Denne metode beskriver brugen af den R26R-Confetti (Confetti) musemodel til at studere mineraliseret væv, der dækker alle trin fra avls strategien til billedet erhvervelse. Inkluderet er en generel protokol, der kan anvendes på alle bløde væv og en modificeret protokol, der kan anvendes til mineraliseret væv.
Mærkning en individuel celle i kroppen til at overvåge, hvilke celletyper det kan give anledning til og spore sin migration gennem organismen eller bestemme dens levetid kan være en kraftfuld måde at afsløre mekanismer for vævs udvikling og vedligeholdelse. Et af de vigtigste værktøjer, der i øjeblikket er til rådighed til at overvåge celler in vivo er Confetti musemodel. Confetti-modellen kan bruges til at genetisk mærke individuelle celler i levende mus med forskellige fluorescerende proteiner i en celletype specifik måde og overvåge deres skæbne, samt skæbnen for deres afkom over tid, i en proces, der kaldes klonal genetisk sporing eller klonal Lineage tracing. Denne model blev genereret for næsten et årti siden og har bidraget til en bedre forståelse af mange biologiske processer, især i forbindelse med stamcelle biologi, udvikling og fornyelse af voksne væv. Men at bevare det fluorescerende signal, indtil billed opsamling og samtidig opsamling af forskellige fluorescerende signaler er teknisk udfordrende, især for mineraliseret væv. Denne publikation beskriver en trinvis protokol til brug af Confetti-modellen til at analysere vækst pladens brusk, der kan anvendes på alle mineraliserede eller ikke-mineraliserede væv.
Forbedrede metoder til at overvåge celle adfærd er ønskeligt at øge den eksperimentelle effektivitet, når du bruger dyremodeller. En af de mest informative tilgange til at overvåge celle adfærd in vivo er klonal Lineage Tracing med multi farve reporter muse stammer1, herunder den udbredte R26R-Confetti (Confetti) mus2. Ved genetisk mærkning enkelte celler med fluorescerende proteiner og efter disse celler over tid, forskere på mange områder har brugt Confetti musen til at afsløre indsigt i en lang række forskellige biologiske systemer.
Confetti Mouse er et loxP-baseret reporter-system, hvor CRE-afhængig DNA-rekombination forårsager et permanent udtryk af et af flere mulige fluorescerende proteiner i en stokastisk måde2. R26R-Confetti-allelen omfatter den allestedsnærværende udtrykte CAGG-promotor, som ligger umiddelbart opstrøms for en loxP-flankeret neoR-kassette2, hvis polyadenylerings sekvens afslutter transkriptionen3, efterfulgt af Brainbow 2,1 konstruere4. Derfor, CRE-medieret rekombination samtidig exciserer neoR-kassetten og fører til produktion af visse fluorescerende proteiner afhængigt af hvilke dele af brainbow 2,1 konstruere er skåret. Denne funktion gør Confetti musen ekstremt tilpasningsdygtig, fordi den kan bruges til at målrette enhver cellulær population i en mus, hvor en specifik CRE stamme er til rådighed. Passage af en vævs specifik CRE stamme med R26R-Confetti stammen giver specificiteten af mærkning. Dog bør CRE stammen også være inducerbar (f. eks CreERT eller CreERT2, som kræver Tamoxifen binding for at give dem mulighed for at komme ind i kernen og inducere DNA rekombination5), så mærkningen kan opnås på bestemte tidspunkter. Således, en cellulær population kan mærkes ved at injicere den resulterende CreERT-positive/Confetti-positive afkom med Tamoxifen på det ønskede tidspunkt og spores til en vis alder, når væv af interesse kan indsamles til analyse. Efter vævs behandling kan de fluorescently mærkede celler direkte visualiseres ved Konfokal mikroskopi, således at afkom af hver oprindeligt mærkede celle kan adskilles fra afkom genereret af enhver anden mærket celle baseret på deres specifikke fluorescerende således at der kan foretages en vurdering af clonalitet (dvs. klonal genetisk sporing).
På grund af fleksibiliteten i Confetti modellen, er det blevet anvendt til at studere udvikling og vedligeholdelse af mange forskellige væv i sundhed og sygdom2,6,7,8,9, 10,11. En almindelig måde at bruge modellen på er at mærke en bestemt population af celler og bestemme, hvilket væv de (og/eller deres afkom) har bidraget til. En sådan konstatering ved hjælp af denne fremgangsmåde var, at den voksne tand består af celler med en gliaceller oprindelse6. En anden anvendelse af modellen er at studere stamcelle homøostase. For eksempel afslørede Confetti-modellen, at stamcelle nicher i de intestinale Krypter gradvist bliver monoklonale, fordi nogle stamcelle kloner er dominerende under konkurrencen mellem stamceller2. Modellen kan også bruges til at vurdere celle spredning, hvilket er særligt nyttigt til at studere langsomt dividere celler. For eksempel blev klonal dannelse i artikulær brusk12 vurderet, og de kortsigtede virkninger af en pindsvin antagonist på vækstpladen chondrocytter i fem-ugers gamle mus blev undersøgt13.
På trods af den relative enkelhed af Confetti-modellen kan det fluorescerende signal være teknisk udfordrende at bevare indtil Billedsamlingen, især når man analyserer mineraliseret væv. Her beskriver protokollen en optimeret model til at bruge Confetti-musen med den postnatale knogle (op til 6 måneders alderen), hvilket gør det muligt at visualisere fluorescerende proteiner direkte ved hjælp af konfokale mikroskopi uden behov for immunodetektion. Denne forenklede protokol kan anvendes på ikke-mineraliserede væv. Desuden er der en beskrivelse af, hvordan prøverne opbevares for at bevare det fluorescerende signal i en længere periode på mindst 3 år. En skitse til protokollen er præsenteret i figur 1.
Confetti-modellen blev anvendt i udstrakt grad til at studere mineraliseret brusk vævet12,13,14 og til at beskrive den optimerede protokol. Confetti-mus2 med en kopi eller to eksemplarer af R26R-Confetti-allelen kan bruges til avl og eksperimenter. Rekombination i mus med en allel af Brainbow 2,1 konstruere vil give fire potentielle etiketter: rødt fluorescerende protein (RFP, cytoplasmic), gult fluorescerende protein (YFP, cytoplasmic), cyan fluorescerende protein (FFP, membran-lokaliseret), og grøn fluorescerende protein (GFP, Nucleus-lokaliseret), hvorimod rekombination i homozygot Confetti-mus (dvs. med to eksemplarer af Brainbow 2,1-konstruktionen) giver 10 mulige farve udgange (RFP + RFP, RFP + YFP, RFP + FFP, RFP + GFP, yfp + YFP, YFP + FFP, YFP + GFP, DEN FÆLLES FISKERIPOLITIK + FFP, DEN FÆLLES FISKERIPOLITIK + GFP, GFP + GFP). Men fordi DNA excision og inversion hændelser forekommer i en stokastisk måde, rekombination til at producere GFP forekommer i kun en lille brøkdel af celler, som tidligere rapporteret2, og tilsyneladende adskiller sig fra celle-type eller CRE linje anvendes2, 12,13. I betragtning af den lave forekomst af rekombinationhændelser, der fører til GFP-udtrykket, er seks farve udgange de mest almindelige i homozygot Confetti-mus.
En vigtig overvejelse ved planlægning af eksperimenter med Confetti musen er at finde en passende CRE stamme. Først, da Confetti allel har flere loxp sites, en rekombination begivenhed udelukker ikke en anden4. Det betyder, at hvis en celle er mærket og opdeler til at producere en klon af en farve, en anden rekombination begivenhed i en af sine datter celler ville generere en anden farve, og dermed maskere den sande klonede ekspansion. Således er ikke-inducerbare CRE-stammer, hvor enzymet altid er aktivt, hvis den tilsvarende promotor er aktiv, ikke tilrådeligt. For det andet, i nogle stammer udtrykket af CRE rekombinase ofte kommer på bekostning af en endogene protein, og dermed skabe en fænotype af sin egen (f. eks, for Prg4-GFPCreERT2 Knock-in musestamme, hvor mus havn to CRE alleler15), så en enkelt kopi af CRE allel er ønskelig. I alle de beskrevne eksperimenter, en enkelt kopi af Col2CreERT16 blev båret af enten den mandlige eller den kvindelige forælder til at generere Col2CreERT: Confetti mus, som beskrevet13. Dernæst er specificiteten af CRE-linjen til celle typen af interesse en vigtig overvejelse. For eksempel, Col2CreERT er chondrocyte-specifikke, men etiketter flere forskellige populationer af chondrocytter i tidlig postnatal brusk17. Endelig kan aktiviteten af forskellige CRE-stammer ændre sig betydeligt med dyrenes alder, da den endogene aktivitet af arrangøren udnyttet til CRE-ekspressions ændringer, selv i celler af samme type (f. eks. Prg4-GFPCreERT2, hvilket kan kræve en stigende antal Tamoxifen doser til at mærke overfladiske zone celler som mus alder15).
Antallet af mærkede celler vil blive afspejlet af mængden af Tamoxifen givet, så det er ikke altid ønskeligt at give den maksimale dosis, fordi det kan være svært at skelne kloner fra hinanden. Fordi CRE udtryk vil variere i henhold til reguleringen af forskellige initiativtagere samt med alderen, Tamoxifen dosis skal justeres for at optimere mærkning. Det er vigtigt at bemærke, at cellerne ikke umiddelbart fluorescerende ved udløsning rekombination, fordi tiden er nødvendig for rekombination at forekomme og de resulterende fluorescerende proteiner til at akkumulere tilstrækkeligt til billeddannelse. En bred vifte af timer (mellem 24 − 72 h) er nødvendig, som synes at være påvirket af CRE linje, celle-type, og dyre alder. Da Tamoxifen kan være biologisk aktiv længe efter administration18 er det altid tilrådeligt at grundigt kontrollere rekombinationseffektivitet i hver model.
Under den konfokale mikroskopi trin, excitation af Confetti fluorescerende proteiner kræver penetration af vævet ved laserlys. Fordi forskellige væv har forskellige egenskaber, kan laserlys ikke trænge ind 160 μm tykke sektioner af alle væv. Dog kan sådanne tykke sektioner anvendes til vækst plade brusk, som anvendes i figur 2, figur 3. Bemærk, at hvert mikroskop er forskelligt, og det er usandsynligt, at de beskrevne indstillinger (supplerende fil 1) vil fungere perfekt uden mindre justeringer. En af de største udfordringer er at skelne mellem de forskellige fluorescerende proteiner for at sikre, at der ikke er kontaminering fra den ene kanal til den anden. F. eks. overlapper signalet i YFP-kanalen, som er forårsaget af fluorescensen fra GFP, mellem YFP-og RFP-kanalerne. Kanalerne i YFP og den fælles fiskeripolitik skal også kontrolleres nøje. Dette kan gøres på flere måder. For det første, emissions intervallet af fluorescerende lys bølgelængder, der er registreret for hvert fluorescerende protein kan indsnævret. For det andet, justering af laser kraft i kombination med den digitale gevinst kan optimere signalet. I denne undersøgelse var disse trin tilstrækkelige, men de er afhængige af et stærkt fluorescerende signal. Det betyder, at ineffektiv vævs behandling i teorien kan reducere aktiviteten af de fluorescerende proteiner, eller en svag laserlyskilde kan forringe kanal separationen.
En af fordelene ved Confetti-musen er, at den kan kombineres med et stort antal genetisk mutante stammer, der er tilgængelige, så virkningen af specifikke gener på klonal dynamik kan undervises10,11,12 ,13,14,19,20, omend med nogle begrænsninger. For eksempel kan rekombination af Confetti alleler og Genets interesse ikke adskilles ved brug af CRE loxP-baserede mutanter kombineret med klonal Lineage tracing. Ikke desto mindre, sådanne sammenfaldende rekombination begivenheder kan være effektiv10,14,20. For eksempel blev denne mulighed brugt til at udforske det øgede celle nummer i hvile zonen for mus efter postnatal chondrocyte-specifik ablation af TSC1 i vækstpladen21 og afslørede det klonale forhold mellem disse celler over tid 13. Derudover kan den vævsspecifikke klon analyse ved hjælp af Confetti-mus anvendes med ikke-CRE loxp-baseret mutant mus11, og det er også muligt at kombinere disse tilgange med farmakologiske8,9 ,13 og/eller kirurgiske modeller8 for at visualisere klonale responser på andre funktionelle forstyrrelser. Der opstår yderligere muligheder ved kombination af Confetti-mærkede sektioner med immunodetektion af endogene proteiner ved hjælp af immunofluorescens. En sådan analyse gør det muligt at identificere sporede celler og deres samlokalisering med en kendt markør. Med fikserings metoden beskrevet heri er det muligt at gennemføre immunofluorescens og stadig visualisere fluorescensen fra konfetti fluorescerende proteiner12,13. I de nævnte papirer var det imidlertid ikke nødvendigt at hente antigen. Barske antigen genfinding metoder, såsom kogning i citratbuffer, fører til et fuldstændigt tab af Confetti fluorescens. Selv om konfetti fluorescerende proteiner kan detekteres ved hjælp af antistoffer22, kan der forekomme tab af klonal identitet.
Sammenfattende, ved hjælp af Confetti model til at mærke celler in vivo er et informativt værktøj til at analysere skæbnen for disse celler over tid. Den beskrevne metode giver en hurtig og effektiv måde at direkte visualisere fluorescerende protein udtryk i mineraliseret væv.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Evgeny Ivashkin for metodologisk rådgivning. Dette arbejde blev støttet finansielt af det svenske Forskningsråd (A. S. C), det russiske videnskabelige Institut (Grant #19-15-00241 til ASC), Karolinska instituttet (A.S.C.), StratRegen KI og stiftelsen Konung Gustaf V:s 80-årsfond (A.S.C.), stiftelsen Frimurare barnhuset og sallskapet Barnavard (P.T.N.), kinesisk stipendie Råd (B.Z.). Confokal mikroskop blev finansieret af Knut og Alice Wallenberg Foundation.
2,2-thiodiethanol | Sigma | MKCF9328 | |
60 mm-long cover slips | Mendel-Gläzer | 220588 | |
Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM 710 | |
Corn oil | Sigma | C8267 | |
Cryomold (standard) | Sakura | 4557 | |
Cryostat | Thermo | Model: NX70 | |
Disposable cryostat blades | Histolab | 207500014 | Specifically for use with hard tissue |
EDTA | Scharlan | AC0960005P | |
Formaldehyde concentrate | Merck | 8.18708.1000 | |
Glass bottles | Sigma | V7130 | Can be used for tamoxifen dilution and for tissue fixation and processing |
Imaris software | Oxford Instruments | N/A | Image analysis software for 3D reconstruction |
Isoflurane | Zoetis | 11-8162 | |
OCT | Sakura | 102094-104 | |
Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
PBS | Gibco | 14200075 | |
Sodium hydroxide | Merck | 1.06498.1000 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Superfrost UltraPlus slides | Mendel-Gläzer | J3800AMNZ | |
Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
Zen2 software | Zeiss | N/A | Freeware for Confocal laser scanning microscopy |