Kollektiv cell migration i utveckling, sårläkning och cancermetastaser styrs ofta av gradienter av tillväxtfaktorer eller signalmolekyler. Här beskrivs ett experimentellt system som kombinerar traktionsmikroskopi med ett microfluidiskt system och en demonstration av hur man kan kvantifiera mekaniken i kollektiv migration under biokemisk gradient.
Celler förändrar migrationsmönstren som svar på kemiska stimuli, inklusive lutningar av stimuli. Cellulär migration i riktning mot en kemisk gradient, känd som chemotaxis, spelar en viktig roll i utvecklingen, immunförsvaret, sårläkning, och cancermetastaser. Medan chemotaxis modulerar migration av enskilda celler samt samlingar av celler in vivo, in vitro-forskning fokuserar på encelliga chemotaxis, delvis på grund av avsaknaden av rätt experimentella verktyg. För att fylla denna lucka, beskrivs här är ett unikt experiment system som kombinerar mikrofluidik och micropatterning att demonstrera effekterna av kemiska gradienter på kollektiv cell migration. Dessutom är traktion mikroskopi och enskiktslager stress mikroskopi införlivas i systemet för att karakterisera förändringar i cellulära kraft på underlaget samt mellan angränsande celler. Som proof-of-koncept, migration av mikromönstrade cirkulära öar av Madin-Darby Hundarnas njure (MDCK) celler testas under en gradient av hepatocyte tillväxtfaktor (HGF), en känd spridnings faktor. Det finns att celler som ligger nära den högre koncentrationen av HGF migrerar snabbare än de på motsatt sida inom en cellö. Inom samma ö, cellulära dragkraft är liknande på båda sidor, men intercellulära stress är mycket lägre på sidan av högre HGF koncentration. Detta nya experimentella system kan ge nya möjligheter att studera mekaniken i kemotaktisk migration av cellulära kollektiv.
Cellulär migration i biologiska system är ett grundläggande fenomen som är involverade i vävnads bildningen, immunförsvaret och sårläkning1,2,3. Cellulär migration är också en viktig process i vissa sjukdomar som cancer4. Celler migrerar ofta som en grupp snarare än individuellt, vilket kallas kollektiv cellmigrering4,5. För celler att röra sig kollektivt, avkänning av mikromiljön är viktigt6. Till exempel, celler uppfattar fysikalisk-kemiska stimuli och reagera genom att ändra motilitet, cell-substrat interaktioner, och cell-cell interaktioner, vilket resulterar i riktad migration längs en kemisk gradient7,8, 9,10. Baserat på denna anslutning, snabba framsteg har gjorts i Lab-on-a-chip teknik som kan skapa välkontrollerade kemiska mikromiljöer såsom lutningen på en Chemoattractant11,12,13 . Även om dessa Lab-on-a-chip-baserade mikrofluidik har tidigare använts för att studera chemotaxis av den cellulära ensemblen eller cellulära spheroids14,15,16,17, de har använts mest i samband med Single-cell migration18,19,20,21. Mekanismerna bakom ett cellulärt kollektivt svar på en kemisk gradient är fortfarande inte väl förstådda14,22,23,24,25,26 . Utvecklingen av en plattform som möjliggör en rumslig kontroll av lösliga faktorer samt observation av cellernas biofysik bidrar således till att riva upp mekanismerna bakom kollektiv cell migration.
Utvecklad och beskrivs här är en multi-kanaliseras mikroflödessystem system som möjliggör generering av en koncentration gradient av lösliga faktorer som modulerar migration av mönstrade cell kluster. I denna studie, hepatocyte tillväxtfaktor (HGF) väljs för att reglera migrations beteendet hos Madin-Darby Hundarnas njure (MDCK) celler. HGF är känt för att dämpa cell cellernas integritet och förbättra motiliteten hos cellerna27,28. I mikroflödessystem systemet, Fourier Transform traktion mikroskopi och enskiktslager stress mikroskopi ingår också, vilket möjliggör analys av motilitet, kontraktila kraft, och intercellulära spänningar induceras av konstituerande celler som svar på en HGF Lutning. Inom samma ö, celler som ligger nära den högre koncentrationen av HGF migrera snabbare och Visa lägre intercellulära stressnivåer än de på sidan med lägre HGF koncentration. Resultaten tyder på att detta nya experimentella system är lämpligt att utforska andra frågor inom områden som inbegriper kollektiv cellulär migration under kemiska gradienter av olika lösliga faktorer.
Kollektiv migration av konstituerande celler är en viktig process under utveckling och förnyelse, och migrations riktningen styrs ofta av tillväxtfaktorernas kemiska lutning4,23. Under kollektiv migration, celler hålla interagera med angränsande celler och underliggande substrat. Sådana mekaniska interaktioner ger upphov till framväxande fenomen som durotaxis42, plithotaxis33, och kenotaxis4…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Research Foundation of Korea (NRF) bidrag finansieras av den koreanska regeringen (MSIP) (No. NRF-2017R1E1A1A01075103), Korea University Grant och BK 21 plus-programmet. Det stöddes också av National Institutes of Health (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).
0.25% trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
1 M HEPES buffer solution | Gibco | 15630-056 | |
1 mm Biopsy punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
100 mm petri dishes | SPL | 10100 | 100 mm diameter, 15 mm height |
14 mm hollow punch | ILJIN | 124-0571 | |
18 mm Ø Coverslip | Marienfeld-Superior | 111580 | Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
2% bis-acrylamide solution | Bio-Rad | 1610142 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) | Sigma-Aldrich | 440159-500ML | |
3-way stopcock | Hyupsung | HS-T-61N | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
30 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-30 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
75 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-75 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
acetic acid | J.T. Baker | JT9508-03 | |
Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
Bottom glass chip | MicroFIT | 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm) | |
Collagen typeI, Rat tail | Corning | 354236 | |
Custom glass holder | Han-Gug Mechatronics | custom-made | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Welgene | LM 001-11 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | w/o Magnesium, Calcium |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
FluoSpheres amine-modified microspheres | Invitrogen | F8764 | 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515) |
Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Sigma-Aldrich | H1404-5UG | recombinant, human |
JuLI stage live cell imaging system | NanoEnTek In | Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2) | |
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell | type II | ||
Oxygen plasma system | Femto Science | CUTE-MPR | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
Rhodamine B isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | R9379-100MG | 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel |
Steril hypodermic needle 18 G | KOVAX | Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line | |
Sticky tape | 3M/Scotch | 810D | 33 m x 19 mm |
SU-8 master molds | MicroFIT | 4” diameter, custom-made | |
sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 | Store at -20°C. Store protected from moisture and light. |
Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS | |
Syringe pump | Chemyx Inc. | model fusion 720 | withdraw fluid |
Syringes | KOVAX | 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump | |
tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
Ultraviolet (UV) lamp | UVP LLC | 95-0248-02 | 365 nm wavelength |