Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

बड़े पैमाने पर परमाणु इंटरैक्टूम प्रोफाइलिंग के लिए लेबल-फ्री इम्यूनोप्रिसिप्रिशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री वर्कफ्लो

Published: November 17, 2019 doi: 10.3791/60432
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado, 2Linda Crnic Institute for Down Syndrome, University of Colorado School of Medicine

Summary

वर्णित ब्याज और लेबल मुक्त द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री के दिए गए प्रोटीन के इम्यूनोफिनिटी संवर्धन का उपयोग करके परमाणु उपसे्युलर अंश से प्रोटीन इंटरैक्शन भागीदारों की पहचान करने के लिए एक प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो है। कार्यप्रवाह में उपसेलर आंशिकता, इम्यूनोप्रिसिपेटेशन, फिल्टर एडेड नमूना तैयार करना, ऑफलाइन सफाई, मास स्पेक्ट्रोमेट्री और डाउनस्ट्रीम बायोइन्फॉर्मेटिक्स पाइपलाइन शामिल है।

Abstract

इम्यूनोफिनिटी शुद्धि मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईपी-एमएस) प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की पहचान करने की एक मजबूत मात्रात्मक विधि के रूप में उभरा है। यह प्रकाशन नाभिक से कम बहुतायत प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए डिज़ाइन किया गया एक पूर्ण इंटरैक्शन प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो प्रस्तुत करता है जिसे अन्य उपकोशिकीडिब्बों पर भी लागू किया जा सकता है। इस कार्यप्रवाह में उपसे्युलर आक्षेप, इम्यूनोप्रिसिपेटेशन, नमूना तैयारकरना, ऑफलाइन सफाई, सिंगल-शॉट लेबल-फ्री मास स्पेक्ट्रोमेट्री, और डाउनस्ट्रीम कंप्यूटेशनल एनालिसिस और डेटा विज़ुअलाइज़ेशन शामिल हैं। हमारे प्रोटोकॉल को विभाजित, कम बहुतायत इंटरैक्शन का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जाता है जो पूरे सेल लाइसेट्स (जैसे, नाभिक में प्रतिलेखन कारक इंटरैक्शन) से एंडोजेनस प्रोटीन के इम्यूनोप्रिप्रिमिटेशन द्वारा पहचानना मुश्किल है आंशिक उपकोशिकीय डिब्बे। यहां उल्लिखित नमूना तैयारी पाइपलाइन हेला सेल परमाणु अर्क, एंडोजेनस चारा प्रोटीन की इम्यूनोफिनिटी शुद्धि, और मात्रात्मक जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण की तैयारी के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करती है। हम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित इंटरैक्शन प्रोफाइलिंग प्रयोगों में बड़े पैमाने पर इम्यूनोप्रिसिप्रिशन करने के लिए पद्धतिगत विचारों पर भी चर्चा करते हैं और सच्चे सकारात्मक प्रोटीन को अलग करने के लिए डेटा गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए दिशानिर्देश प्रदान करते हैं गैर-विशिष्ट बातचीत से बातचीत। इस दृष्टिकोण को यहां सीएमजीसी काइनेस, DYRK1A, नाभिक के भीतर खराब परिभाषित बातचीत के साथ एक कम बहुतायत प्रोटीन kinase के परमाणु बातचीत की जांच करके प्रदर्शित किया जाता है ।

Introduction

मानव प्रोटेम स्थिर बहुउपइकाई परिसरों और क्षणिक प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के गठन के माध्यम से विशाल संरचनात्मक और जैव रासायनिक विविधता प्रदर्शित करता है। तदनुसार, आणविक तंत्र को जानने के लिए जांच में ब्याज के प्रोटीन के लिए इंटरैक्शन पार्टनर्स की पहचान आमतौर पर जरूरी होती है । आत्मीयता शुद्धिकरण प्रोटोकॉल में हाल ही में प्रगति और उच्च संकल्प तेजी से स्कैनिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री इंस्ट्रूमेंटेशन के आगमन ने एक ही निष्पक्ष प्रयोग में प्रोटीन इंटरैक्शन परिदृश्य की आसान मैपिंग को सक्षम किया है।

प्रोटीन इंटरैक्शन प्रोटोकॉल आमतौर पर एक्टोपिक एक्सप्रेशन सिस्टम को एफ़िनिटी-टैग किए गए फ्यूजन के साथ काम करते हैं, जो उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी की आवश्यकता के बिना प्रोटीन इंटरैक्शन की पहचान करने के लिए बनाए जाते हैं, जो ब्याज के प्रोटीन को पहचानते हैं1,2। हालांकि, एपिटोप टैग-आधारित तरीकों में कई कमियां हैं। एपिटोप के साथ शारीरिक बातचीत से गैर विशिष्ट संवादेने वाले प्रोटीन का पता लगाया जा सकता है3. इसके अतिरिक्त, प्रोटीन के एन-या सी-टर्मिनल के लिए इन एपिटोप टैग का संलयन देशी प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को अवरुद्ध कर सकता है, या गैर-शारीरिक संरचनाओं को बढ़ावा देने के लिए प्रोटीन तह को बाधित कर सकता है4। इसके अलावा, एक्टोपिक अभिव्यक्ति प्रणाली आमतौर पर सुप्राफिजिकल सांद्रता पर चारा प्रोटीन को ओवरएक्सप्रेस करती है, जिसके परिणामस्वरूप विशेष रूप से खुराक-संवेदनशील जीन5के लिए आर्टितथ्यात्मक प्रोटीन इंटरैक्शन की पहचान हो सकती है। इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, एंडोजेनस चारा प्रोटीन को संबंधित बातचीत शिकार प्रोटीन के साथ इम्यूनोप्रीप्रिटिमिट किया जा सकता है, जो देशी प्रोटीन को पहचानता है कि एक उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी की उपलब्धता को मानते हुए।

बशर्ते यहां एक उदाहरण के रूप में CMGC प्रोटीन kinase DYRK1A का उपयोग कर एक अंतर्जात प्रोटीन के परमाणु इंटरैक्प्रोम का पता लगाने के लिए एक बातचीत प्रोटेओमिक्स कार्यप्रवाह है । DYRK1A कॉपी नंबर, गतिविधि स्तर, या अभिव्यक्ति के व्यवधान मनुष्यों में गंभीर बौद्धिक विकलांगता पैदा कर सकता है, औरचूहों6,7,8,9में भ्रूण घातकता । DYRK1A गतिशील स्थानिक विनियमन10,और विभाजित प्रोटीन इंटरैक्शन11,12को प्रदर्शित करता है, जिसमें विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बों के लिए विशिष्ट कम बहुतायत इंटरैक्शन पार्टनर्स का पता लगाने में सक्षम दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है।

यह प्रोटोकॉल मानव वाला कोशिकाओं के सेलुलर अंश को साइटोसोल और न्यूक्लियोप्लाज्म अंशों, इम्यूनोप्रिसिप्रिशन, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूना तैयार करने और डेटा की गुणवत्ता के मूल्यांकन और परिणामों की कल्पना के लिए बायोइन्फॉर्मेटिक पाइपलाइन का अवलोकन करता है, जिसमें विश्लेषण और दृश्य(चित्रा 1)के लिए प्रदान की गई आर लिपियों केसाथ। इस कार्यप्रवाह में उपयोग किए जाने वाले प्रोटेओमिक्स सॉफ्टवेयर पैकेज डाउनलोड के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध हैं या वेब इंटरफेस के माध्यम से पहुँचा जा सकता है। सॉफ्टवेयर और कम्प्यूटेशनल विधियों के बारे में अतिरिक्त जानकारी के लिए, प्रदान किए गए लिंक पर गहन ट्यूटोरियल और अनुदेश उपलब्ध हैं।

Protocol

नोट: सभी बफर रचनाएं और प्रोटीज़ मिश्रण तालिका 1में उल्लिखित हैं।

1. कोशिकाओं की तैयारी

नोट: इस इम्यूनोप्रिसिप्रिशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईपी-एमएस) दृष्टिकोण के लिए प्रति दोहराने वाली 1−10 मिलीग्राम परमाणु ऊर्जा की शुरुआती सामग्री वांछित है। त्रिप्लीकेट प्लस ट्रिपलिकेट नियंत्रण में 1 मिलीग्राम परमाणु इम्यूनोप्रिसिप्रिशन के लिए सेल मात्रा दी जाएगी।

  1. यदि एक अनुयायी सेल लाइन का उपयोग कर, कटाई से पहले प्रति दोहराने के प्रति 3 x 15 सेमी व्यंजन में 90% प्रवाह के लिए कोशिकाओं को विकसित करें।
    नोट: चारा और नियंत्रण की स्थिति के लिए कम से कम तीन दोहराने वाले इम्यूनोप्रिसिप्रिशन करने की सिफारिश की जाती है। यह प्रोटोकॉल 'मोतियों के केवल' नियंत्रणों का उपयोग मान लेगा, जो धारा 4 से शुरू होने वाले मोतियों के साथ प्रचुर मात्रा में गैर-विशिष्ट बातचीत के लिए नियंत्रण करते हैं। अन्य प्रकार के नियंत्रण उपयोगी हो सकते हैं। इन्हें चर्चा अनुभाग में गहराई से वर्णित किया गया है।
    1. फॉस्फेट बफर्ड लवइन (पीबीएस) के साथ प्लेट2x धोएं और प्रति 15 सेमी प्लेट 0.25% ट्रिप्सिन के 3 मिलील का उपयोग करके कोशिकाओं को ट्रिपसिनाइज करें। 5 मिन के लिए 1,200 x ग्राम पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें और ट्राइप्सिन को डिडेंट करें।
  2. निलंबन कोशिकाओं के लिए, कुल प्रोटीन के 70−80 मिलीग्राम प्राप्त करने के लिए समान पैमाने/घनत्व तक बढ़ें।
    1. 5 मिनट के लिए 1,200 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर पैलेट सेल।
      नोट: छर्रों को इस चरण के दौरान जोड़ा जा सकता है ताकि धारा 2 में उल्लिखित बड़े पैमाने पर उपकोशिकीय अंशका उपयोग करके कुशल प्रसंस्करण को सक्षम किया जा सके।
  3. सेल पैलेट 2x को पीबीएस + 5 एमएम एमजीसीएल2 के साथ धोएं प्रोटीज़ अवरोधक (पीआईएस) और फॉस्फेटेज़ अवरोधक (पीएचआई) (तालिका 1देखें)।
    नोट: सेल छर्रों तरल नाइट्रोजन में जमे हुए फ्लैश हो सकता है और अंश के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।

2. परमाणु निकालने की तैयारी

नोट: प्रोटीज़ और फॉस्फेटेज़ अवरोधकों को उपयोग के 30 मिनट के भीतर आंशिकन बफ़र्स में जोड़ा जाना चाहिए।

  1. यदि जमे हुए हैं, तो कोल्ड बफर ए + पीआईएस/पीएचआई के 1x पैलेट वॉल्यूम में 15 मिन के लिए सेल छर्रों को पिघलाएं । सेल पैलेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर न्यूएटर पर रखें ताकि विगलन करते समय पुनर्सस्पेंशन में सहायता की जा सके। अन्यथा, सेल पैलेट को चरण 1.3 से 1x पैलेट वॉल्यूम बफर ए + पीआईएस/
    1. 10 000 x g पर गोली और 10 मीटर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस । बफर को डिडेंट।
  2. 5x के साथ कोशिकाओं को बफर ए के साथ पैक सेल की मात्रा को निलंबित करें और 20 मिन के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
  3. 10 000 x g और 10 mके लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर गोली। बफर को डिडेंट करें और 2x ओरिजनल पैक्ड सेल वॉल्यूम बफर ए + पीआईएस के साथ रिसस्पेंड करें और "ए"/लूज मूसल के साथ ~ 7x को छोड़ दें ।
  4. 2,000 x जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए मुख्याचारित।
  5. ध्यान से तरल नाइट्रोजन के साथ अलौकिक और फ्लैश फ्रीज बंद पिपेट करें। लाइसेट को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इस चरण से अधिस्थान साइटोसोलिक उपकोशिकीय अंश है।
    नोट: परमाणु गोली तरल नाइट्रोजन के साथ फ्लैश ठंड और-८० डिग्री सेल्सियस पर भंडारण द्वारा इस कदम के दौरान बचाया जा सकता है
  6. बफर बी + पीआईएस/पीएचआई की 0.9 x पैलेट वॉल्यूम के साथ पैलेट को फिर से सस्पेंड करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए एक न्यूलेटर पर मिलाएं ।
  7. नाभिक को लायसे करने के लिए, एक सख्त मूसल "बी" के साथ 20x को छोड़ दें।
  8. न्यूक्लियर लिएट को 30 मिन के लिए न्यूट्राटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर मिलाएं ताकि यह समरूप हो।
  9. 30 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 21,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। सुपरनेट बंद पिपेट और एक घुलनशील परमाणु प्रोटीन निकालने के रूप में बचाने के लिए ।
    नोट: जिसके परिणामस्वरूप परमाणु गोली के Nuclease उपचार एक क्रोमेटिन से जुड़े प्रोटीन अंश की वसूली के लिए अनुमति देता है ।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए बफर सी + पीआईएस के खिलाफ घुलनशील परमाणु अर्क को डायलिज़ करें।
    1. 8 केडीए आणविक वजन काटके के साथ 24 मिमी चौड़ाई डायलिसिस ट्यूबिंग की उचित लंबाई में कटौती करें। ट्यूबिंग के एक तरफ क्लैंप और ट्यूब में नाभिकप्लाज्म लोड। लाइसेट लोड करने के बाद, दूसरे छोर को क्लैंप करें और बफर सी + पीआईएस वाले एक साफ ग्लास कंटेनर में डूब जाएं।
  11. सेंट्रलाइज 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 21,000 x ग्राम पर 21,000 x ग्राम पर डायलिज्ड न्यूक्लियर एक्सट्रैक्ट/न्यूक्लियोप्लाज्म। 3x 20 माइक्रोन वॉल्यूम वेस्टर्न ब्लॉट द्वारा आंशिकता सत्यापन के लिए न्यूक्लियर एक्सट्रैक्ट की मात्रा। आईपी-एमएस विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले परमाणु उद्धरण को तरल नाइट्रोजन में जम कर फ्लैश किया जा सकता है और यदि आवश्यक हो तो -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

3. उपकोशिकीय अंशका सत्यापन

  1. परमाणु ऊर्जा की प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एक प्रोटीन परख को पूरा करें। एक बिकिरोनिक एसिड प्रोटीन परख डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता प्रदान करता है।
  2. पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए एक एसडीएस-पेज जेल पर साइटोसोलिक और परमाणु दोनों अंशों का लोड 20 μg जैसा कि पहलेवर्णित 13था। एक नमूने के गलत चरित्र से बचने के लिए लोड हो रहा है जब गलियों छोड़ें।
  3. एक परमाणु मार्कर के रूप में p84 (THOC1) के लिए पश्चिमी दाग की जांच करें, और एक साइटोसोलिक मार्कर के रूप में GAPDH । परमाणु अंश में साइटोसोलिक मार्कर के अनुपात से अंशीकरण की सीमा निर्धारित करें और इसके विपरीत।
    नोट: अन्य परमाणु और साइटोसोलिक मार्कर के लिए एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है।

4. एंडोजेनस न्यूक्लियर चारा प्रोटीन का इम्यूनोप्रिमिटिंग

नोट: इस बिंदु से कम प्रतिधारण ट्यूबों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। इससे सैंपल हैंडलिंग के दौरान ट्यूबों को गैर-विशिष्ट बाध्यकारी कम किया जा सकेगा और सैंपल के अनावश्यक नुकसान से बचा जा सकेगा। इसके अतिरिक्त, सुनिश्चित करें कि शेष चरणों के लिए बफ़र्स तैयार करने के लिए एलसीएमएस ग्रेड एच2ओ का उपयोग किया जाता है।

  1. माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूबमें प्रोटीन-ए और प्रोटीन-जी दोनों के लिए बीड वॉल्यूम के १२.५ माइक्रोन को मिलाकर प्रत्येक दोहराने के लिए प्रोटीन ए/जी बीड मिश्रण तैयार करें । 20% इथेनॉल वाले घोल के रूप में बीड स्टॉक स्टोर करें। घोल % (v/v) के भीतर मोतियों की एकाग्रता निर्धारित करें और एक पिपेट टिप का उपयोग करके आवश्यक मात्रा को पिपेट करें जिसे टिप पर काटा गया है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि मोती टिप में प्रवेश कर सकते हैं।
  2. आईपी बफर 1 के 300 माइक्रोन के साथ प्रोटीन ए/जी बीड मिक्सचर 2x को धो लें। 1 मिन और डेजेंट बफर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,500 x ग्राम पर मोतियों को स्पिन करें।
  3. एंटीबॉडी-प्रोटीन ए/जी मोतियों को तैयार करें: मोतियों में एंटीबॉडी को बांधने के लिए, इच्छित एंटीबॉडी के आईपी बफर 1 और 10 माइक्रोन के 300 माइक्रोन जोड़ें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक न्यूलेटर पर चट्टान के लिए बीड/एंटीबॉडी मिश्रण की अनुमति दें। केवल बीड-केवल नियंत्रण के लिए, किसी भी एंटीबॉडी को न जोड़ें।
    नोट: प्रति दोहराने के प्रति एंटीबॉडी के कुल 10 μg एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन सटीक राशि के लिए प्रत्येक व्यक्ति एंटीबॉडी और प्रयोग में इस्तेमाल lysate के पैमाने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी
  4. परमाणु एक पानी के स्नान में चरण २.१० से गल और प्रति दोहराने के लिए 1 मिलीग्राम प्रोटीन इनपुट के लिए कम प्रतिधारण माइक्रोसेंरिफ्यूज ट्यूबों में उचित मात्रा में aliquot ।
    1. 30 मिन के लिए 16,000 x ग्राम पर लाइसेट स्पिन करें और सुपरनेट को एक नई ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
    2. 10−15 मीटर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक न्यूलेटर पर 1 मिलीग्राम न्यूक्लियर लिसैट और रॉक पर बेंजोनेज (250 यूनिट/माइक्रोन) का 1 माइक्रोन जोड़ें।
  5. लाइसेट को प्रीक्लियर करने के लिए मोतियों को तैयार करें। चरण 4.1 में 1.5 मीटर कम प्रतिधारण ट्यूबों में प्रत्येक प्रोटीन ए और प्रोटीन जी मोतियों के 12.5 माइक्रोन जोड़ें। आईपी वॉश बफर 1+ पीआईएस के साथ 2x धोएं और बफर को डिडेंट कर दें।
  6. चरण 4.5 से मोतियों में 1 मिलीग्राम परमाणु ऊर्जा डालें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक पोषक पर कमाल करते हुए इनक्यूबेट।
    1. सेंट्रलाइज 1,500 x ग्राम और 1 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पहले से साफ लाइसेट्स।
    2. जबकि परमाणु लाइकेट्स चरण 4.5.1 में मोतियों के साथ इनक्यूबेटिंग कर रहे हैं, आईपी बफर 1 + पीआईएस के साथ एंटीबॉडी-प्रोटीन ए/जी मोतियों को धोएं। 1,500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और 1 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और बफर को डेडेंट करता है।
  7. प्रीक्लियरेड न्यूक्लियर लाइसेट को स्टेप 4.6.1 से एंटीबॉडी-प्रोटीन ए/जी मोतियों पर ट्रांसफर करें। 4 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक न्यूट्रेटर पर कमाल करते हुए इनक्यूबेट 1,500 x g और 1 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के बाद।
  8. प्रत्येक दोहराने के लिए प्रवाह के रूप में लेबल ट्यूबों में अधिनैचन स्थानांतरित करें।
  9. एंटीबॉडी-प्रोटीन ए/जी मोतियों को आईपी बफर 2+ पीआईएस के 1 mL के साथ धो लें । 1,500 x जी पर अपकेंद्रित्र और 1 मिन, डेजेंट बफर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, और कुल 3x के लिए दोहराएं।
  10. पिछले चरण की तरह आईपी बफर 1+ पीआईएस सेंट्रलाइजिंग के 1 मिलील के साथ मोतियों 2x को धोएं। सुनिश्चित करें कि अंतिम धोने के बाद सभी बफर हटा दिए जाएं।
  11. 30 मिन प्रत्येक के लिए 0.1 एम ग्लाइसिन (पीएच 2.75) के 20 माइक्रोन के साथ Elute 2x। सुनिश्चित करें कि ट्यूब एल्यूशन बफर के साथ ऊष्मायन के दौरान कमाल कर रहे हैं। प्रत्येक 30 मिन ऊष्मायन के बाद सुपरनेटेंट से 750 x g और 1 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें।
    नोट: जबकि यहां वर्णित कम पीएच ग्लाइसिन विधि सबसे चारा प्रोटीन को कमजोर करती है, कुछ एंटीबॉडी-एंटीजन इंटरैक्शन को अधिक कठोर बफर शर्तों की आवश्यकता होती है।
  12. फ्लैश फ्रीज तरल नाइट्रोजन में eluates और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

5. नमूना तैयारी

नोट: इम्यूनोप्रिसिपिटेशन एलुशन नमूनों में नुकीला इंसुलिन ट्राइक्लोरोसेटिक एसिड (टीसीए) वर्षा और नमूना प्रसंस्करण के दौरान प्रोटीन की वसूली में एड्स करता है, जो कम बहुतायत एंडोजेनस चारा प्रोटीन के लिए महत्वपूर्ण है।

  1. जमे हुए होने पर कमरे के तापमान पर एलुएट्स गल।
    1. नमूनों को बर्फ पर रखें और एल्यूएट के हर 100 माइक्रोन के लिए 1.0 मिलीग्राम/mL इंसुलिन के 10 माइक्रोन जोड़ें। भंवर और फिर तुरंत 1% सोडियम deoxycholate के 10 μL जोड़ें। भंवर नमूना फिर से और 20% TCA के 30 μL जोड़ने के बाद एक अंतिम भंवर ।
    2. 20 मिन के लिए बर्फ पर नमूनों को इनक्यूबेट करते हैं, फिर 30 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 21,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    3. अधिष्णकता को एस्पिरेट करें और एसीटोन का 0.5 मिलील जोड़ें जिसे -20 डिग्री सेल्सियस तक प्रीचिल किया गया है। भंवर और फिर 30 00 00 0 00 0 00 0 0 0 0 और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें इस कदम को दोहराएं।
    4. अलौकिक और हवा ट्यूब के नीचे शेष गोली सूखी।
  2. 14से नीचे उल्लिखित नमूना हैंडलिंग को कम करने के लिए अनुकूलित संशोधित फ़िल्टर एडेड नमूना तैयारी (एफएएसपी) विधि का उपयोग करके बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूना तैयार करें।
    1. एसडीएस अल्किलेशन बफर के 30 माइक्रोन के साथ चरण 5.1.4 से प्रोटीन पैलेट को फिर से निलंबित करें (तालिका 1देखें)। 5 मिन के लिए 95 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक पर सैंपल इनक्यूबेट करें। इसे अगले चरण से पहले 15 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर ठंडा होने दें।
    2. प्रत्येक नमूने में यूए समाधान के 300 माइक्रोन और 100 एम टीसीईपी के 30 माइक्रोन जोड़ें। इस समाधान को 30k अपकेंद्रित्र फिल्टर पर लोड करें। 10 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर 21,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र फिल्टर स्पिन।
      नोट: चारा प्रोटीन और उसके ख्यात इंटरएक्टर्स को इस बिंदु पर फिल्टर से बाध्य होना चाहिए। हालांकि, प्रवाह के माध्यम से रखा जा सकता है, मामले में फिल्टर के साथ एक समस्या है ।
    3. 10 मिन के लिए 21,000 x ग्राम पर यूए और अपकेंद्रित्र के 250 माइक्रोन के साथ फिल्टर धोएं। कुल 3x के लिए प्रवाह को डिडेंट करें और दोहराएं।
    4. 100 एम ट्रिस पीएच 8.5 के 100 माइक्रोन के साथ फिल्टर धोएं और 10 मिन के लिए 21,000 x ग्राम पर अपकेंद्री हैं। कुल 3x के लिए प्रवाह को डिडेंट करें और दोहराएं।
    5. 0.1 एम ट्रिस पीएच 8.5 में 1 μg/μL Lys सी के 3 μL जोड़ें। फिल्टर को 100 माइक्रोन मार्क तक भरें और एक न्यूलेटर पर कमाल करते समय 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए पचाने की अनुमति दें।
    6. 1 μg/μL एमएस ग्रेड ट्राइप्सिन के 1 μL जोड़ें । धीरे-धीरे मिलाएं और न्यूलेटर पर कमाल करते समय ट्राइप्सिन को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने के साथ इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
    7. फिल्टर से पेप्टाइड को एलिट करने के लिए 20 मिन के लिए 21,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें।
      नोट: सभी एल्यूएट को ठीक करने के लिए सेंट्रलाइज्ड के कई राउंड की आवश्यकता हो सकती है। यदि ऐसा नहीं किया जाता है, तो गंभीर नमूना हानि की संभावना है।
  3. C18 स्पिन कॉलम का उपयोग करपेटाइड्स को डिसाल्ट करें। निर्माता द्वारा प्रदान किए गए प्रोटोकॉल का पालन करें।
  4. 5% एसीटॉनिट्रिल में 0.1% टीएफए के 7 माइक्रोन में लिओफिलेइज्ड पेप्टाइड को फिर से सस्पेंड करें। 3 मिन के लिए नमूना सोनीकेट यह सुनिश्चित करने के लिए कि पेप्टाइड्स को फिर से निलंबित कर दिया गया है। 10 मिन के लिए 14,000 x ग्राम पर नीचे स्पिन।
  5. तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी/एमएस) प्रणाली पर लोड करने के लिए पुनर्निलंबित पेप्टाइड को एक उपयुक्त नमूना शीशी में स्थानांतरित करें।

6. एलसी/एमएस सिस्टम उपयुक्तता

नोट: छोटे पैमाने पर और आम तौर पर आत्मीयता शुद्ध नमूनों से प्रोटीन की कम बहुतायत के कारण, यह महत्वपूर्ण है कि एलसी/एमएस मंच एक अधिकतम संवेदनशीलता और मजबूती पर संचालित होता है ।

  1. मोबाइल फेज ए के लिए एलसी/एमएस ग्रेड वाटर के 1 एल में एलसी/एमएस ग्रेड फोरमिक एसिड का 1 एल जोड़ें और मोबाइल फेज बी के लिए एलसी/एमएस ग्रेड एसिटोनिट्रिल के 1 एल में एलसी/एमएस ग्रेड फोरमिक एसिड का 1 एल जोड़ें ।
  2. तैयार करें या स्थापित करें 75 माइक्रोन फ्यूज्ड-सिलिका केशिका कॉलम को <2 μm रिवर्स-फेज C18 राल से पैक किया गया है जो लंबाई में 250 मिमी है। सबसे अच्छा परिणाम कॉलम में नमूनों के एक प्रत्यक्ष इंजेक्शन के साथ किया जाएगा ।
  3. ताजा मोबाइल चरणों के साथ अल्ट्रा परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (यूपीएलसी) सिस्टम को शुद्ध करें। स्थापित C18 कॉलम के साथ, एक उपयुक्त उत्सर्जक (यानी, 20 माइक्रोन आईडी x 360 माइक्रोन ओडी को 10 माइक्रोन टिप पर खींचा गया) के साथ एक स्थिर प्रवाह दर और इलेक्ट्रोस्प्रे स्थापित करें। कॉलम को 40−60 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें।
  4. एक जटिल गुणवत्ता नियंत्रण मानक इंजेक्शन द्वारा समग्र एलसी/एमएस प्रणाली प्रदर्शन का परीक्षण करें, जैसे कि एक वाघेला पूरी कोशिका के 100−200ng lysate ट्रिप्टिक डाइजेस्ट। एक जटिल नमूने (यानी, 2−3 एच ढाल एल्यूशन समय) के लिए एक उपयुक्त ढाल के साथ Elute। पेप्टाइड और प्रोटीन पहचान का एक बेसलाइन सिस्टम प्रदर्शन स्थापित करें।
    नोट: सर्वश्रेष्ठ परिणामों के लिए, 20,000−35,000 अद्वितीय पेप्टाइड्स से 3,000−5,000 या अधिक प्रोटीन पहचान प्रायोगिक नमूनों के लिए इष्टतम प्रदर्शन प्रदान करेगी।
  5. रूटीन एलसी/एमएस सिस्टम उपयुक्तता के लिए, गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) जैसे एक प्रोटीन डाइजेस्ट मानक के 100−200 एफमोल या उससे कम का इंजेक्शन दें। एक छोटी ढाल के साथ एल्यूट (यानी, 20−30 0 0 0) ।
    नोट: एक प्रोटीन डाइजेस्ट के कई इंजेक्शन बेसलाइन LC/MS प्रणाली प्रदर्शन स्थापित करने में मदद मिलेगी, और दोहराने इंजेक्शन के बाद प्रत्येक आईपी एमएस नमूना प्रयोग भर में प्रणाली के प्रदर्शन का एक उपाय प्रदान करता है और साधन बहाव का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, जो लेबल मुक्त प्रयोगों पूर्वाग्रह कर सकते हैं । चुनिंदा व्यक्तिगत चोटी की तीव्रता और चोटी के आकार का एक आधार रेखा एमएस, एलसी और कॉलम प्रदर्शन पर सूचित करेगी।
  6. विश्लेषणात्मक स्तंभ को ओवरलोड करने से बचने के लिए, कॉलम पर एक प्रयोगात्मक नमूने का एक छोटा सा हिस्सा (कुल का 15−30%) लोड करें और जटिल नमूनों (यानी, 2−3 घंटे) के लिए उपयुक्त ढाल का उपयोग करके अलग करें। यदि प्रोटीन पहचान की संख्या असंतोषजनक है, तो सभी नमूने को कॉलम पर लोड करें।
  7. एलसी/एमएस सिस्टम प्रदर्शन और नमूना कैरीओवर की निगरानी के लिए नमूनों के बीच में एक प्रोटीन डाइजेस्ट मानक चलाएं। आपके नमूनों के आधार पर नमूना कैरीओवर को कम करने के लिए कई मानकों की आवश्यकता हो सकती है।

7. डेटा प्रोसेसिंग

  1. https://www.maxquant.org/ में पाया जाने वाले प्रोटेओमिक्स सॉफ्टवेयर पैकेज मैक्सक्वांट डाउनलोड करें।
    नोट: इसका उपयोग डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए इनकी पहचान से जुड़े प्रोटीन आईडीएस, जीन नामों और मात्रात्मक मूल्यों के डेटा टेबल में चरण 6.6 से रॉ एमएस डेटा फ़ाइल को संसाधित करने के लिए किया जाएगा।
    1. रॉ डेटा टैब के इनपुट डेटा सबहेडर के भीतर लोड चुनें। फ़ाइल स्थान खोलें जहां एमएस कच्ची फाइलें संग्रहीत की जाती हैं और प्रत्येक एमएस/एमएस रन के लिए कच्ची फाइलों का चयन करें।
    2. ग्रुप-स्पेसिफिक टैब पर क्लिक करें और पाचनका चयन करें । एंजाइम सूची के भीतर LysC का चयन करें और सही तीर पर क्लिक करने के लिए सूची है कि खोज में इस्तेमाल किया जाएगा में इस एंजाइम जोड़ने के लिए । इसके बाद, इंस्ट्रूमेंट का चयन करें और सुनिश्चित करें कि सही उपकरण प्रकार स्क्रीन के शीर्ष पर ड्रॉप-डाउन सूची में दिखाई देता है। मानक सेटिंग्स पर अन्य समूह-विशिष्ट खोज मापदंडों को छोड़ दें।
    3. ग्लोबल पैरामीटर टैब पर क्लिक करें और दृश्योंका चयन करें । इस खोज में उपयोग की जाने वाली वर्गीकरण के लिए उपयुक्त फास्टा फ़ाइल जोड़ें। यदि ऐसा नहीं किया जाता है तो पेप्टाइड्स को ठीक से नहीं सौंपा जाएगा । ह्यूमन प्रोटेम के लिए, https://www.uniprot.org/help/human_proteome पर यूनिप्रोट से फास्टा फाइल डाउनलोड करें।
    4. वैश्विक पैरामीटर टैब के भीतर, प्रोटीन क्वांटिफिकेशनपर क्लिक करें। क्वांटिटाइफिकेशन ड्रॉप-डाउन मेनू के लिए पेप्टाइड्स के भीतर, अद्वितीय + रेजरका चयन करें।
      नोट: MaxQuant तीव्रता आधारित पूर्ण मात्रा (iBAQ) और लेबल मुक्त मात्रा (LFQ) के माध्यम से प्रोटीन की वैकल्पिक मात्रा प्रदान करता है । हालांकि, पेप्टाइड गिनती जानकारी इस प्रोटोकॉल15में डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए पर्याप्त है ।
    5. MaxQuant इंटरफ़ेस के नीचे बाईं ओर, खोज के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले प्रोसेसर की संख्या का चयन करें। यह सीधे रन के लिए आवश्यक समय की लंबाई को प्रभावित करेगा, इसलिए इसके लिए यथासंभव अधिक से अधिक चयन करें)। रन शुरू करने के लिए स्क्रीन के नीचे बाईं ओर शुरू करें। खोज की प्रगति देखने के लिए स्क्रीन के शीर्ष पर प्रदर्शन टैब का चयन करें।
  2. जब रन पूरा हो जाता है, तो डेटा16को देखने के लिए पर्सियस, एक प्रोटेओमिक्स कंप्यूटेशन प्लेटफॉर्म, या अन्य स्प्रेडशीट प्रोग्राम में proteingroups.txt फ़ाइल खोलें।
    1. सामान्य संदूषकों को हटाने के लिए पर्सियस का उपयोग करें और प्रोटीन दृश्यों को उलटने के लिए हिट करें। http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:use_cases:interactions में विस्तृत Perseus प्रलेखन का पालन करें।
      नोट: विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, एक्सेल) में proteingroups.txt फ़ाइल खोलने से कुछ जीन और प्रोटीन नामों को स्वचालित रूप से भ्रष्ट कर देगा।
  3. एफ़िनिटी शुद्धि (सीआरएपोम) के लिए संदूषक भंडार का उपयोग करके प्रयोगात्मक डेटा का विश्लेषण करें। इस भंडार http://crapome.org/ पर एक खाता रजिस्टर करें और जरूरत के अनुसार ट्यूटोरियल का पालन करें17,18.
    1. सीआरएपोम होमपेज पर पाए जाने वाले अपने डेटा कार्यप्रवाह का विश्लेषण करें। बाहरी नियंत्रण ों का चयन करें जो इस बातचीत प्रयोग में उपयोग की जाने वाली आत्मीयता शुद्धिकरण प्रणाली के अनुरूप हैं।
      नोट: इन नियंत्रणों का उपयोग दूसरे गुना परिवर्तन संवर्धन की गणना करने के लिए किया जा सकता है जो आम संदूषकों का पता लगाने के लिए उपयोगी है।
    2. Perseus या एक उपयुक्त स्प्रेडशीट एप्लिकेशन का उपयोग करMaxQuant से proteingroups.txt आउटपुट से एक इनपुट फ़ाइल उत्पन्न करें। मैनुअल फॉर्मेटिंग के लिए विवरण http://crapome.org/?q=fileformatting पर पाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, संत/सीआरएपोम इनपुट फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए प्रदान की गई आर स्क्रिप्ट "export_CRAPomeSAINT_Input_File.आर" का उपयोग करें। पूरक कोडिंग फ़ाइलोंमें README.txt देखें ।
    3. इम्यूनोप्रिसिप्रिशन में प्रत्येक चारा प्रोटीन के लिए गुना-परिवर्तन संवर्धन और संत (INTeractome का महत्व विश्लेषण) संभावना निर्धारित करने के लिए एक विश्लेषण चलाएं। सुनिश्चित करें कि एफसी-ए के तहत ड्रॉप-डाउन मेनू में 'उपयोगकर्ता नियंत्रण'का चयन किया जाता है, एफसी-बी ड्रॉप-डाउन में सीआरएपोम नियंत्रण या 'सभी नियंत्रण' का चयन किया जाता है और सेंट संभावनाओं को उत्पन्न करने के लिए संभावना स्कोर का चयन किया जाता है। जब रन समाप्त हो जाता है, तो जॉब आईडी के साथ 'विश्लेषण परिणाम' के तहत उपलब्ध आउटपुट देखें। भविष्य की साजिश रचने और डेटा विज़ुअलाइज़ेशन के लिए 'विश्लेषण परिणाम' से डेटा मैट्रिक्स डाउनलोड करें।
  4. पूरक कोडिंग फाइलोंमें प्रदान की गई आर-स्क्रिप्ट का पालन करके एफसी-ए (आईपीएस बनाम उपयोगकर्ता नियंत्रण) और सेंट संभावना के एक समारोह के रूप में प्रोटीन की साजिश करें।
    नोट: आर लिपियों का एक सेट एफसी के भूखंडों के उत्पादन के लिए प्रदान की जाती है-ए बनाम संत संभावना और iBAQ बनाम लॉग2 (प्रोटीन बहुतायत), लेबल मुक्त तीव्रता के अनुभवजन्य Bayes विश्लेषण से समायोजित पी मूल्य सीमा द्वारा रंग । अंतर सांख्यिकीय विश्लेषण और साजिश रचने का विवरण README.txt और आर स्क्रिप्ट "main_differential_analysis में पाए जाते हैं । पूरक कोडिंग फ़ाइलोंमें आर "।
  5. मूल्यांकन जहां चारा प्रोटीन के ज्ञात बातचीत प्रोटीन एफसी-ए और संत द्वारा स्थान पर हैं । एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में ट्रिपलेट में एकल चारा प्रयोगों के लिए एफसी-ए एंड जीटी 3.00 और सेंट एंड जीटी 0.7 की कटऑफ करें।
    नोट: एक "उच्च विश्वास" इंटरैक्टोर और एक "कम विश्वास" इंटरैक्टोर के लिए कटऑफ का चयन जैविक जानकारी द्वारा सूचित किया जाना चाहिए ।

8. डेटा विज़ुअलाइज़ेशन

नोट: ऐसे कई कार्यक्रम हैं जो प्रोटेओमिक्स डेटा (जैसे, आर, पर्सियस, साइटोस्केप, स्ट्रिंग-डीबी) की प्रभावी कल्पना कर सकते हैं। उच्च आत्मविश्वास हिट के बीच कनेक्टिविटी का विश्लेषण करना, और इन इंटरएक्टर्स का कार्यात्मक संवर्धन आगे सत्यापन और कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए हिट को प्राथमिकता देने के लिए एक उपयोगी रणनीति हो सकती है।

  1. 19 https://cytoscape.org/download.html में एक ओपन सोर्स नेटवर्कविज़ुअलाइज़ेशन टूल, साइटोस्केप डाउनलोड करें।
  2. तीन स्तंभों के साथ स्वरूपित टैब परिसीमित फ़ाइल के रूप में इंटरैक्शन डेटा के लिए इनपुट फ़ाइल तैयार करें: चारा (स्रोत नोड), शिकार (लक्ष्य नोड), इंटरैक्शन का प्रकार (एज प्रकार)। यह Perseus या अपनी पसंद के किसी भी स्प्रेडशीट कार्यक्रम में किया जा सकता है।
  3. कार्यक्रम के शीर्ष बाईं ओर फ़ाइल आइकन से आयात तालिका का चयन करें (नीचे के तीर और आइकन में मैट्रिक्स द्वारा नामित)। साइटोस्केप कस्टम फॉर्मेटिंग और डिजाइन के लिए तैयार नेटवर्क में इंटरैक्शन डेटा को ऑटो-आबाद करेगा।
  4. साइटोस्केप के लिए कंट्रोल पैनल पर स्टाइल टैब का चयन करें और पूरे नेटवर्क के लिए विशेषता को समायोजित करने के लिए डेफ कॉलम में वर्गों पर क्लिक करें। नेटवर्क में विशिष्ट नोड्स या किनारों का चयन करें और फिर डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स को बाईपास करने और केवल चयनित वस्तुओं को समायोजित करने के लिए शैली मेनू के बीवाईपी कॉलम के भीतर वर्ग का चयन करें। वैकल्पिक रूप से, पूर्व निर्धारित नेटवर्क प्रारूपों को देखने के लिए शैली मेनू के शीर्ष पर ड्रॉप-डाउन मेनू पर क्लिक करें।
    नोट: स्ट्रिंग-डीबी प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन डेटा को इस समय इस नेटवर्क में या तो मैन्युअल रूप से इनपुट फाइल के माध्यम से या साइटोस्केप में प्लग-इन के रूप में उपलब्ध विभिन्न संवर्धन उपकरणों के माध्यम से,http://apps.cytoscape.org/ 20के माध्यम से एकीकृत किया जा सकता है। संवर्धन विश्लेषण के लिए एक अनुशंसित साइटोस्केप प्लग-इन21http://apps.cytoscape.org/apps/cluego पाया जाता है।
  5. इस कार्यप्रवाह में उत्पन्न डेटासेट में विश्वास बढ़ाने के लिए, पारस्परिक आईपी-एमएस या आईपी-पश्चिमी प्रयोग करते हैं जो चारा के रूप में ब्याज के शिकार प्रोटीन को लक्षित करते हैं।

Representative Results

आईपी-एमएस प्रयोग में पहचाने गए अधिकांश प्रोटीन द्रव्यमान में गैर-विशिष्ट प्रोटीन होते हैं। इस प्रकार, आईपी-एमएस प्रयोग की प्रमुख चुनौतियों में से एक व्याख्या है जिसमें प्रोटीन उच्च आत्मविश्वास वाले इंटरएक्टर्स बनाम गैर-विशिष्ट इंटरएक्टर्स हैं। डेटा की गुणवत्ता के मूल्यांकन में उपयोग किए जाने वाले महत्वपूर्ण मापदंडों को प्रदर्शित करने के लिए अध्ययन ने केवल मनका नियंत्रण का उपयोग करते हुए 5 मिलीग्राम वाघेला परमाणु अर्क से त्रिपालिक इम्यूनोप्रिसिप्रिशन का विश्लेषण किया। यह सुनिश्चित करने के लिए पहली आंतरिक जांच कि आईपी-एमएस प्रयोग विश्वसनीय है कि क्या चारा प्रोटीन नियंत्रण और संत संभावना पर गुना-परिवर्तन दोनों द्वारा पहचाने गए उच्चतम समृद्ध प्रोटीन में से एक के रूप में शुमार है। इस मामले में, चारा DYRK1A नियंत्रण पर शीर्ष तीन समृद्ध प्रोटीन में स्थान(चित्रा 2A,बी)। चार स्वतंत्र एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए DYRK1A के एक परमाणु इंटरक्टिकेम अध्ययन में, एक एफसी-एक कटऑफ >3.00 और सेंट संभावना कटऑफ >0.7 ने उपन्यास और पहले मान्य इंटरएक्टर्स22दोनों की पहचान के लिए एक कठोर कटऑफ प्रदान की । जब इस प्रयोग पर लागू किया जाता है, तो उच्च आत्मविश्वास वाले इंटरएक्टर्स और 95% संप्रज्ञ प्रोटीन के बीच एक स्पष्ट अलगाव देखा जा सकता है जो गैर-विशिष्ट(चित्रा 2ए,बी)के रूप में पहचाने जातेहैं। एक गुना परिवर्तन संवर्धन और संभावना सीमा दोनों लागू करने से जैविक प्रतिकृतियों में प्रोटीन आईडीएस के लगातार उच्च संवर्धन की आवश्यकता से स्ट्रेचिंग बढ़ जाती है।

सांख्यिकीय स्कोरिंग के अलावा, CRAPome विश्लेषण कार्यप्रवाह भी नक्शे पहले चारा शिकार डेटा23पर बातचीत की सूचना दी । हालांकि यह मानचित्रण उच्च और निम्न-आत्मविश्वास बातचीत को थ्रेसहोल्ड करने के लिए उपयोगी हो सकता है, पहले रिपोर्ट की गई बातचीत एफसी-ए और सेंट संभावनाओं द्वारा खराब स्कोर कर सकती है, संभावित रूप से यह दर्शाता है कि किसी दिए गए चारा की कई ज्ञात बातचीत केवल विशिष्ट सेल प्रकारों, संदर्भों या ऑर्गेनेल्स में मौजूद हो सकती है। उदाहरण के लिए DYRK1A डेटासेट, iREF इंटरैक्टोर एफसी-ए मूल्य 0.45 के रूप में कम थे, जो नियंत्रण पर बहुत कम संवर्धन(चित्रा 2 C)का प्रतिनिधित्व करतेथे। झूठी सकारात्मक की मुद्रास्फीति से बचने के लिए, सांख्यिकीय थ्रेसहोल्डिंग को इस तरीके से किया जाना चाहिए जो झूठे नकारात्मकों को कम करने पर तार-तार को प्राथमिकता दे । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इन बातचीत का पता लगाना प्रोटीन प्रचुरता से स्वतंत्र था (चित्रा 2 सी)। वाघेला कोशिकाओं के भीतर प्रत्येक iREF बातचीत की गणना पूर्ण प्रतिलिपि संख्या आईपी-एमएस24द्वारा एक बातचीत भागीदार के पता लगाने के स्तर के लिए कोई संबंध नहीं दिखाया ।

साइटोस्केप इंटरैक्शन डेटा19की कई परतों की कल्पना करने के लिए एक प्रभावी उपकरण के रूप में कार्य करता है । यहां बताए गए DYRK1A इम्यूनोप्रिसिप्रिटाइजेशन प्रयोग में एफसी-ए एंड जीटी 3.0 और सेंट एंड जीटी के संयुक्त उपयोग ने हाई कॉन्फिडेंस इंटरएक्टर्स की सूची को घटाकर छह प्रोटीन(फिगर 2डी)कर दिया। हालांकि, जब एक्सोलेशन में एफसी-ए कटऑफ > 3.0 की कटऑफ लागू की गई तो नेटवर्क में आठ अतिरिक्त प्रोटीन जोड़े गए। इन अतिरिक्त प्रोटीन इंटरएक्टर्स में नेटवर्क में पहले से ही इंटरएक्टर्स के साथ उच्च कनेक्टिविटी है, जिससे वे समान परिसरों या कार्यात्मक भूमिकाओं में जुड़े हुए हैं। इस उद्देश्य के लिए, प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत के स्ट्रिंग-डीबी से सबूत नीले धराशायी लाइनों20के रूप में इस नेटवर्क में एकीकृत किया गया था । हालांकि यह एकल चारा, ट्रिपलिकेट प्रयोग पूर्ण DYRK1A इंटरैक्शन नेटवर्क का एक सीमित नमूना प्रदान करता है, बड़े सार्वजनिक डेटा सेट के अतिरिक्त बाइट्स, प्रतिकृति और एकीकरण का उपयोग उच्च विश्वास इंटरैक्शन के नेटवर्क का विस्तार करने के लिए किया जा सकता है। सांख्यिकीय कटऑफ इस प्रकार प्रत्येक व्यक्ति प्रयोग के लिए विशिष्ट होगा और अच्छी तरह से मूल्यांकन की आवश्यकता होगी ।

Figure 1
चित्रा 1: उपकोशिकीय आईपी-एमएस के लिए प्रतिनिधि प्रोटेओमिक्स कार्यप्रवाह। कोशिकाओं को या तो 4 एल गोल नीचे फ्लास्क या 15 सेमी ऊतक संस्कृति व्यंजन में उगाया जाता है और उपकोशिकीय अंशीकरण के लिए एक ही समय में काटा जाता है। कोशिकाओं को साइटोसोलिक, परमाणु और परमाणु गोली में आंशिक किया जाता है, और इम्यूनोप्रीसिपेटेशन एक ही चारा को पहचानने वाले एक या कई एंटीबॉडी का उपयोग करके 1−10 मिलीग्राम परमाणु लाइसेट से किया जाता है। फ़िल्टर एडेड नमूना प्रेप (एफएएसपी) और ऑफलाइन नमूना सफाई एकल शॉट मास स्पेक्ट्रोमेट्री से पहले की जाती है। डेटा को व्याख्यात्मक इंटरैक्शन डेटा में संसाधित करने के लिए डाउनस्ट्रीम कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन का उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एकल चारा एकल एंटीबॉडी आईपी-एमएस प्रयोग के लिए प्रतिनिधि डेटा। (A)काइनेस DYRK1A (n = 3) के लिए एक एंटीबॉडी का उपयोग करके एक इष्टतम प्रयोग के लिए सीआरएपोम विश्लेषण कार्यप्रवाह से एफसी-ए और सेंट संभावना उत्पादन। तुलना के लिए मोती-केवल नियंत्रण का उपयोग किया गया था। लाल ठोस लाइनें एफसी-ए और जीटी 3.00 और सेंट एंड जीटी 0.7 में कटऑफ का प्रतिनिधित्व करती हैं। (ख)MaxQuant प्रोटीन बहुतायत अनुमान (iBAQ) उत्पादन बनाम DYRK1A आईपी में प्रोटीन बहुतायत के log2 अनुपात को नियंत्रित करने के लिए, लेबल मुक्त तीव्रता के अनुभवजन्य Bayes विश्लेषण से समायोजित पी मूल्य सीमा द्वारा रंग । (ग) एफसी -ए और आईआरईएफ डाटाबेस23,24में प्रोटीन को बातचीत के रूप में सूचीबद्ध प्रोटीन की अनुमानित प्रति संख्या । (घ) DYRK1A इंटरएक्टर्स का साइटोस्केप नेटवर्क विज़ुअलाइज़ेशन। ब्लू नोड्स = एफसी-ए एंड जीटी; 3.00, सेंट एंड जीटी 0.7। ऑरेंज नोड्स = एफसी-ए एंड जीटी; 3.00। काले किनारों = आईपीएसएस प्रयोग में इंटरएक्टर्स के रूप में पहचाने जाने वाले प्रोटीन। ब्लू धराशायी बढ़त = शिकार प्रोटीन के बीच संत बातचीत (आत्मविश्वास और gt;.150)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रोटीज़ अवरोधक (पीआई) मिश्रण
अभिकर्मक अंतिम एकाग्रता
सोडियम मेटाबीसुल्फेट 1 एमएम
बेंजामाडिन 1 एमएम
डिथियोथ्रेइटॉल (डीटीटी) 1 एमएम
फिनाइलमेथेनसल्फोनाइल फ्लोराइड (पीएमएसएफ) 0.25 एमएम
फॉस्फेटेज़ अवरोधक (एफआई) मिश्रण
अभिकर्मक अंतिम एकाग्रता
माइक्रोसिस्टिन एलआर 1 माइक्रोन
सोडियम ऑर्थोनाडेट 0.1 एमएम
सोडियम फ्लोराइड 5 एमएम
उपसेलुलर अंशब:
बफर ए पीएच 7.9
अभिकर्मक अंतिम एकाग्रता
हेप्स 10 एमएम
एमजीसीएल2 1.5 एमएम
केसीएल 10 एमएम
बफर बी पीएच 7.9
अभिकर्मक अंतिम एकाग्रता
हेप्स 20 एमएम
एमजीसीएल2 1.5 एमएम
Nacl 420 एमएम
एथिलीनडायमिनेटेट्राएटिक एसिड (EDTA) 0.4 एमएम
ग्लीसेरोल 25% (v/v)
बफर सी पीएच 7.9
अभिकर्मक अंतिम एकाग्रता
हेप्स 20 एमएम
एमजीसीएल2 2 एमएम
केसीएल 100 एमएम
एथिलीनडायमिनेटेट्राएटिक एसिड (EDTA) 0.4 एमएम
ग्लीसेरोल 20% (v/v)
इम्यूनोप्रिसिप्रिशन बफर:
आईपी बफर 1
अभिकर्मक अंतिम एकाग्रता
हेप्स 20 एमएम
केसीएल 150 एमएम
ईडीटीए 0.1 एमएम
एनपी-40 0.1% (v/v)
ग्लीसेरोल 10% (v/v)
आईपी बफर 2
अभिकर्मक अंतिम एकाग्रता
हेप्स 20 एमएम
केसीएल 500 एमएम
ईडीटीए 0.1 एमएम
एनपी-40 0.1% (v/v)
ग्लीसेरोल 10% (v/v)
एसडीएस अल्किलेशन बफर पीएच 8.5
अभिकर्मक अंतिम एकाग्रता
Sds 4% (v/v)
क्लोरोएसेटामाइड 40mm
टीसीईपी 10 एमएम
Tris 100 एमएम
यूए पीएच 8.5
अभिकर्मक अंतिम एकाग्रता
यूरिया 8 एम
Tris 0.1 एम
* एचपीएलसी ग्रेड H2O का उपयोग करें

तालिका 1: बफर रचनाएं

पूरक कोडिंग फ़ाइलें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहां उल्लिखित प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो ब्याज के प्रोटीन के लिए उच्च आत्मविश्वास वाले प्रोटीन इंटरएक्टर्स की पहचान करने के लिए एक प्रभावी तरीका प्रदान करता है। यह दृष्टिकोण उपसेलुलर अंश के माध्यम से नमूना जटिलता को कम करता है और मजबूत नमूना तैयारी, ऑफलाइन नमूना साफ, और एलसी-एमएस प्रणाली के कड़े गुणवत्ता नियंत्रण के माध्यम से पहचान इंटरैक्शन भागीदारों को बढ़ाने पर केंद्रित है। यहां वर्णित डाउनस्ट्रीम डेटा विश्लेषण चारा के साथ copurifying के रूप में पहचाने गए प्रोटीन के सरल सांख्यिकीय मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है । हालांकि, प्रायोगिक चर (पैमाने, सेल लाइन, एंटीबॉडी विकल्प) की एक उच्च संख्या के कारण, प्रत्येक प्रयोग डेटा दृश्य और संवर्धन के बारे में विभिन्न कटऑफ और विचारों की आवश्यकता होती है।

आईपी-एमएस प्रयोग में पहला डिजाइन विचार एंटीबॉडी का चयन है जिसका उपयोग इसके बातचीत भागीदारों के साथ ब्याज के प्रोटीन के सहशुद्धि के लिए किया जाएगा। जबकि वाणिज्यिक एंटीबॉडी की उपलब्धता पिछले कई दशकों में मानव प्रोटेम के बड़े हिस्से को कवर करने के लिए विस्तारित किया गया है, वहां अभी भी कई प्रोटीन है जिसके लिए अभिकर्मकों सीमित हैं । इसके अलावा, पश्चिमी दाग का पता लगाने जैसे अनुप्रयोगों के लिए मान्य किए गए एंटीबॉडी इम्यूनोप्रिसिप्रिशन प्रयोग में लक्ष्य प्रोटीन के चयनात्मक संवर्धन में असमर्थ हो सकते हैं। बड़े पैमाने पर इंटरैक्शन प्रोटेओमिक्स प्रयोग करने से पहले, 90% समप्रवाह 10 सेमी पकवान, या समकक्ष सेल नंबर से आईपी को पूरा करने और पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा ब्याज के लक्षित प्रोटीन की जांच करने का सुझाव दिया जाता है। यदि इम्यूनोप्रिसिप्रिशन के लिए एक से अधिक एंटीबॉडी उपलब्ध है, तो इसके अतिरिक्त प्रोटीन के विभिन्न भागों के भीतर एपिटोप को पहचानने वाले कई एंटीबॉडी का चयन करने का सुझाव दिया जाता है। चारा प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी की बाध्यकारी ख्यात बातचीत भागीदारों के लिए आवश्यक बाध्यकारी इंटरफ़ेस को कम कर सकती है। चारा प्रोटीन के लिए एक माध्यमिक एपिटोप का चयन एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित प्रयोग द्वारा पहचाने गए इंटरैक्शन प्रोफाइल के कवरेज में वृद्धि करेगा।

एक दूसरा प्रमुख विचार चारा के साथ copurifying के रूप में पहचान के रूप में पहचान उन लोगों से कम आत्मविश्वास या गैर विशिष्ट बातचीत से उच्च विश्वास बातचीत भेद के लिए उचित नियंत्रण के चयन में निहित है । आईपी-एमएस प्रयोग के लिए सबसे कठोर नियंत्रण चारा की CRISPR KO सेल लाइन से इम्यूनोप्रिसिप्रिशन को पूरा करना है। इस तरह के नियंत्रण की पहचान और गैर विशिष्ट प्रोटीन है कि सीधे एंटीबॉडी के बजाय चारा प्रोटीन के लिए बाध्य से बाहर छानने में सक्षम बनाता है । ऐसे मामलों में जहां प्रत्येक चारा प्रोटीन की CRISPR KO सेल लाइन उत्पन्न करना संभव नहीं है, चारा एंटीबॉडी के समान आइसोटाइप का आईजीजी-बीड नियंत्रण उपयोग किया जा सकता है। कई प्रजातियों का प्रतिनिधित्व करने वाले एंटीबॉडी के एक पैनल को नियोजित करने वाले प्रयोगों में, मोतियों का उपयोग केवल नियंत्रण उचित हो सकता है लेकिन उच्च आत्मविश्वास इंटरएक्टर्स के रूप में पहचाने गए झूठे सकारात्मक की दर में वृद्धि करेगा।

आईपी-एमएस प्रयोग में उपयोग की जाने वाली सेल लाइन का चयन कई प्रमुख कारकों पर निर्भर करता है। प्रोटीन अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण काफी हद तक सेल प्रकार पर निर्भर हैं। जबकि आरएनए अभिव्यक्ति का अनुमान कई आमतौर पर इस्तेमाल सेल लाइनों में सबसे जीन के लिए पाया जा सकता है, प्रोटीन अभिव्यक्ति खराब आरएनए अभिव्यक्ति के साथ सहसंबद्ध है और प्रयोगात्मक25निर्धारित किया जाना चाहिए । सेल लाइनों जिसमें एक चारा प्रोटीन बहुत कम प्रतिलिपि संख्या में व्यक्त किया जाता है सेल संस्कृति पैमाने में भारी वृद्धि के साथ जुड़े समस्याओं को दरकिनार करने के लिए बचा जाना चाहिए कि आवश्यक हो सकता है । हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि नमूना तैयारी को बहुत कम बहुतायत प्रोटीन का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। फिल्टर एडेड नमूना तैयारी (FASP) विधि, जबकि मजबूत, एक नमूने में पेप्टाइड के 50% से अधिक नुकसान का कारण बन सकता है। एकल-पॉट ठोस चरण-बढ़ाया नमूना तैयारी (SP3) बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए नमूने पैदा करने का एक कुशल तरीका है जो नमूना हानि26को कम करता है। नमूना तैयारी की SP3 विधि द्वारा सक्षम बढ़ी हुई वसूली पता लगाने की सीमा के पास आने वाले प्रोटीन के परिमाणीकरण के लिए इस कार्यप्रवाह में एक उपयोगी विकल्प हो सकती है।

इस प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो को कई परमाणु बाइट्स में लागू किया गया है, जिसमें किनेस, ई 3 सर्वव्यापी लिगैस, और मल्टीसबयूनिट परिसरों के मचान सदस्य शामिल हैं। एंटीबॉडी अभिकर्मकों के उचित सत्यापन को मानते हुए, इस कार्यप्रवाह के सफल निष्पादन के परिणामस्वरूप ब्याज के प्रोटीन के लिए उच्च आत्मविश्वास वाले प्रोटीन परमाणु संपर्क भागीदारों का पता लगाया जाएगा।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को लिंडा क्रैनिक इंस्टीट्यूट फॉर डाउन सिंड्रोम से डब्ल्यूएमओ को एक ग्रैंड चैलेंज ग्रांट द्वारा और एक DARPA सहकारी समझौते 13-34-आरटीए-FP-007 द्वारा समर्थित किया गया था । हम पांडुलिपि को पढ़ने और टिप्पणी करने में उनके योगदान के लिए जेसी कुर्लैंड और किरा कोज़ोनोलिनो का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA Thermo Fisher Scientific 25200056
1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes Fisher Scientific 02-681-320
4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels Bio-Rad 4561096
acetone (HPLC) Thermo Fisher Scientific A949SK-4
Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column Millipore Sigma UFC503096
Benzamidine Sigma-Aldrich 12072
benzonase Sigma-Aldrich E1014
Chloroacetamide Sigma-Aldrich C0267
Dialysis tubing closure Caroline Biological Supply Company 684239
DTT Sigma-Aldrich 10197777001
EDTA Sigma-Aldrich EDS
GAPDH antibody Santa Cruz Biotechnology Sc-47724
Glycerol Fisher Scientific 887845
Glycine Sigma-Aldrich G8898
HeLa QC tryptic digest Pierce 88329
HEPES Fisher Scientific AAJ1692630
insulin Thermo Fisher Scientific 12585014
iodoacetamide Sigma-Aldrich I1149
KONTES Dounce homogenizer 7 ml VWR KT885300-0007
Large Clearance pestle 7ml VWR KT885301-0007
Lysyl endopeptidase C VWR 125-05061
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich 208337
Microcystin enzo life sciences ALX-350-012-C100
Nonidet P 40 Substitute solution Sigma-Aldrich 98379
p84 antibody GeneTex GTX70220
Phosphate Buffered Saline
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227
Pierce BSA Protein Digest, MS grade Thermo Fisher Scientific 88341 LCMS QC
Pierce C18 spin columns Thermo Fisher Scientific PI-89873
Pierce Trypsin Protease, MS Grade Thermo Fisher Scientific 90057 For mass spectrometry sample prep
PMSF Sigma-Aldrich P7626
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P9541
Protein A Sepharose CL-4B GE Healthcare Bio-Sciences 17-0780-01
Protein G Sepharose 4 Fast Flow GE Healthcare Bio-Sciences 17-0618-01
SDS Sigma-Aldrich L3771
Silica emitter tip Pico TIP FS360-20-10
Small Clearance pestle 7ml VWR KT885302-0007
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich 201154
Sodium metabisulfite Sigma-Aldrich 31448
Sodium orthovanadate Sigma-Aldrich S6508
Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing Thomas Scientific 3787K17
TC Dish 150, Standard Sarstedt 83.3903 Tissue culture dish for adherent cells
TCA Sigma-Aldrich T9159
TCEP Thermo Scientific PG82080
TFA Thermo Fisher Scientific 28904
Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS Thermo Fisher Scientific
Trizma Base Sigma-Aldrich T6066
Urea Thermo Fisher Scientific 29700
Waters ACQUITY M-Class UPLC Waters
Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7µm Spherical Hybrid (1.7 µm, 75 µm x 250 mm) Waters 186007484 nanoflow C18 column

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Varjosalo, M., et al. The protein interaction landscape of the human CMGC kinase group. Cell Reports. 3, 1306-1320 (2013).
  2. Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. Overview of Affinity Tags for Protein Purification. Current Protocols in Protein Science. 73, (2013).
  3. Mahmood, N., Xie, J. An endogenous 'nonspecific' protein detected by a His-tag antibody is human transcription regulator YY1. Data in Brief. 2, 52 (2015).
  4. Zordan, R. E., Beliveau, B. J., Trow, J. A., Craig, N. L., Cormack, B. P. Avoiding the ends: internal epitope tagging of proteins using transposon Tn7. Genetics. 200, 47-59 (2015).
  5. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10, 715-721 (2013).
  6. Bronicki, L. M., et al. Ten new cases further delineate the syndromic intellectual disability phenotype caused by mutations in DYRK1A. European Journal of Human Genetics. 23, 1482-1487 (2015).
  7. Antonarakis, S. E. Down syndrome and the complexity of genome dosage imbalance. Nature Reviews Genetics. , (2016).
  8. Dowjat, W. K., et al. Trisomy-driven overexpression of DYRK1A kinase in the brain of subjects with Down syndrome. Neuroscience Letters. 413, 77-81 (2007).
  9. Fotaki, V., et al. Dyrk1A haploinsufficiency affects viability and causes developmental delay and abnormal brain morphology in mice. Molecular and Cellular Biology. 22, 6636-6647 (2002).
  10. Hämmerle, B., Elizalde, C., Tejedor, F. J. The spatio-temporal and subcellular expression of the candidate Down syndrome gene Mnb/Dyrk1A in the developing mouse brain suggests distinct sequential roles in neuronal development. European Journal of Neuroscience. 27, 1061-1074 (2008).
  11. Funakoshi, E., et al. Overexpression of the human MNB/DYRK1A gene induces formation of multinucleate cells through overduplication of the centrosome. BMC Molecular and Cell Biology. 4, 12 (2003).
  12. Yu, D., Cattoglio, C., Xue, Y., Zhou, Q. A complex between DYRK1A and DCAF7 phosphorylates the C-terminal domain of RNA polymerase II to promote myogenesis. Nucleic Acids Research. , 1-14 (2019).
  13. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
  14. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
  15. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11, 2301-2319 (2016).
  16. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13, 731-740 (2016).
  17. Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: A contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10, 730-736 (2013).
  18. Choi, H., et al. SAINT: Probabilistic scoring of affinity purificationg-mass spectrometry data. Nature Methods. 8, 70-73 (2011).
  19. Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13, 2498-2504 (2003).
  20. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45, 362-368 (2017).
  21. Bindea, G., et al. ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks. Bioinformatics. 25, 1091-1093 (2009).
  22. Guard, S. E., et al. The nuclear interactome of DYRK1A reveals a functional role in DNA damage repair. Scientific Reports. 9, 6539 (2019).
  23. Razick, S., Magklaras, G., Donaldson, I. M. iRefIndex: A consolidated protein interaction database with provenance. BMC Bioinformatics. 9, 405 (2008).
  24. Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells. Nature Methods. 11, 319-324 (2014).
  25. Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165, 535-550 (2016).
  26. Hughes, C. S., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10, 757 (2014).

Tags

बायोकेमिस्ट्री इश्यू 153 मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटेओमिक्स सबसेलुलर आअंशन इम्यूनोप्रिसिप्रिशन इंटरेक्टिकम बायोइन्फॉर्मेटिक्स वर्कफ्लो
बड़े पैमाने पर परमाणु इंटरैक्टूम प्रोफाइलिंग के लिए लेबल-फ्री इम्यूनोप्रिसिप्रिशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री वर्कफ्लो
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guard, S. E., Ebmeier, C. C., Old,… More

Guard, S. E., Ebmeier, C. C., Old, W. M. Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling. J. Vis. Exp. (153), e60432, doi:10.3791/60432 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter