  6. Spoel de celoplossing voorzichtig af met celkweek media, verwijder het PDMS-stencil en voeg meer celkweek media toe. Controleer de vorming van celeilanden onder een microscoop.

4. assemblage van PA gel met PDMS Microchannel

  1. Verwijder stof op het PDMS-micro kanaal met plakband en vervolgens autoclaaf.
  2. Behandel het oppervlak van het PDMS micro kanaal met zuurstof plasma (80 W, 50 kHz) voor 30 sec.
  3. Na het verwijderen van een vloeistof op de PA gel gevulde bodem glas, plaats de PDMS micro kanaal bovenop het onderste glas en zet de montage op de aangepaste glazen houder.
  4. Vul het micro kanaal met celkweekmedium.
    Let op: Zorg ervoor dat u alle in de kanalen gevangen bubbels verwijdert door warme media voorzichtig met een pipet te spoelen. Ook, tijdens het verwijderen van bubbels, zorg ervoor dat u niet loskoppelen van micro patroon celeilanden.

5. geïntegreerd microfluïdisch systeem

  1. Verbind de tubings.
    1. Bereid de connectoren voor door het uiteinde van de naalden (18 G) te trimmen en 90 ° te buigen.
    2. Maak buisleidingen voor drie inlaten en één uitlaat.
      1. Sluit voor de inlaat slang de geknipte naald en een mini volume lijn van 30 cm met een drie-weg stopcock aan. Bereid drie van deze.
      2. Voor uitlaat slangen sluit u de getrimde naald en een mini volume-lijn van 75 cm aan met een drie-weg stopcock. Bereid een van deze.
      3. Vul de buis lijnen met het medium dat voor 1 uur voorverwarmd is.
        Let op: Zorg ervoor dat u alle belletjes in de buisleidingen verwijdert door warme media voorzichtig te spoelen met een spuit.
    3. Bereid reservoirs door het verwijderen van plunjers van spuiten en aansluiten van de inlaatbuizen lijnen.
    4. Steek de naald connectoren van elke slang lijn in de drie inlaten en één uitlaat van het microfluïdische apparaat.
  2. Vul de reservoirs met elk 3 mL vers medium of geconditioneerd medium.
    1. Voor de gradiënt test vult u het linker inlaat reservoir met 20 ng/mL HGF in het celkweekmedium.
    2. Voeg voor de visualisatie van de concentratie gradiënt een fluorescerende kleurstof van 200 μg/mL (Rhodamine B-dextran, 70 kDa) toe aan het linker inlaat reservoir.
    3. Sluit de Uitlaatslang lijn aan op een spuitpomp.
      Opmerking: de bedrijfsmodus van de spuitpomp is "terugtrekking". De stroomsnelheid wordt aangepast aan de capaciteit van de spuit en de werkingssnelheid van de spuitpomp.
  3. Plaats het geïntegreerde microfluïdische systeem op het podium van een conventionele epifluorescerende Microscoop.
    Let op: om een zachte gradiënt van HGF in het microfluïdische kanaal te genereren, moet de stroomsnelheid zo traag zijn als 0,1 μL/min. Dit is voldoende gevoelig, zodat het stabilisatie gedurende 2 uur vereist, en er moet voor worden gezorgd dat fysieke verstoring tijdens het experiment wordt vermeden.

6. beeld verwerving

  1. Maak elke 10 minuten Foto's tot 24 uur met behulp van een geautomatiseerde Microscoop die in een incubator is ondergebracht. Neem op elk tijdpunt een set afbeeldingen met een 4x objectief lens in drie verschillende kanalen, inclusief fase beeld om Celmigratie te visualiseren, groen fluorescerende afbeelding om fluorescerende kralen ingebed in PA-gel te visualiseren en een rood fluorescerende afbeelding om de concentratie gradiënt van een chemische stof.
  2. Na het nemen van timelapse-beelden, bezielen 0,25% trypsine-EDTA-oplossing in microkanalen om cellen los te koppelen van de PA-gel. Na het volledig verwijderen van cellen uit de gel, neem een groene fluorescerende afbeelding om te worden gebruikt als een referentiebeeld voor tractie microscopie.

7. gegevensanalyse

Opmerking: een aangepaste code voor gegevensanalyse is ontwikkeld met behulp van MATLAB, en de details zijn elders beschreven32,33,34,35,36.

  1. Voor fase-beeldanalyse berekent u verplaatsingen in twee opeenvolgende fase beelden met behulp van partikel afbeelding velocimetrie36.
  2. Vergelijk voor Fourier transformatie tractie microscopie elk groen fluorescerende beeld met de referentieafbeelding en bereken de verplaatsingen in elke afbeelding met behulp van de deeltjes afbeelding velocimetrie36. Van de verplaatsingen, herstel tractie gemaakt door cellen op pa gel met Fourier Transform tractie microscopie33,34,37.
  3. Uit de tractie gegevens, bereken stress binnen de monolaag van het celeiland met behulp van monolaag stress microscopie op basis van eindige element methoden32,34,38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om de collectieve migratie onder een chemisch gradiënt te verkennen, werd een microfluïdisch systeem geïntegreerd met tractie microscopie (Figuur 1). Om het geïntegreerde systeem te bouwen, werd de gel van polyacrylamide (PA) op maat gesneden glas gegoten en werden MDCK-cellen in micro patroon eilanden van een PDMS-stencil gescheiden. Voor dit experiment werden twaalf eilanden van MDCK-cellen (vier rijen met drie kolommen, diameter van ~ 700 μm) gecreëerd. Nadat de cellen zijn gekoppeld aan PA gels, is de PDMS stencil verwijderd om collectieve migratie te initiëren. Het vooraf gemaakte microfluïdische kanaal werd bovenop de PA gels geplaatst om microfluïdisch kanaal boven de cellulaire eilanden te bouwen (Figuur 1A).

Om vervolgens een concentratie gradiënt binnen het microfluïdische kanaal te vestigen, werd de linker inlaat aangesloten op het toevoer reservoir met een fluorescerende kleurstofoplossing. Bovendien waren de middelste en de rechter inlaten verbonden met de bevoorradings reservoirs die alleen media bevatten. Vervolgens werd de uitlaat aangesloten op de spuitpomp om vloeistof uit het microfluïdische kanaal te verwijderen. De sandwich van op maat gesneden glas en het microfluïdische kanaal werd op de op maat gemaakte Microscoop fase ingebracht. De monsters samen met de geautomatiseerde fluorescerende Microscoop werden in een incubator voor Live-celbeeldvorming gehouden. Tijdens de experimenten werden cellen bewaard op 5% CO2 en 37 °c. Een gradiënt van de intensiteit van de fluorescerende kleurstof werd snel vastgesteld bij een debiet van 0,125-2 μL/min (Figuur 2a). De helling van het verloop hing af van de stroomsnelheid. Bij een debiet van 0,125 μL/min werd de helling bijvoorbeeld meer dan 1,5 mm ontwikkeld, wat de vergelijkbare grootte van de celeilanden is (Figuur 2B).

Vervolgens is het geïntegreerde apparaat met cellen getest. De eilanden van MDCK-cellen waren microgedessineerd en geassembleerd met het microfluïdische kanaal zoals hierboven beschreven. Ten eerste, zonder het toepassen van een stroom in het micro kanaal, werd ervoor gezorgd dat het cellulaire eiland zich goed verspreidde binnen het apparaat. Over een periode van 12 uur, het eiland uitgebreid, en de gemiddelde migratiesnelheid was ~ 0.1 – 0.2 μm/min. Hoewel er variaties tussen eilanden waren over hoeveel het eiland uitbreidde, zagen alle cellen er gezond uit in de No-flow conditie. Vervolgens werd de stroming toegepast op deze eilanden, en bleek dat bij een debiet van 0,1 μL/min het cellulaire eiland goed verspreidde en de cellen een gemiddelde migratiesnelheid van ~ 0,1 – 0,2 μm/min gedurende 12 uur onderhielden. Echter, bij het verhogen van de stroomsnelheid tot 0,5 μL/min, cellen niet goed verspreid, en de gemiddelde migratiesnelheid daalde tot onder 0,1 μm/min. Bovendien leken de morfologieën van de cellen verschillend en leken ze te ontkoppelen van de PA gels (Figuur 3). Op basis van deze gegevens werd 0,1 μL/min gekozen als het debiet voor de volgende experimenten.

Om de effecten van een chemisch gradiënt op collectieve Celmigratie te testen, werd hgf gekozen32,34.  De linker inlaat was verbonden met 1) het bevoorradings reservoir met celkweek media met HGF-oplossing (20 ng/mL) en 2) de andere 2 inlaten met reservoirs die celkweek media vasthouden. Met een debiet van 0,1 μL/min, werd de stroom over de migrerende celeilanden (vier rijen met drie kolommen) gehandhaafd voor 10 uur (Figuur 4). Zoals getoond in een afzonderlijk experiment, was de hgf-concentratie in de linker kolom dicht bij de concentratie van de bevooradingsvoertuigen Solution (20 ng/ml), en in de rechterkolom was dit bijna nul. De HGF-concentratie op de middelste kolom daalde geleidelijk van de linker helft naar de rechter helft. Bij het vergelijken van de grootte van de celeilanden na 10 h, de eilanden in de rechterkolom uitgebreid niet veel, maar die in de linker kolom werd aanzienlijk groter en uitgebreid in alle richtingen (Figuur 4A). Dergelijke veranderingen in de grootte van het eiland werden ondersteund door de trajecten van cellen binnen elk eiland (Figuur 4B). Interessant is dat eilanden in de middelste kolom niet uitbreiden naar rechts (waar de HGF-concentratie laag was), maar uitgebreid naar links (waar de HGF-concentratie hoog was). Hoewel er weinig verandering in de gemiddelde migratiesnelheid in de rechterkolom, in de linker en middelste kolommen, de gemiddelde migratiesnelheid geleidelijk toegenomen voor de eerste 3 h, vervolgens geleidelijk daalde (Figuur 4C).

Om contractiele kracht en intercellulaire stress te meten, werden tractie microscopie37,39,40 en monolaag stress microscopie gecombineerd met het microfluïdische kanaal33,35, 38. In de loop van 10 h tijdens de toepassing van de chemische gradiënt werden beelden van fluorescerende deeltjes in PA gels genomen, en de kracht (per eenheid) die door cellen op het substraat werd toegepast, werd geanalyseerd met behulp van Fourier transformatie tractie microscopie35, 37. Tractie werd getekend in poolcoordinaten. Blauw staat voor de kracht naar het midden van het eiland, en rood staat voor de kracht weg van het centrum.

Op tijd nul vertoonden alle eilanden vergelijkbare tractie verdelingen, met sterke innerlijke tractie aan de rand en schommeling binnen het eiland. Deze fluctuatie was vergelijkbaar met wat eerder werd getoond34,35,41. Na 10 h van het toepassen van de HGF gradiënt, terwijl de mate van eiland expansie in elke kolom verschillend was, waren de tractie verdelingen grotendeels gelijk aan tijd nul (Figuur 5A). De gemiddelde tractie verandert niet voor 10 uur (Figuur 5C). Bij de berekening van de monolaag stress, echter, elke kolom toonde verschillende trends. In de rechterkolom (waar HGF-concentratie laag was), werd de gemiddelde spanning binnen eilanden gehandhaafd rond 200 PA gedurende een periode van 10 uur. In de linkerkolom (waar hgf-concentratie hoog was) daalde de gemiddelde spanning binnen eilanden geleidelijk van 230 pa naar 100 Pa over 10 h, zoals eerder weergegeven32,34. In de middelste kolom (waar de HGF-concentratie hoog was op de linker helft en laag op de rechter helft van het eiland), werd de gemiddelde spanning gehandhaafd rond 150 pa.

Figure 1
Figuur 1: schematische voorstelling van de voorbereiding van het geïntegreerde apparaat. A) hetgeïntegreerde apparaat fabriceren, een bodem glas met PA-gel waarop de celeilanden werden Gedessineerd met behulp van een PDMS stencil werd bedekt met een PDMS micro kanaal. B) de geïntegreerde apparaten werden met een aangepaste houder bevestigd om vloeistoflekkage en componenten dissociatie te voorkomen. (C) na het apparaat gevuld met vloeistof zonder bubbels, werden reservoirs aangesloten op de inlaat en werd een spuitpomp op het stopcontact aangesloten. Alle experimentele opstellingen werden geplaatst op een Live Cell Imaging systeem. D) het schematische beeld toont het ontwerp en de samenstelling van de microfluïdische kanalen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: vaststelling van de c-hemicale gradiënt. A) fluorescentie beelden van Rhodamine B-geconjugeerde dextran (70 kDa) visualiseren de concentratie gradiënt onder de vloeistofstroom van 0,125 μL/min, 0,5 μL/min, en 2 μL/min. gestippelde cirkels geven de positie van de celeilanden met patroon aan. B) het intensiteits Profiel van het fluorescentie beeld toont aan dat de concentratie gradiënt in het hulpmiddel door het debiet instelbaar was. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. De gekleurde staven geven de kolomposities van het celeiland met patroon aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: migratie van MDCK-celeilanden onder stroom. A) de fase beelden op 12 h van het CELEILAND MDCK bij elk debiet (0 μL/min, 0,1 μL/min en 0,5 μl/min) tonen aan dat de celeilanden goed zijn uitgebreid met een laag debiet, maar niet zijn uitgebreid met een hoog debiet. Gestippelde lijnen vertegenwoordigen de grenzen op 0 h. (B) het gemiddelde en histogram van de cellulaire snelheid binnen elk eiland elke 10 min voor 12 h. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: migratie van MDCK-celeilanden onder stroming en chemische gradiënt. A) het relatieve intensiteits bereik van Rhodamine B-geconjugeerde dextran onderhield een constante hgf-concentratie gradiënt in elke kolom na stabilisatie gedurende 2 uur (b) fase beelden op 10 h (gestippelde lijn = celinsulaire grens bij 0 h) van de MDCK-cel eiland onder de HGF gradiënt (van links naar rechts: 20 – 0 ng/mL) tonen aan dat het eiland meer uitgebreid waar HGF concentratie hoger was. C) de trajecten van migratiepaden (kleurcodering geeft de padlengte aan) van cellen in de MDCK-celeilanden. Gestippelde lijnen en onderbroken lijnen geven de grenzen van elk celeiland weer op respectievelijk 0 en 10 uur. D) het gemiddelde en histogram van de cellulaire snelheid binnen elk eiland elke 10 min gedurende 10 uur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: mechanische interacties van MDCK-celeilanden. A) de kaarten van tractie (celsubstraat interactie) in de celeilanden bij 0 h en 10 h onder de hgf-gradiënt. De kaarten werden uitgezet in radiale coördinatie, met buiten tractie met warme kleur en innerlijke tractie met koude kleur. B) de kaarten van monolaag spanning (celcelinteracties) in de celeilanden bij 0 h en 10 h onder hgf gradiënt. C) het plot van gemiddelde tractie (grijs vierkant) en spanning (blauwe cirkel) binnen de celeilanden onder hgf gradiënt na verloop van tijd elke 10 min gedurende 10 uur. De kleur banden vertegenwoordigen de mid-kwartiel (~ 25% – 75%). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Supplementary Figure 1
Aanvullend figuur S1: juiste kraal verdeling vereist voor een toereikende gegevenskwaliteit tijdens de tractiekracht analyse. Voorbeelden van goede (linker) en slechte (rechts) kwaliteit fluorescerende kraal afbeeldingen met vergrote afbeeldingen in de witte vakken worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Collectieve migratie van samenstellende cellen is een belangrijk proces tijdens de ontwikkeling en regeneratie, en de migratie richting wordt vaak geleid door de chemische gradiënt van groeifactoren4,23. Tijdens de collectieve migratie houden cellen interactie met naburige cellen en onderliggende substraten. Dergelijke mechanische interacties geven aanleiding tot opkomende verschijnselen zoals durotaxis42, plithotaxis33, en kenotaxis43. Dit onderzoek werd echter uitgevoerd met behulp van een enkele concentratie van groeifactoren, zoals die in foetaal runderserum. Om de kloof te dichten, dit protocol beschrijft een nieuw experimenteel platform dat mechanische interacties tijdens collectieve cellulaire migratie onder een chemische gradiënt kan meten.

Het nieuwe platform combineert drie experimentele systemen die op grote schaal zijn gebruikt: micropatterning, tractie microscopie en microfluïdica. Ten eerste werd het micropatterning van de celeilanden voor collectieve migratie uitgevoerd. Ten tweede werd zowel tractie microscopie als monolaag stress microscopie gebruikt voor mechanische metingen van migrerende cellen. Ten slotte werd een microfluïdica-platform gebruikt om chemische gradiënt te creëren over migrerende cellen. Met dit experimentele systeem werd aangetoond dat cellen binnen een enkel eiland verschillend migreren naar aanleiding van verschillende chemische gradiënten.

Zoals beschreven in Figuur 2, vormt de chemische gradiënt slechts over een afstand van 1 mm in het midden van het micro kanaal. Eilanden in de linker kolom worden blootgesteld aan de maximale concentratie, en die in de rechterkolom worden blootgesteld aan de minimale concentratie. De eilanden in de middelste kolom worden daarentegen blootgesteld aan de chemische gradiënt. Op deze manier wordt de respons van de celeilanden gemeten op maximaal, minimaal en een gradiënt van concentraties van een oplosbare factor tijdens hetzelfde experiment. Met behulp van deze array van celeilanden, een geleidelijke toename van de cellulaire migratiesnelheid werd waargenomen als HGF concentratie verhoogd.

Om gegevens van hoge kwaliteit te bereiken, zijn er belangrijke stappen in de procedure die bijzondere aandacht vereisen. De PA gels in een aangepast-glas substraat moeten perfect zijn met betrekking tot de verdeling van fluorescerende deeltjes en oppervlaktecoating van collageen. Dit is omdat zonder hoge kwaliteit pa gels, een hoge kwaliteit gegevensset voor tractie analyse en monolaag stress analyse kan niet worden verworven. Voorbeelden van kwalitatief hoogwaardige kraal afbeeldingen worden weergegeven in de aanvullende figuur 1. De microfluïdische kanalen zijn zeer klein, en bubbels zijn gemakkelijk gevangen in hen. Deze bellen verstoren niet alleen de stroom, maar kunnen ook cellen wegvegen als ze langs de stroom beginnen te bewegen. Daarom is het cruciaal om de microfluïdische kanalen te vullen zonder bubbels. Om een stabiele helling binnen het micro kanaal te bereiken, is de druk balans binnen de drie inhammen erg belangrijk. Om onevenwichtigheden tussen hen te voorkomen, moeten grote reservoirs worden gebruikt, zodat eventuele onevenwichtigheden aan het begin van een experiment gemakkelijk kunnen worden aangepast. Dit nieuwe platform zal verder onderzoek helpen naar de mechanica van collectieve Celmigratie onder chemische gradiënten, wat essentieel is voor het begrijpen van regeneratie, kanker metastasen en ontwikkeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIP) (nr. NRF-2017R1E1A1A01075103), Korea University Grant, en het BK 21 plus programma. Het werd ook gesteund door de National Institutes of Health (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
1 M HEPES buffer solution Gibco 15630-056
1 mm Biopsy punch Integra Miltex 33-31AA-P/25
100 mm petri dishes SPL 10100 100 mm diameter, 15 mm height
14 mm hollow punch ILJIN 124-0571
18 mm Ø Coverslip Marienfeld-Superior 111580 Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
2% bis-acrylamide solution Bio-Rad 1610142 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) Sigma-Aldrich 440159-500ML
3-way stopcock Hyupsung HS-T-61N CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
30 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-30 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
35 mm cell culture dish Corning 430165
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
75 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-75 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
acetic acid J.T. Baker JT9508-03
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad 1610700
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062
Bottom glass chip MicroFIT 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm)
Collagen typeI, Rat tail Corning 354236
Custom glass holder Han-Gug Mechatronics custom-made
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Welgene LM 001-11
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Biowest L0615-500 w/o Magnesium, Calcium
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140-179
FluoSpheres amine-modified microspheres Invitrogen F8764 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515)
Hepatocyte Growth Factor (HGF) Sigma-Aldrich H1404-5UG recombinant, human
JuLI stage live cell imaging system NanoEnTek In Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell type II
Oxygen plasma system Femto Science CUTE-MPR
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G
Rhodamine B isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich R9379-100MG 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel
Steril hypodermic needle 18 G KOVAX Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line
Sticky tape 3M/Scotch 810D 33 m x 19 mm
SU-8 master molds MicroFIT 4” diameter, custom-made
sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) Thermo Scientific 22589 Store at -20°C. Store protected from moisture and light.
Sylgard 184 Elastomer Kit Dow Corning PDMS
Syringe pump Chemyx Inc. model fusion 720 withdraw fluid
Syringes KOVAX 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump
tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Ultraviolet (UV) lamp UVP LLC 95-0248-02 365 nm wavelength

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. Cell migration: from tissue culture to embryos. Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6 (12), 1182-1190 (2005).
  3. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  4. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
  5. Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).
  6. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  7. Vogel, V. Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
  8. Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 543-549 (2013).
  9. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  10. Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. FASEB Journal. 20 (7), 811-827 (2006).
  11. Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays. Biophysical Journal. 101 (11), 2620-2628 (2011).
  12. Garcia, S., et al. Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device. Lab on a Chip. 15 (12), 2606-2614 (2015).
  13. Zhang, Z., et al. Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine. Small. 14 (42), 1703617 (2018).
  14. Ayuso, J. M., et al. Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device. PLoS ONE. 10 (10), 0139515 (2015).
  15. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  16. Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 679-688 (2016).
  17. Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).
  18. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nature Biotechnology. 20 (8), 826-830 (2002).
  19. Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomedical Microdevices. 8 (2), 109-118 (2006).
  20. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  21. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
  22. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  23. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  24. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  25. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  26. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  27. Farrell, J., et al. HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways. Journal of Proteome Research. 13 (6), 2874-2886 (2014).
  28. Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis. Molecular and Cellular Neuroscience. 48 (1), 38-50 (2011).
  29. Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear and Soft matter Physics. 82, 4 Pt 1 041918 (2010).
  30. Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
  31. Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
  32. Jang, H., et al. Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF. Lab on a Chip. 19 (9), 1579-1588 (2019).
  33. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  34. Jang, H., et al. Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer. Scientific Reports. 8, 45844 (2017).
  35. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5 (6), 426 (2009).
  36. Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1254-1266 (2002).
  37. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  38. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS ONE. 8 (2), 55172 (2013).
  39. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  40. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 606-616 (2002).
  41. Notbohm, J., et al. Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion. Biophysical Journal. 110 (12), 2729-2738 (2016).
  42. Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
  43. Kim, J. H., et al. Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet. Nature Materials. 12 (9), 856-863 (2013).

Tags

Biotechniek uitgave 152 microfluïdica tractie microscopie collectieve Celmigratie chemotaxis chemische gradiënt micropatterning
Tractie microscopie geïntegreerd met microfluïdica voor Chemotactische collectieve migratie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jang, H., Kim, J., Shin, J. H.,… More

Jang, H., Kim, J., Shin, J. H., Fredberg, J. J., Park, C. Y., Park, Y. Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration. J. Vis. Exp. (152), e60415, doi:10.3791/60415 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter