Summary
Este método describe el uso del modelo de ratón R26R-Confetti (Confeti) para estudiar tejidos mineralizados, cubriendo todos los pasos desde la estrategia de cría hasta las adquisiciones de imágenes. Se incluye un protocolo general que se puede aplicar a todos los tejidos blandos y un protocolo modificado que se puede aplicar a los tejidos mineralizados.
Abstract
Etiquetar una célula individual en el cuerpo para monitorear qué tipos de células puede dar lugar y rastrear su migración a través del organismo o determinar su longevidad puede ser una manera poderosa de revelar mecanismos de desarrollo y mantenimiento de tejidos. Una de las herramientas más importantes disponibles actualmente para monitorear las células in vivo es el modelo de ratón Confetti. El modelo Confetti se puede utilizar para etiquetar genéticamente células individuales en ratones vivos con varias proteínas fluorescentes de una manera específica del tipo de célula y monitorear su destino, así como el destino de su progenie a lo largo del tiempo, en un proceso llamado rastreo genético clónico o trazado de linaje clonal. Este modelo fue generado hace casi una década y ha contribuido a una mejor comprensión de muchos procesos biológicos, particularmente relacionados con la biología de células madre, el desarrollo y la renovación de tejidos adultos. Sin embargo, preservar la señal fluorescente hasta la recolección de imágenes y la captura simultánea de varias señales fluorescentes es técnicamente difícil, particularmente para el tejido mineralizado. Esta publicación describe un protocolo paso a paso para el uso del modelo Confetti para analizar el cartílago de la placa de crecimiento que se puede aplicar a cualquier tejido mineralizado o no mineralizado.
Introduction
Los métodos mejorados para monitorear el comportamiento celular son deseables para aumentar la eficiencia experimental cuando se utilizan modelos animales. Uno de los enfoques más informativos para monitorear el comportamiento celular in vivo es el trazado de linaje clonal con cepas de ratón reportero multicolor1, incluyendo el ratón R26R-Confetti (Confeti)ampliamenteutilizado 2 . Al etiquetar genéticamente las células individuales con proteínas fluorescentes y seguir esas células a lo largo del tiempo, los investigadores en muchos campos han utilizado el ratón Confetti para revelar información sobre una multitud de diferentes sistemas biológicos.
El ratón Confetti es un sistema de reportero basado en loxP en el que la recombinación de ADN dependiente de Cre provoca la expresión permanente de una de varias proteínas fluorescentes posibles de manera estocástica2. El alelo R26R-Confetti incluye el promotor CAGG ubicuamente expresado, que se encuentra inmediatamente aguas arriba de un NeoR-cassette2flanqueado por loxP, cuya secuencia de poliadenilación termina la transcripción3, seguida de la Brainbow 2.1 construir4. Por lo tanto, la recombinación mediada por Cre extirpa simultáneamente el neocassetteYconduce a la producción de ciertas proteínas fluorescentes dependiendo de qué partes de la construcción Brainbow 2.1 se extirpan. Esta característica hace que el ratón Confetti sea extremadamente adaptable porque se puede utilizar para dirigirse a cualquier población celular en un ratón para el que hay una cepa Cre específica disponible. El cruce de una cepa Cre específica del tejido con la cepa R26R-Confetti proporciona la especificidad del etiquetado. Sin embargo, la cepa Cre también debe ser inductible (por ejemplo, CreERT o CreERT2, que requieren unión a tamoxifeno para permitirles entrar en el núcleo e inducir la recombinación de ADN5) para que el etiquetado pueda lograrse en momentos de tiempo especificados. Por lo tanto, una población celular puede ser etiquetada inyectando la descendencia creert positiva/confeti positiva resultante con tamoxifeno en el punto de tiempo deseado y rastreada a una cierta edad, cuando los tejidos de interés pueden ser recogidos para su análisis. Después del procesamiento de tejidos, las células etiquetadas fluorescentes pueden visualizarse directamente mediante microscopía confocal para que la progenie de cada célula etiquetada inicialmente pueda separarse de la progenie generada por cualquier otra célula etiquetada basada en su fluorescente específico etiquetas, permitiendo así la evaluación de la clonalidad (es decir, el rastreo genético clonal).
Debido a la flexibilidad del modelo Confeti, se ha aplicado para estudiar el desarrollo y mantenimiento de muchos tejidos diferentes en salud y enfermedad2,6,7,8,9, 10,11. Una forma común de utilizar el modelo es etiquetar una cierta población de células y determinar a qué tejidos han contribuido (y/o su progenie). Uno de esos hallazgos utilizando este enfoque fue que el diente adulto se compone de células con un origen glial6. Otra aplicación del modelo es estudiar la homeostasis de células madre. Por ejemplo, el modelo Confetti reveló que los nichos de células madre en las criptas intestinales gradualmente se vuelven monoclonales porque algunos clones de células madre son dominantes durante la competencia entre las células madre2. El modelo también se puede utilizar para evaluar la proliferación celular, que es particularmente útil para el estudio de células que dividen lentamente. Por ejemplo, se evaluó la formación clonal en el cartílago articular12, yseestudiaron los efectos a corto plazo de un antagonista del erizo en los condrocitos de placas de crecimiento en ratones de cinco semanas de edad.
A pesar de la relativa simplicidad del modelo Confetti, la señal fluorescente puede ser técnicamente difícil de preservar hasta la recolección de imágenes, particularmente cuando se analizan los tejidos mineralizados. Aquí, el protocolo describe un modelo optimizado para utilizar el ratón Confetti con el hueso postnatal (hasta 6 meses de edad), lo que permite visualizar directamente las proteínas fluorescentes mediante microscopía confocal sin necesidad de inmunodetección. Este protocolo simplificado se puede aplicar a los tejidos no mineralizados. Además, se incluye una descripción de cómo almacenar las muestras con el fin de preservar la señal fluorescente durante un período prolongado de al menos 3 años. En la Figura 1se presenta un esquema del protocolo.
Protocol
Todo el trabajo del ratón fue aprobado por el Comité Ético de Experimentos Animales (Comité del Norte de Estocolmo/Comité de Estocolmo/Norra Djurf-rs-ksetiska N-md) y llevado a cabo de conformidad con las Disposiciones y Directrices para la Experimentación Animal de la Agencia Sueca de Animales.
1. Crianza de ratones
- Para generar la tensión, cruce el ratón R26R-Confetti con la línea de interés Cre. Destete a los cachorros a los 21 días de edad.
NOTA: Los ratones se pueden utilizar para la cría a partir de aproximadamente 8 semanas de edad, o de acuerdo con las directrices locales. El genotipado (no descrito aquí) se puede realizar a partir de biopsias recogidas en el destete. La edad al destete se puede ajustar según las pautas locales.
2. Etiquetado de confeti
NOTA: Esta estrategia de etiquetado es adecuada para cepas Cre inductibles de tamoxifeno.
- Preparar una solución de hasta 2,5 mg/ml de tamoxifeno en aceite de maíz en una botella de vidrio. Disolver calentando a 37oC en un horno durante un máximo de 60 min, agitando cada 5 min utilizando un vórtice hasta que el polvo se haya disuelto.
NOTA: Para el aumento de las dosis de tamoxifeno, se pueden preparar soluciones de hasta 20 mg/ml utilizando este método. - Conservar a 4oC durante un máximo de 3 meses, protegido de la luz.
- Inducir la recombinación mediante la administración de 50 ml de tamoxifeno de 2,5 mg/ml disuelto en aceite de maíz por vía intraperitoneal el primer día postnatal (P1).
NOTA: En principio, el tamoxifeno se puede administrar a cualquier edad, ya en la generación F1. La dosis de tamoxifeno debe variarse en función de la expresión De, la edad del ratón y la aplicación experimental. Puede encontrar más información en la sección de discusión. Cre ratones negativos tratados de la misma manera se pueden utilizar como un control negativo para las señales fluorescentes de confeti.
ADVERTENCIA: Asegúrese de que los manipuladores de animales estén advertidos del uso de tamoxifeno y asegúrese de que los materiales de la jaula se eliminen de acuerdo con las pautas ambientales y de seguridad locales.
3. Recolección de tejidos
- Eutanizar ratones en el día postnatal 27 (P27) llenando gradualmente el espacio que contiene los ratones con dióxido de carbono hasta al menos 80% en volumen y manteniendo esta concentración durante 3 min. Realizar luxación cervical. Mantenga a los ratones en hielo durante la disección de los otros animales.
- Diseccionar el tejido de interés. A continuación se describe un protocolo para recoger las placas de crecimiento femoral tibial y distal proximales y el cartílago articular de la rodilla, adecuado para ratones postnatales hasta la edad de 6 meses.
- Retire la piel alrededor de las extremidades posteriores hasta el pie, usando tijeras afiladas y fórceps dentados.
- Recorta aproximadamente el músculo y el tejido graso de las piernas con tijeras afiladas.
NOTA: No limpie los huesos perfectamente, ya que los tejidos circundantes proporcionan algún soporte estructural al seccionar, pero asegúrese de que se retira toda la piel. - Usando un bisturí, corte a través del tejido blando donde la parte superior de la pierna se encuentra con el cuerpo hasta que la cabeza femoral sea visible, luego corte los ligamentos en la articulación de la cadera para extraer la pierna.
NOTA: Alternativamente, si no es posible encontrar la cabeza femoral, corte a través del fémur cerca de la cadera con tijeras fuertes. - Disecciona el pie del resto de la pierna usando un bisturí o tijeras afiladas.
4. Fijación y procesamiento de tejidos
NOTA: Basado en el tejido de interés, siga uno de los dos protocolos detallados a continuación (4.1 para tejidos blandos o 4.2 para tejidos mineralizados de ratón mayores de 45 días, como se detalla a continuación). Para ambos métodos, almacene las muestras diseccionadas en la solución salina tamponada (PBS) de formaldehído/fosfato al 3,7% en hielo mientras disecciona los animales restantes.
- Para los tejidos blandos y las tibias mineralizadas y los fémoras hasta la edad de aproximadamente P45, fije el tejido en un 3,7% de formaldehído/PBS preenfriado durante 6 h, rodando suavemente sobre un rotador a 4oC. Utilice un volumen al menos 10 veces mayor que el del tejido. Continúe directamente hasta el paso 4.3.
- Para los tejidos mineralizados, incluyendo las tibias y los fémures mayores de aproximadamente P45, se requiere un paso de descalcificación.
- Preparar 1 L de 10% de solución EDTA/dH2O con el pH ajustado a 8,05 utilizando hidróxido de sodio. A continuación, diluir el formaldehído al 3,7% utilizando esta solución. La concentración de trabajo de EDTA será del 9%.
- Fijar el tejido colocando en el formaldehído/PBS preenfriado 3.7% durante la noche, rodando suavemente sobre un rotador a 4 oC.
- Colocar el tejido en un 3,7% de formaldehído preenfriado/9% de solución EDTA/dH2O (pH 8.05) y girar suavemente a 4oC en un volumen al menos 10 veces mayor que el del tejido. Repita este paso colocando los huesos en un formaldehído fresco y preenfriado 3,7% /9% EDTA/dH2O durante 3 veces durante las siguientes 48 horas.
NOTA: Esta corta descalcificación es suficiente para permitir la seccionamiento de los huesos del fémur y la tibia de hasta 6 meses de edad ratones. Para los tejidos más densamente mineralizados se puede requerir más descalcificación para mejorar la histología.
- Transfiera el tejido a una sacarosa preenfriada del 30%/dH2O. Asegúrese de llenar el recipiente hasta el borde y gire suavemente durante la noche a 4oC. Utilice un volumen al menos 10 veces mayor que el del tejido. El tejido a menudo flota cuando se coloca por primera vez en esta solución y se hunde en la parte inferior de la botella por la mañana.
- Para extraer la solución residual de sacarosa, lave brevemente el tejido extrayéndola de la solución de sacarosa con fórceps y cubriendo completamente la muestra con aproximadamente 5 ml de compuesto de temperatura de corte óptimo (OCT) durante varios segundos.
- Llene un criomold preetiquetado con Oct y coloque el tejido en la parte inferior. Trabaje rápidamente para evitar las muestras a temperatura ambiente durante demasiado tiempo.
NOTA: Es importante colocar la muestra en una orientación conveniente para el paso de seccionamiento. Para aumentar las posibilidades de seccionar a través de columnas enteras de la placa de crecimiento después de trazar con Col2CreERT:Confetti, coloque el lado medial hacia abajo usando la cabeza femoral como guía, y coloque la muestra tan plana como sea posible en la parte inferior del molde. - Incruste la muestra colocando el molde en hielo seco y esperando a que el Oct se solidifique por completo. Coloque los criomoldes lo más plano posible para evitar el movimiento/deslizamiento del tejido en el molde. Una vez terminadas, guarde las muestras a -20 oC, si no se utilizan inmediatamente.
NOTA: Utilícelo en un plazo de 12 semanas, ya que con la edad los bloques se vuelven más difíciles de seccionar.
5. Seccionamiento
NOTA: Realice la criosección con un criostato con cuchillas desechables adecuadas para tejido sorctoso. Cualquier criostato estándar es adecuado.
- Retire el bloque del molde y fíjelo al mandril aplicando OCT entre la parte superior del bloque y el mandril y enfriando en el criostato a -20 oC durante al menos 5 minutos, de modo que el PTU se haya solidificado por completo.
- Preenfriar tanto el soporte de la muestra como el soporte de la hoja a -20 oC y, a continuación, colocar la muestra/chuck en el soporte del mandril y la hoja en el soporte de la hoja para equilibrar durante varios minutos.
NOTA: Las temperaturas especificadas pueden variar varios grados dependiendo del criostato y el tejido de interés. - Utilice el criostato para recortar las secciones de bloque y tejido de un espesor adecuado para permitir la visualización de los clones en el tejido de interés.
- Para el análisis de la placa de crecimiento postnatal, prepare secciones de 30 a 160 m y recórtelas en diapositivas. Algunos modelos de criostatos solo pueden permitir la colección de secciones gruesas utilizando el ajuste de recorte.
- Seque al aire los portaobjetos a temperatura ambiente hasta que estén completamente secos.
NOTA: La duración de este paso puede variar en función de las propiedades del tejido y el grosor de la sección. La temperatura de la habitación también es probable que afecte a la velocidad de este paso. - Almacene las diapositivas a -20 oC durante un máximo de 36 meses, o si se procesa inmediatamente, proceda al paso 6.2.
6. Preparación y montaje de la diapositiva
- Retire la corredera del congelador y suba horizontalmente a temperatura ambiente en un portaobjetos. Deje que cualquier condensación se evapore.
- Retire el PTU utilizando una pipeta Pasteur para aplicar suavemente PBS a temperatura ambiente sobre la diapositiva. Cuanto más gruesa sea la sección, más tiempo se requiere. Para secciones de 160 m de espesor, realice dos enjuagues: incubar una vez durante 15 minutos y retirar el líquido, y luego aplicar PBS fresco durante 5 min y retirar el líquido.
NOTA: Este paso es para eliminar el OCT y se puede variar en función de las propiedades del tejido y el grosor de la sección, según corresponda. Es probable que la temperatura de la habitación afecte a la velocidad de este paso. - Monte los portaobjetos en una solución de 75% 2,2-tiodietanol/dH2O a temperatura ambiente con resbalones de cubierta de 60 mm de largo.
NOTA: Las diapositivas se pueden preparar inmediatamente antes de la toma de imágenes, pero la señal fluorescente es estable durante 1 a 2 semanas si se mantiene fuera de la luz en una cámara humidificada a 4 oC.
7. Imágenes por microscopía confocal
- Prepara el microscopio.
- Encienda el microscopio y abra el software. Haga clic en el botón Iniciar sistema.
- Seleccione los canales haciendo clic primero en Configuración inteligente en la pestaña Adquisición y, a continuación, seleccionando los tres canales correspondientes a la proteína fluorescente roja (RFP), la proteína fluorescente amarilla (YFP) y la proteína fluorescente cian (CFP) en la Se dirige al tinte. Haga clic en Mejor señal y luego en Aplicar para seleccionar los láseres.
NOTA: El contenido de la pestaña Adquisición se muestra en el archivo complementario 1A. Si los canales requeridos no están presentes, agréguelos usando el botón '+' debajo del encabezado Dye. La información necesaria sobre el láser, las longitudes de onda de excitación y el rango de longitudes de onda de emisión registradas se muestra para las tres proteínas fluorescentes Defetti en el archivo suplementario 1B-D. - Seleccione la lente objetivo 20x bajo el encabezado Objetivo en la pestaña Modo de adquisición.
- Localice la placa de crecimiento u otro tejido de interés.
- Para proporcionar una vista distinta, seleccione primero el canal RFP haciendo clic en su nombre en la pestaña Canales. Esto hace que los detalles del canal RFP se muestren en la ficha Ruta de luz.
NOTA: El canal T-PMT muestra luz láser no reflejada, que se utiliza para visualizar las partes no fluorescentes del tejido. - Coloque la corredera en el portaobjetos y coloque la placa de crecimiento u otro tejido de interés directamente entre la trayectoria de la luz y la lente objetivo.
- Para simplificar la localización del tejido, anule la selección de los canales YFP y CFP utilizando las casillas de verificación bajo el encabezado Pistas de la pestaña Canales.
- Seleccione el canal T-PMT haciendo clic en su nombre en el encabezado Pistas. El tecleo vive en la lengueta de la adquisición y aumenta la ganancia (maestro) para el canal T-PMT para visualizar la sección del tejido en la pantalla, que se muestra en la escala de grises.
- Mueva la posición de la diapositiva utilizando el joystick para localizar la región de interés y, a continuación, enfóquese con la perilla del microscopio adecuada.
- Haga clic en Detener en la pestaña Adquisición para desactivar la exposición láser.
- Para proporcionar una vista distinta, seleccione primero el canal RFP haciendo clic en su nombre en la pestaña Canales. Esto hace que los detalles del canal RFP se muestren en la ficha Ruta de luz.
- Defina los parámetros de imagen.
- Utilice las casillas de verificación de la pestaña Canales para seleccionar uno de los canales y haga clic en Vivir en la pestaña Adquisición para mostrar la imagen de ese canal en la pantalla. A continuación, con el botón izquierdo del ratón, ajuste las barras deslizantes para establecer el rango de señal fluorescente emitida que se recoge, la potencia del láser (barra deslizante bajo el encabezado láser), Ganancia (maestro) y Desplazamiento digital en el Ficha Canales para visualizar las celdas etiquetadas con confeti en la pantalla. Los valores orientatográficos para todos estos parámetros se proporcionan en el archivo suplementario 1B-D para RFP, YFP y CFP. Complete este paso para cada canal, uno por uno.
NOTA: Para asegurarse de que la señal visualizada no es autofluorescencia, una sección de un animal negativo Cre se puede utilizar como un control negativo durante este paso. Como T-PMT se ha combinado con el láser RFP (paso 7.2.1) el ajuste de la potencia láser para RFP afectará a la señal T-PMT. - Ajuste el tamaño del agujero para aumentar la detección de fluorescencia si es necesario.
NOTA: Cuanto mayor sea el tamaño del agujero, más señal fluorescente se detectará en la dirección Z. Una directriz para esto es la unidad Airy resultante (AU), que se indica automáticamente debajo del indicador Pinhole, donde 1 UA es óptima para la calidad de imagen. Aumentar demasiado la UA perjudicará el análisis posterior porque se hace más difícil distinguir las células individuales en la dirección Z). - Compruebe la configuración para asegurarse de que las señales grabadas no se superpongan.
- Haga clic en las casillas de verificación de la pestaña Canales para seleccionar los tres canales y pulse el botón Ajustar en la pestaña Adquisición.
- En la imagen resultante, desplácese entre los canales mostrados haciendo clic en los cuadros resaltados en azul situados encima de cada canal de la lista Dimensiones. Si las señales se superponen (por ejemplo, si cada celda roja también es amarilla), vuelva al principio del paso 7.3 y repita, ajustando los parámetros para los canales superpuestos hasta que se puedan distinguir entre sí. Asegúrese de que para cada etiqueta (es decir, RFP, YFP o CFP), se pueda visualizar al menos un clon que contenga solo una de las etiquetas.
- Utilice las casillas de verificación de la pestaña Canales para seleccionar uno de los canales y haga clic en Vivir en la pestaña Adquisición para mostrar la imagen de ese canal en la pantalla. A continuación, con el botón izquierdo del ratón, ajuste las barras deslizantes para establecer el rango de señal fluorescente emitida que se recoge, la potencia del láser (barra deslizante bajo el encabezado láser), Ganancia (maestro) y Desplazamiento digital en el Ficha Canales para visualizar las celdas etiquetadas con confeti en la pantalla. Los valores orientatográficos para todos estos parámetros se proporcionan en el archivo suplementario 1B-D para RFP, YFP y CFP. Complete este paso para cada canal, uno por uno.
- Adquirir imagen.
- Seleccione la pestaña Modo de adquisición para especificar la calidad de la imagen utilizando los valores Tamañode fotograma , Velocidady Número de promedio.
NOTA: La configuración típica de estos experimentos se indica en el archivo suplementario 1A. La reducción del zoom en el encabezado del área de escaneado dentro de la pestaña Adquisición puede aumentar el campo de visión sin alterar el tiempo necesario para la adquisición de imágenes. - En la pestaña Adquisición, en el encabezado Adquisición dimensional, haga clic en la casilla z-Stack. Abra la pestaña De la pila Z para establecer el intervalo entre las imágenes en la dirección Z en 2,5 m.
- Para establecer las ubicaciones correctas, seleccione solo el RFP/T-PMT en la pestaña Canales y haga clic en Live para visualizar los clones rojos con un contorno visible del tejido. Establezca la primera y la última rebanada haciendo clic en Establecer primero y Establecer último en la rebanada correspondiente, ajustando el enfoque con la perilla del microscopio.
- Haga clic en la pestaña Escaneo de teselas dentro de la ficha Adquisición e introduzca el número total de teselas en las direcciones horizontal y vertical en los cuadros correspondientes.
- Para la captura de imágenes, seleccione todos los canales deseados en la pestaña Canales y, a continuación, haga clic en el botón Ajustar para recopilar una sola imagen o en el botón Iniciar experimento para recopilar una pila Z/Escaneode mosaicos .
- Seleccione la pestaña Modo de adquisición para especificar la calidad de la imagen utilizando los valores Tamañode fotograma , Velocidady Número de promedio.
- Una vez adquirida la imagen, haga clic en Archivo y luego en Guardar como y guarde la imagen en un tipo de archivo que conserve la mayor cantidad de información posible sobre la configuración del microscopio, para permitir su revisión y reutilización posteriores.
- Realice análisis adicionales utilizando el software de análisis de imágenes.
Representative Results
Para etiquetar los condrocitos en el cartílago epifisel y visualizar su expansión clonal con la edad utilizando la administración de tamoxifeno en P1, Col2CreERT:Los ratones confeti fueron etiquetados, y sus extremidades posteriores fueron recogidas en P27. La sección central se determinó visualizando el ligamento cruzado(Figura 2A)y se visualizaron clones en la placa de crecimiento tibial proximal(Figura 2B). Estos datos muestran que las células individuales que fueron Col2-positivas en P1 y se etiquetaron con proteínas fluorescentes de confeti cuando se administró tamoxifeno, se sometieron a expansión clonal, y posteriormente permanecieron en la placa de crecimiento hasta P27. Los cambios iniciales en la expansión clonal desde un punto de tiempo de desarrollo similar se pueden ver en la Figura 1 de una publicación reciente13.
Para dar un ejemplo de la señal fluorescente después del almacenamiento a largo plazo (paso 5.5), la sección recopilada se almacenó inmediatamente después (ver Figura 2A,B) durante más de 3 años antes de que se preparara e imágenes(Figura 2C, Video 1) .
Para demostrar algunos problemas comunes con el protocolo, una sección rota durante el paso de criosección se muestra en la Figura 3A. La región de la sección (entre la placa de crecimiento y el cartílago articular) ampliada en la Figura 3B muestra que esta dosis de tamoxifeno conduce a un nivel tan alto de recombinación en esta área que impediría el análisis clonal.
Figura 1: Visión general experimental. Diagrama de flujo que resume las etapas clave del método. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes de confeti de un ratón Col2CreERT:Confetti. (A) Las muestras de ratones Col2CreERT:Confetti se procesaron sin descalcificación ni el paso de almacenamiento a largo plazo. La sección central se localizó utilizando el ligamento cruzado como marcador. Esta imagen se visualizó mediante un escaneo de teselas después de detectar RFP con T-PMT (barra de escala a 300 m). (B) Las columnas clonales se muestran dentro de la tibia proximal de la placa de crecimiento visible en (A), después de la reconstrucción 3D. (C) Se procesó una diapositiva adyacente a la que se muestra en (A) y (B) en almacenamiento a largo plazo durante más de 3 años para la creación de imágenes y la reconstrucción 3D. RFP, YFP y CFP se muestran en (B) y (C) (Barras de escala a 50 m). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Desafíos al usar el método. (A) Las líneas discontinuas blancas delinean una división en la sección a través de la placa de crecimiento de los ratones Col2CreERT:Confetti (barra de escala de 50 m). El área dentro de la caja blanca se muestra en (B) (Barra de escala a 25 m). RFP, YFP y CFP se muestran en ambos paneles, y el canal de luz láser no reflejada (T-PMT) también se muestra en (A) para visualizar el tejido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Vídeo 1: Reconstrucción tridimensional de una placa de crecimiento de Col2CreERT: ratón confeti. Una diapositiva preparada a partir de un ratón Col2CreERT: Confetti se mantuvo en almacenamiento a largo plazo después de la sección durante más de 3 años, y luego se procesó para la toma de imágenes. La reconstrucción tridimensional se llevó a cabo automáticamente con un software de análisis de imágenes y se exportó como un vídeo. Haga clic aquí para descargar este video.
Archivo suplementario 1: Configuración típica del microscopio confocal. (A) Los principales controles presentes en la ficha Adquisición. (B-D) Los parámetros láser, la longitud de onda de excitación y el rango de longitudes de onda de emisión registradas se muestran para tres proteínas fluorescentes de confeti. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discussion
El modelo de confeti se utilizó ampliamente para estudiar los tejidos de cartílagomineralizados 12,13,14 y para describir el protocolo optimizado. Confeti ratones2 con una copia o dos copias del alelo R26R-Confetti se puede utilizar para la cría y experimentos. La recombinación en ratones con un alelo de la construcción Brainbow 2.1 dará cuatro etiquetas potenciales: proteína fluorescente roja (RFP, citlasmática), proteína fluorescente amarilla (YFP, citoplasma), proteína fluorescente cian (CFP, localizada por membrana) y verde proteína fluorescente (GFP, núcleo localizado), mientras que la recombinación en los ratones homocigotos de confeti (es decir, que contiene dos copias de la construcción Brainbow 2.1) dará 10 posibles salidas de color (RFP+RFP, RFP+YFP, RFP+CFP, RFP+GFP, YFP+YFP, YFP+CFP, YFP+ GFP, CFP+CFP, CFP+GFP, GFP+GFP). Sin embargo, debido a que los eventos de escisión e inversión del ADN ocurren de manera estocástica, la recombinación para producir GFP se produce sólo en una pequeña fracción de células, como se informó anteriormente2,y aparentemente difiere por tipo de célula o línea Cre utilizada2, 12,13. Por lo tanto, dada la baja ocurrencia de eventos de recombinación que conducen a la expresión GFP, seis salidas de color son las más comunes en ratones confeti homocigotos.
Una consideración importante a la hora de planificar experimentos con el ratón Confetti es encontrar una cepa Cre adecuada. En primer lugar, dado que el alelo de confeti tiene varios sitios loxP, un evento de recombinación no impide un segundo4. Esto significa que si una celda está etiquetada y se divide para producir un clon de un color, un segundo evento de recombinación en una de sus celdas hijas generaría un color diferente, enmascarando así la verdadera expansión clonal. Por lo tanto, no son aconsejables las cepas Cre no inducibles, donde la enzima siempre está activa si el promotor correspondiente está activo. En segundo lugar, en algunas cepas, la expresión de Cre recombinase a menudo se produce a expensas de una proteína endógena, creando así un fenotipo propio (por ejemplo, para la cepa de ratón Prg4-GFPCreERT2 en la que los ratones albergan dos alelos Cre15), por lo que una sola copia del alelo Cre es deseable. En todos los experimentos descritos, una sola copia del Col2CreERT16 fue llevada por el macho o el padre femenino para generar ratones Col2CreERT:Confetti, como se describe13. A continuación, la especificidad de la línea Cre al tipo de interés de celda es una consideración importante. Por ejemplo, Col2CreERT es específico de los condrocitos, pero etiqueta varias poblaciones distintas de condrocitos en el cartílago postnatal temprano17. Por último, la actividad de diferentes cepas de Cre puede cambiar considerablemente con la edad animal, ya que la actividad endógena del promotor utilizada para la expresión Cre cambia, incluso en células del mismo tipo (por ejemplo, Prg4-GFPCreERT2,que puede requerir un aumento número de dosis de tamoxifeno para etiquetar las células de la zona superficial como ratones de edad15).
El número de células etiquetadas se reflejará por la cantidad de tamoxifeno dado, por lo que no siempre es deseable dar la dosis máxima porque distinguir clones entre sí puede ser difícil. Debido a que la expresión de Cre variará bajo la regulación de diferentes promotores, así como con la edad, la dosis de tamoxifeno tendrá que ajustarse para optimizar el etiquetado. Es importante tener en cuenta que las células no son inmediatamente fluorescentes al desencadenar la recombinación porque se requiere tiempo para que se produzca la recombinación y las proteínas fluorescentes resultantes se acumulen lo suficiente para la toma de imágenes. Se necesita un amplio rango de horas (entre 24 y 72 h), que parece estar influenciada por la línea Cre, el tipo de célula y la edad animal. Dado que el tamoxifeno puede ser biológicamente activo mucho después de la administración18, siempre es aconsejable comprobar a fondo la eficiencia de la recombinación en cada modelo.
Durante el paso de microscopía confocal, la excitación de las proteínas fluorescentes Confetti requiere la penetración del tejido por luz láser. Debido a que diferentes tejidos tienen diferentes propiedades, la luz láser podría no penetrar secciones gruesas de 160 m de todos los tejidos. Sin embargo, tales secciones gruesas se pueden utilizar para el cartílago de la placa de crecimiento, como se utiliza en la Figura 2, Figura 3. Tenga en cuenta que cada microscopio es diferente, y es poco probable que los ajustes descritos(Archivo complementario 1) funcionen perfectamente sin ajustes menores. Uno de los principales desafíos es distinguir las diferentes proteínas fluorescentes para asegurar que no haya contaminación de un canal a otro. Por ejemplo, la señal en el canal YFP causada por la fluorescencia procedente de GFP se superpone entre los canales YFP y RFP. Los canales YFP y CFP también deben ser cuidadosamente revisados. Esto se puede hacer de varias maneras. En primer lugar, se puede reducir el rango de emisión de longitudes de onda de luz fluorescente que se registran para cada proteína fluorescente. En segundo lugar, ajustar la potencia del láser en combinación con la ganancia digital puede optimizar la señal. En este estudio estos pasos fueron suficientes, pero se basan en una señal fluorescente fuerte. Esto significa que, en teoría, el procesamiento ineficiente del tejido puede reducir la actividad de las proteínas fluorescentes, o una fuente de luz láser débil puede afectar la separación del canal.
Una de las ventajas del ratón Confetti es que se puede combinar con un gran número de cepas genéticamente mutantes que están disponibles para que el impacto de genes específicos en la dinámica clonal se pueda estudiar10,11,12 ,13,14,19,20, aunque con algunas limitaciones. Por ejemplo, la recombinación de los alelos de Confetti y el gen de interés no se puede separar cuando se utilizan mutantes basados en Cre loxP combinados con el trazado de linaje clonal. Sin embargo, tales eventos de recombinación coincidientes pueden ser efectivos10,14,20. Por ejemplo, esta posibilidad se utilizó para explorar el aumento del número celular en la zona de reposo de ratones después de la ablación específica de condrocitos postnatales de TSC1 en la placa de crecimiento21 y reveló la relación clonal entre estas células a lo largo del tiempo 13. Además, el análisis clonal específico del tejido con ratones Confetti se puede utilizar con ratones mutantes no basados en loxP11, y también es posible combinar estos enfoques confarmacológicos 8,9 ,13 y/o modelos quirúrgicos8 para visualizar respuestas clonales a otras perturbaciones funcionales. Otras oportunidades surgen al combinar secciones etiquetadas con confeti con inmunodetección de proteínas endógenas por inmunofluorescencia. Dicho análisis permite la identificación de células trazadas y su colocalocalización con un marcador conocido. Con el método de fijación descrito en el presente documento, es posible conducir inmunofluorescencia y visualizar aún la fluorescencia de las proteínas fluorescentes Confetti12,13. Sin embargo, en los documentos mencionados, la recuperación de antígenos no era necesaria. Los métodos de recuperación de antígenos duros, como la ebullición en el tampón de citrato, conducen a una pérdida completa de fluorescencia de confeti. Aunque las proteínas fluorescentes de confeti se pueden detectar mediante el uso de anticuerpos22,puede producirse una pérdida de identidad clonal.
En resumen, el uso del modelo Confetti para etiquetar celdas in vivo es una herramienta informativa para analizar el destino de esas celdas a lo largo del tiempo. El método descrito proporciona una manera rápida y eficiente de visualizar directamente la expresión de proteínas fluorescentes en tejidos mineralizados.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Evgeny Ivashkin por su asesoramiento metodológico. Este trabajo fue apoyado financieramente por el Consejo Sueco de Investigación (A.S.C), la Fundación Científica Rusa (subvención #19-15-00241 a ASC), el Instituto Karolinska (A.S.C.), StratRegen KI y Stiftelsen Konung Gustaf V:s 80-rsfond (A.S.C.), Stiftelsen Frimurare Barnhuset y Sallskapet Barnavard (P.T.N.), Consejo De Becas Chinas (B.Z.). El microscopio confocal fue financiado por la Fundación Knut y Alice Wallenberg.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,2-thiodiethanol | Sigma | MKCF9328 | |
| 60 mm-long cover slips | Mendel-Gläzer | 220588 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM 710 | |
| Corn oil | Sigma | C8267 | |
| Cryomold (standard) | Sakura | 4557 | |
| Cryostat | Thermo | Model: NX70 | |
| Disposable cryostat blades | Histolab | 207500014 | Specifically for use with hard tissue |
| EDTA | Scharlan | AC0960005P | |
| Formaldehyde concentrate | Merck | 8.18708.1000 | |
| Glass bottles | Sigma | V7130 | Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing |
| Imaris software | Oxford Instruments | N/A | Image analysis software for 3D reconstruction |
| Isoflurane | Zoetis | 11-8162 | |
| OCT | Sakura | 102094-104 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| PBS | Gibco | 14200075 | |
| Sodium hydroxide | Merck | 1.06498.1000 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Superfrost UltraPlus slides | Mendel-Gläzer | J3800AMNZ | |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Zen2 software | Zeiss | N/A | Freeware for Confocal laser scanning microscopy |
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