该方法描述了使用R26R-纸屑(纸屑)小鼠模型来研究矿化组织,涵盖了从育种策略到图像获取的所有步骤。包括一个可应用于所有软组织的一般协议和可应用于矿化组织的改良协议。
给体内的单个细胞贴上标签,以监测其产生和跟踪其通过生物体的迁移或确定其寿命,是揭示组织发育和维护机制的有力方法。目前用于监测体内细胞的最重要工具之一是纸屑小鼠模型。Confetti 模型可用于以细胞类型特定的方式对活小鼠中具有各种荧光蛋白的单个细胞进行基因标记,并监测它们的命运,以及它们后代随时间的变化,这个过程称为克隆基因追踪或克隆系系追踪。这个模型产生于近十年前,有助于加深对许多生物过程的了解,特别是与干细胞生物学、成人组织的发育和更新有关。然而,在图像采集和同时捕获各种荧光信号之前保留荧光信号在技术上具有挑战性,尤其是对于矿化组织。本出版物描述了使用纸屑模型分析可应用于任何矿化或非矿化组织的生长板软骨的分步协议。
在使用动物模型时,改进监测细胞行为的方法是为了提高实验效率。监测体内细胞行为的最翔实的方法之一是用多色报告器小鼠菌株1进行克隆系追踪,包括广泛使用的R26R-纸屑(纸屑)小鼠2。通过用荧光蛋白对单个细胞进行基因标记,并随着时间的推移跟踪这些细胞,许多领域的研究人员都使用纸屑小鼠揭示了对许多不同的生物系统的见解。
纸屑小鼠是一个基于loxP的检测系统,其中Cre依赖性DNA重组导致几种可能的荧光蛋白之一以随机方式永久表达2。R26R-五彩纸屑等位基因包括无处不在的CAGG启动子,它位于一个loxP的NeoR-盒2的上游,其多基因化序列终止转录3,然后Brainbow 2.1 构造4.因此,Cre介导的重组同时切除NeoR-盒,并导致某些荧光蛋白的产生,这取决于Brainbow 2.1结构的哪个部分被切除。此功能使纸屑小鼠具有极强的适应性,因为它可用于针对小鼠中具有特定 Cre 应变的任何细胞群。组织特异性Cre菌株与R26R-纸屑菌株的交叉提供了标签的特异性。然而,Cre菌株也应该是可诱导的(例如,CreERT或CreERT2,它们需要他莫西芬结合才能使它们进入细胞核并诱导DNA重组5),以便在指定的时间点实现标记。因此,细胞群可以通过在所需时间点注射出的CreERT阳性/纸屑阳性后代,并跟踪到一定年龄,从而收集感兴趣的组织进行分析。组织处理后,荧光标记细胞可以通过共聚焦显微镜直接可视化,以便每个最初标记的细胞的后代可以从任何其他标记细胞基于其特定荧光生成的后代中分离出来标签,从而可以评估克隆度(即克隆遗传追踪)。
由于纸屑模型的灵活性,它已被应用于研究在健康和疾病2,6,7,8,9, 许多不同的组织的发展和维护, 10,11.使用该模型的一种常见方法是标记特定细胞群,并确定它们(和/或其后代)对哪些组织做出了贡献。使用这种方法的一个这样的发现是,成人牙齿是由具有胶质起源的细胞6组成。该模型的另一个应用是研究干细胞平衡。例如,五彩纸屑模型显示,肠道密码中的干细胞利基逐渐成为单克隆,因为一些干细胞克隆在干细胞2之间的竞争中占据主导地位。该模型还可用于评估细胞增殖,这对于研究缓慢分裂的细胞特别有用。例如,评估了关节软骨12的克隆形成,并研究了刺猪拮抗剂对生长板软骨细胞的短期影响。
尽管五彩纸屑模型相对简单,但荧光信号在技术上很难保存,直到图像收集,尤其是在分析矿化组织时。在这里,该协议描述了一个优化的模型,将五彩鼠与产后骨骼(最多6个月大)结合使用,使荧光蛋白能够直接通过共聚焦显微镜进行可视化,而无需免疫检测。这种简化的协议可以应用于非矿化组织。此外,还包括如何存储样品,以便长时间保存荧光信号至少3年的说明。图 1中给出了协议的大纲。
纸屑模型被广泛用于研究矿化软骨组织12,13,14和描述优化的协议。一个副本或两个R26R-纸屑等位基因的纸屑小鼠2可用于育种和实验。在具有一个Brainbow 2.1构造等位基因的小鼠中重组将给出四个潜在的标签:红色荧光蛋白(RFP、细胞质)、黄色荧光蛋白(YFP、细胞质)、青色荧光蛋白(CFP、膜局部)和绿色荧光蛋白(GFP,细胞核局部),而同源纸屑小鼠的重组(即包含两个Brainbow 2.1结构的副本)将给出10个可能的颜色输出(RFP+RFP,RFP_YFP,RFP+CFP,RFP+GFP,YFP_YFP,YFP_CFP,YFP_CFP,YFP_CFP,YFP]YFPGFP、CFP+CFP、CFP+GFP、GFP+GFP)。然而,由于DNA切除和反转事件以随机方式发生,重组产生GFP只发生在一小部分细胞中,如先前报道的2,并且似乎因细胞类型或Cre线使用2不同。12,13.因此,由于导致GFP表达式的重组事件发生率较低,六种颜色输出在同源纸屑小鼠中最为常见。
在规划纸屑小鼠的实验时,一个重要的考虑因素是找到合适的Cre应变。首先,由于五彩纸屑等位基因有几个 loxP 站点,因此一个重组事件不排除第二个4。这意味着,如果对单元格进行标记并进行分割以生成一种颜色的克隆,则其子单元格中的第二个重组事件将生成不同的颜色,从而掩盖真正的克隆展开。因此,不可诱导的Cre菌株,如果相应的启动子是活跃的,酶总是活跃的,是不可取的。其次,在一些菌株中,Cre重组酶的表达往往以牺牲内源性蛋白质为代价,从而创造出自己的表型(例如,Prg4-GFPCreERT2敲鼠菌株,其中小鼠携带两个克雷塞勒15),因此,一个单一的克雷等位基因的副本是可取的。在描述的所有实验中,由雄性或雌性父母携带一份Col2CreERT16,以产生Col2CreERT:纸屑小鼠,如描述13所述。其次,Cre线对感兴趣的细胞类型的特异性是一个重要的考虑因素。例如,Col2CreERT是软骨细胞特异性,但标签几个不同的软骨细胞种群在产后软骨17。最后,不同Cre菌株的活动可以随动物年龄而发生显著变化,因为用于Cre表达的启动子的内源性活动,即使在同一类型的细胞中(例如Prg4-GFPCreERT2)中,也可能需要增加将表面区域细胞标记为小鼠年龄为 15的他莫西芬剂量数。
标记细胞的数量将由给予的他莫西芬的量来反映,因此并不总是需要给出最大剂量,因为区分克隆彼此可能很困难。由于 Cre 表达会根据不同促进剂以及年龄的变化而变化, 塔莫西芬的剂量将需要调整以优化标签.需要注意的是,细胞在触发重组时不会立即荧光,因为需要时间才能进行重组,并且产生的荧光蛋白足以积累以进行成像。需要广泛的小时(24-72小时之间),这似乎受Cre线、细胞型和动物年龄的影响。由于他莫西芬在施给18后长期具有生物活性,因此建议彻底检查每种型号的重组效率。
在共聚焦显微镜步骤中,荧脂荧光蛋白的激发需要激光穿透组织。由于不同的组织具有不同的特性,激光可能无法穿透所有组织的 160 μm 厚的部分。然而,这种厚部分可用于生长板软骨,如图2,图3所示。请注意,每台显微镜都不同,并且描述中的设置 (补充文件 1) 不太可能在不进行细微调整的情况下完美工作。主要挑战之一是区分不同的荧光蛋白,以确保从一个通道到另一个通道没有污染。例如,YFP通道中由来自GFP的荧光引起的信号在YFP和RFP通道之间重叠。还必须仔细检查 YFP 和 CFP 通道。这可以通过多种方式完成。首先,可以缩小每种荧光蛋白的荧光波长的发射范围。其次,结合数字增益调整激光功率可以优化信号。在这项研究中,这些步骤已经足够了,但它们依赖于强烈的荧光信号。这意味着,从理论上讲,低效的组织处理会降低荧光蛋白的活性,或者弱激光光源会损害通道分离。
纸屑小鼠的优点之一是,它可以与大量的基因突变菌株相结合,从而可以研究特定基因对克隆动力学的影响10,11,12 ,13,14,19,20,尽管有一些限制。例如,当使用基于Cre loxP的突变体与克隆系谱追踪时,不能分离纸屑等位基因和感兴趣的基因的重组。然而,这种重合重组事件可以生效10,14,20。例如,这种可能性用于探索生长板21中TSC1的产后软骨细胞特异性消融后小鼠休息区增加的细胞数,并揭示这些细胞之间的克隆关系。13.此外,使用纸屑小鼠的组织特异性克隆分析可用于非基于CcreloxP的突变小鼠11,并且也可以将这些方法与药理学8、9相结合 ,13和/或手术模型8,以可视化克隆对其他功能扰动的反应。当将纸屑标记部分与免疫荧光对内源性蛋白质的免疫检测相结合时,会出现更多机会。这种分析允许识别被追踪的细胞及其与已知标记的共定位。使用本文所述的固定方法,可以进行免疫荧光,并且仍然可视化来自纸屑荧光蛋白12,13的荧光。然而,在上述论文中,不需要抗原检索。苛刻的抗原检索方法,如在青酸盐缓冲液中煮沸,导致纸屑完全丧失。虽然可以使用抗体22检测出五彩纸屑荧光蛋白,但克隆身份的丧失可能发生。
总之,使用纸屑模型标记体内的细胞是分析这些细胞随时间而的命运的信息工具。所述方法为直接可视化矿化组织中荧光蛋白表达提供了一种快速有效的方法。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢叶夫根尼·伊瓦什金博士提供的方法学建议。这项工作得到了瑞典研究理事会(A.S.C)、俄罗斯科学基金会(向ASC提供#19-15-00241赠款)、卡罗林斯卡研究所(A.S.C.)、斯特拉特根基和斯蒂夫特森·科农·古斯塔夫五世(A.S.C.)、斯蒂夫特森(A.S.C.)的财政支助。弗里穆拉雷·巴努塞特和萨尔斯卡佩特·巴纳瓦尔德(P.T.N.),中国奖学金委员会(B.Z.)。共聚焦显微镜由克努特和爱丽丝·沃伦伯格基金会资助。
2,2-thiodiethanol | Sigma | MKCF9328 | |
60 mm-long cover slips | Mendel-Gläzer | 220588 | |
Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM 710 | |
Corn oil | Sigma | C8267 | |
Cryomold (standard) | Sakura | 4557 | |
Cryostat | Thermo | Model: NX70 | |
Disposable cryostat blades | Histolab | 207500014 | Specifically for use with hard tissue |
EDTA | Scharlan | AC0960005P | |
Formaldehyde concentrate | Merck | 8.18708.1000 | |
Glass bottles | Sigma | V7130 | Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing |
Imaris software | Oxford Instruments | N/A | Image analysis software for 3D reconstruction |
Isoflurane | Zoetis | 11-8162 | |
OCT | Sakura | 102094-104 | |
Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
PBS | Gibco | 14200075 | |
Sodium hydroxide | Merck | 1.06498.1000 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Superfrost UltraPlus slides | Mendel-Gläzer | J3800AMNZ | |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
Zen2 software | Zeiss | N/A | Freeware for Confocal laser scanning microscopy |