Summary
Beskrevet er en Proteomikk arbeidsflyt for å identifisere protein interaksjon partnere fra en kjernefysisk subcellulære brøkdel ved hjelp av immunoaffinity berikelse av en gitt protein av interesse og etikett-fri masse massespektrometri. Arbeidsflyten inkluderer subcellulære fraksjonering, immunutfelling, filter hjulpet prøve forberedelser, frakoblet opprydding, masse massespektrometri og en nedstrøms bioinformatikk rørledning.
Abstract
Immunoaffinity rensing masse massespektrometri (IP-MS) har dukket opp som en robust kvantitativ metode for å identifisere protein-protein interaksjoner. Denne publikasjonen presenterer en komplett interaksjon Proteomikk arbeidsflyt designet for å identifisere lav overflod protein-protein interaksjoner fra kjernen som også kan brukes til andre subcellulære avdelinger. Denne arbeidsflyten inkluderer subcellulære fraksjonering, immunutfelling, prøveklargjøring, frakoblet opprydding, enkelt-shot etikett-fri masse massespektrometri, og nedstrøms beregningsorientert analyse og data visualisering. Vår protokoll er optimalisert for å oppdage compartmentalized, lav overflod interaksjoner som er vanskelig å identifisere fra hele cellen lysater (f. eks, transkripsjon faktor interaksjoner i kjernen) ved immunutfelling av endogene proteiner fra fraksjonert subcellulære rom. Prøven forberedelse rørledningen skissert her gir detaljerte instruksjoner for utarbeidelse av HeLa celle kjernefysisk ekstrakt, immunoaffinity rensing av endogene agn protein, og kvantitative masse massespektrometri analyse. Vi diskuterer også metodisk hensyn for å utføre stor skala immunutfelling i masse massespektrometri interaksjon profilering eksperimenter og gir retningslinjer for evaluering av datakvalitet for å skille sant positivt protein interaksjoner fra ikke-spesifikke samhandlinger. Denne tilnærmingen er demonstrert her ved å undersøke den kjernefysiske interactome av CMGC kinase, DYRK1A, en lav overflod protein kinase med dårlig definerte interaksjoner innenfor kjernen.
Introduction
Den menneskelige proteom utstillinger enorme strukturelle og biokjemiske mangfold gjennom dannelsen av stabile multisubunit komplekser og forbigående protein-protein interaksjoner. Følgelig er identifisering av samspill partnere for et protein av interesse vanligvis nødvendig i undersøkelser for å løse molekylære mekanisme. Nylige fremskritt i affinitet rensing protokoller og advent av høyoppløselig rask skanning masse massespektrometri instrumentering har aktivert enkel kartlegging av protein interaksjon landskap i en enkelt objektiv eksperiment.
Protein interaksjon protokoller vanligvis ansette utenfor livmoren uttrykks systemer med affinitet-Tagged Fusion konstruerer å identifisere protein interaksjoner uten å kreve høy kvalitet antistoffer erkjenner et protein av interesse1,2. Men epitope kode-baserte metoder har flere ulemper. Fysisk interaksjon med epitope kan føre til påvisning av uspesifisert copurifying proteiner3. I tillegg, fusjon av disse epitope koder til N-eller C-terminal av et protein kan blokkere native protein-protein interaksjoner, eller forstyrre protein folding å fremme ikke-fysiologiske konformasjonen4. Videre, utenfor livmoren uttrykks systemer overekspresjon vanligvis agnet protein ved supraphysiological konsentrasjoner, som kan resultere i identifisering av artifactual protein interaksjoner, spesielt for dosering-sensitive gener5. For å omgå disse problemene, kan endogene agn proteinet bli immunoprecipitated sammen med tilhørende samspill byttedyr proteiner, forutsatt tilgjengeligheten av et høykvalitets antistoff som anerkjenner den innfødte protein.
Forutsatt her er en interaksjon Proteomikk arbeidsflyt for å oppdage kjernefysiske interactome av en endogene protein ved hjelp av CMGC protein kinase DYRK1A som et eksempel. Forstyrrelse av DYRK1A kopierings nummer, aktivitetsnivå eller uttrykk kan forårsake alvorlig intellektuell uførhet hos mennesker, og embryonale dødelighet i mus6,7,8,9. DYRK1A utstillinger dynamisk spatiotemporal regulering10, og compartmentalized protein interaksjoner11,12, som krever tilnærminger i stand til å oppdage lav overflod interaksjon partnere spesifikke for ulike subcellulære rom.
Denne protokollen sysselsetter mobilnettet fraksjonering av menneskelig HeLa celler til stoffer og nucleoplasm fraksjoner, immunutfelling, prøve forberedelser for masse massespektrometri, og en oversikt over en Bioinformatic rørledning for å evaluere datakvalitet og visualisere resultater, med R-skript som er gitt for analyse og visualisering (figur 1). Proteomikk programvarepakker som brukes i denne arbeidsflyten er alle fritt tilgjengelig for nedlasting eller kan nås via et webgrensesnitt. For ytterligere informasjon om programvare og beregningsorientert metoder, grundig opplæring og instruksjon er tilgjengelig på linkene som er oppgitt.
Protocol
Merk: alle buffer komposisjoner og protease blandinger er skissert i tabell 1.
1. utarbeidelse av celler
Merk: et start materiale på 1 − 10 mg Atom lysat per replikere er ønskelig for denne immunutfelling masse massespektrometri (IP-MS). Celle mengder vil bli gitt for 1 mg av kjernefysisk immunoprecipitations i tre eksemplarer pluss tre eksemplarer kontroller.
- Hvis du bruker en tilhenger cellelinje, vokser cellene til 90% confluency i 3 x 15 cm retter per replikere før høsting.
Merk: det anbefales å utføre minst tre replikere immunoprecipitations for agn og kontroll forhold. Denne protokollen vil anta bruk av "perler bare" kontroller, som kontroll for rikelig uspesifisert interaksjon med perlene, som starter på § 4. Andre typer kontroller kan være nyttige. Disse er beskrevet i dybden i diskusjonen delen.- Vask plater 2x med fosfat bufret saltvann (PBS) og trypsinize celler som bruker 3 mL 0,25% Trypsin per 15 cm plate. Snurr ned cellene ved 1 200 x g i 5 min og Dekanter Trypsin.
- For suspensjon celler, vokse til en tilsvarende skala/tetthet for å oppnå 70 − 80 mg av totalt protein.
- Pellet celler ved 1 200 x g og 4 ° c i 5 min. Dekanter mediene nøye.
Merk: pellets kan kombineres i dette trinnet for å muliggjøre effektiv behandling ved hjelp av subcellulære fraksjonering i stor skala som er skissert i del 2.
- Pellet celler ved 1 200 x g og 4 ° c i 5 min. Dekanter mediene nøye.
- Vask celle pellet 2x med PBS + 5 mM MgCl2 supplert med protease hemmere (PIs) og fosfatase hemmere (PhIs) (se tabell 1).
Merk: celle pellets kan blinke frosset i flytende nitrogen og oppbevares ved-80 ° c til den er klar for fraksjonering.
2. utarbeidelse av kjernefysisk ekstrakt
Merk: protease-og fosfatase-hemmere skal legges til fraksjonering buffere innen 30 min bruk.
- Hvis frosset, tine cellen pellets for 15 min i 1x pellet volum av kulde buffer A + PIs/PhIs. Plasser celle pellet på en nutator ved 4 ° c for å hjelpe til med blanding mens du tine. Ellers resuspend du celle pellet fra trinn 1,3 til 1x pellet volum buffer A + PIs/PhIs.
- Pellet ved 2 000 x g og 4 ° c i 10 min. Dekanter bufferen.
- Suspendere cellene med 5x pakket celle volum med buffer A og ruge på isen i 20 min.
- Pellet ved 2 000 x g og 4 ° c i 10 min. Dekanter buffer og resuspend med 2x originalt pakket celle volum buffer A + PIs/PhIs og dounce ~ 7x med "A"/Loose morter.
- Sentrifuger lysat i 10 min ved 2 000 x g og 4 ° c.
- Forsiktig pipette av supernatanten og blits fryse med flytende nitrogen. Oppbevar lysat ved-80 ° c. Supernatanten fra dette trinnet er cytosolic subcellulære brøkdel.
Merk: den kjernefysiske pellet kan lagres i dette trinnet ved blits frysing med flytende nitrogen og lagring ved-80 ° c - Resuspend pellet med 0,9 x pellet volum av buffer B + PIs/PhIs og bland på en nutator i 5 min ved 4 ° c.
- For å lyse kjernene, dounce 20x med en strammere morter "B".
- Bland de kjernefysiske lysat på en nutator i 30 min ved 4 ° c slik at den er homogen.
- Sentrifuger den kjernefysiske lysat i 30 min ved 21 000 x g ved 4 ° c. Pipetter av supernatanten og lagre som et løselig kjernefysisk protein ekstrakt.
Merk: Nuklease behandling av den resulterende kjernefysiske pellet gjør det mulig for gjenvinning av en kromatin-assosiert protein brøk. - Dialyze det løselige Atom ekstrakt mot buffer C + PIs for 3 t ved 4 ° c.
- Skjær en passende lengde på 24 mm bredde dialyse slange med en 8 kDa molekylvekt avskåret. Klem den ene siden av slangen og Last nucleoplasm inn i røret. Etter lasting av lysat, klemme den andre enden og senk inn i en ren glassbeholder som inneholder buffer C + PIs.
- Sentrifuger den dialyzed kjernefysiske ekstrakt/nucleoplasm ved 21 000 x g ved 4 ° c i 30 min. alikvot 3X 20 μL volumer av kjernefysisk ekstrakt for fraksjonering validering av Western Blot. Det kjernefysiske ekstrakt som brukes til IP-MS-analyse kan aliquoted og blinke frosset i flytende nitrogen og oppbevares ved-80 ° c, om nødvendig.
3. validering av subcellulære fraksjonering
- Fullfør et protein-analysen for å bestemme protein konsentrasjonen av den kjernefysiske lysat. En bicinchoninic acid protein analysen gir tilstrekkelig følsomhet for nedstrøms søknad.
- Last 20 μg av både cytosolic og kjernefysiske fraksjoner på en SDS-side gel for Western Blot analysen som tidligere beskrevet13. Hopp over kjørefelt ved lasting for å unngå mischaracterization av en prøve.
- Sonde den vestlige blot for p84 (THOC1) som en kjernefysisk markør, og GAPDH som en cytosolic markør. Bestem omfanget av fraksjonering av forholdet mellom cytosolic markør i kjernefysiske brøk og vice versa.
Merk: antistoffer for andre kjernefysiske og cytosolic markører kan brukes.
4. immunutfelling av endogene kjernefysiske agn protein
Merk: det anbefales å bruke lav oppbevaring rør fra dette punktet på. Dette vil redusere den ikke-spesifikke bindingen til rørene under prøvehåndtering, og unngå unødvendig tap av prøve. I tillegg må du sørge for at LCMS karakteren H2O brukes til å klargjøre buffere for de resterende trinnene.
- Forbered en protein A/G perle blanding for hver replikere ved å kombinere 12,5 μL av perle volum for både protein-A og protein-G i mikrosentrifugen rør. Oppbevar perle bestandene som en slurry som inneholder 20% etanol. Bestem konsentrasjonen av perler i slurry% (v/v) og Pipetter nødvendig volum ved hjelp av en pipette spissen som har blitt kuttet på spissen for å sikre at perlene kan komme inn i spissen.
- Vask protein A/G perle blandingen 2x med 300 μL av IP buffer 1. Snurr perlene på 1 500 x g ved 4 ° c i 1 min og Dekanter buffer.
- Forbered antistoff-protein A/G perler: for å binde antistoff til perlene, tilsett 300 μL av IP buffer 1 og 10 μg av ønsket antistoff. La perle/antistoff blandingen til å rocke på en nutator ved 4 ° c over natten. Ikke Legg til antistoffer for bare perle kontroller.
Merk: totalt 10 mikrogram antistoff per replikere kan brukes som utgangspunkt, men det eksakte beløpet må optimaliseres for hvert enkelt antistoff og omfanget av lysat som brukes i eksperimentet. - Tine den kjernefysiske lysater fra trinn 2,10 i et vannbad og alikvot passende volumer til lav oppbevaring mikrosentrifugen rør for 1 mg protein input per gjenskape.
- Snurr lysat ved 16 000 x g i 30 min og Overfør supernatanten til et nytt rør.
- Tilsett 1 μL benzonase (250 enheter/μL) per 1 mg av Atom lysat og stein på en nutator ved 4 ° c i 10 − 15 min.
- Forbered perler for preclearing av lysat. Tilsett 12,5 μL av hvert protein A og protein G perler til 1,5 mL lav oppbevaring rør som i trinn 4,1. Vask 2x med IP Wash buffer 1 + PIs og Dekanter buffer.
- Tilsett 1 mg av Atom lysat til perlene fra trinn 4,5. Ruge mens du rocker på en nutator i 1 time ved 4 ° c.
- Sentrifuger precleared lysater ved 1 500 x g og 4 ° c i 1 min.
- Mens kjernefysiske lysater er incubating med perler i trinn 4.5.1, vaske antistoff-protein A/G perler 2x med IP buffer 1 + PIs. Sentrifuger ved 1 500 x g og 4 ° c i 1 min og Dekanter buffer.
- Overfør den precleared kjernefysiske lysat fra trinn 4.6.1 til antistoff-protein A/G-perler. Ruge mens du rocker på en nutator ved 4 ° c for 4 h. sentrifuger etter inkubasjons ved 1 500 x g og 4 ° c i 1 min.
- Overfør supernatanten til rør merket som flyten gjennom for hver replikere.
- Vask antistoff protein A/G-perler med 1 mL IP-buffer 2 + PIs. Sentrifuger ved 1 500 x g og 4 ° c i 1 min. Dekanter buffer, og gjenta for totalt 3x.
- Vask perlene 2x med 1 mL IP buffer 1 + PIs sentrifugering som i forrige trinn. Kontroller at all buffer er fjernet etter siste vask.
- Eluere 2x med 20 μL 0,1 M Glycine (pH 2,75) i 30 minutter hver. Sørg for at rørene rocker under inkubasjons med eluering buffer. Snurr på 750 x g og 4 ° c i 1 min og Pipetter av supernatanten etter 30 min inkubasjons.
Merk: mens den lave pH Glycine metoden beskrevet her elutes mest agn proteiner, noen antistoff-antigen interaksjoner krever strengere buffer forhold. - Flash fryse eluates i flytende nitrogen og oppbevares ved-80 ° c.
5. prøveforberedelse
Merk: insulin tilsatt i immunutfelling eluering prøvene hjelpemidler i utvinningen av proteiner under Trekloredikksyre syre (TCA) nedbør og prøve behandling, noe som er viktig for lav overflod endogene agn proteiner.
- Tin eluates ved romtemperatur hvis den er frosset.
- Plasser prøvene på is og tilsett 10 μL 1,0 mg/mL insulin for hver 100 μL av eluatet. Vortex og deretter umiddelbart tilsett 10 μL av 1% natrium natriumdeoksykolat. Vortex prøven igjen og tilsett 30 μL 20% TCA etterfulgt av en siste Vortex.
- Ruge prøvene på isen i 20 min, deretter sentrifuger ved 21 000 x g ved 4 ° c i 30 min.
- Aspirer supernatanten og tilsett 0,5 mL aceton som er prechilled til-20 ° c. Vortex og deretter spinne ved 21 000 x g og 4 ° c i 30 min. Gjenta dette trinnet.
- Aspirer supernatanten og lufttørke pellet resterende i bunnen av røret.
- Klargjør prøven for masse massespektrometri ved hjelp av en modifisert FASP (filter hjulpet sample prep)-metode, optimalisert for å redusere prøve håndteringen, som beskrevet under14.
- Resuspend protein pellet fra trinn 5.1.4 med 30 μL av SDS Alkylation buffer (se tabell 1). Ruge prøven på en 95 ° c varme blokk i 5 minutter. La den avkjøles ved romtemperatur i 15 minutter før foregående til neste trinn.
- Tilsett 300 μL av UA-løsning og 30 μL av 100 mM TCEP til hver prøve. Last denne løsningen på en 30K sentrifugal filter. Snurr sentrifugal filteret ved 21 000 x g ved romtemperatur i 10 minutter.
Merk: agn proteinet og dens antatte interaktører bør bindes til filteret på dette punktet. Men flyten gjennom kan holdes, i tilfelle det er et problem med filteret. - Vask filteret med 250 μL av UA og sentrifuger ved 21 000 x g i 10 min. Dekanter flyten gjennom og gjenta for totalt 3x.
- Vask filteret med 100 μL av 100 mM Tris pH 8,5 og sentrifuge ved 21 000 x g i 10 min. Dekanter gjennom og gjenta for totalt 3x.
- Tilsett 3 μL av 1 μg/μL lys C-resuspendert i 0,1 M Tris pH 8,5. Fyll filtrene opp til 100 μL-merket og la det fordøye for 1 time ved 37 ° c mens du rocker på en nutator.
- Tilsett 1 μL av Trypsin med 1 μg/μL MS-klasse. Bland forsiktig og la for Trypsin å ruge med prøven over natten ved 37 ° c mens du rocker på en nutator.
- Sentrifuger på 21 000 x g for 20 min å eluere peptid fra filteret.
Merk: flere runder med sentrifugering kan være nødvendig for å gjenopprette alle eluatet. Hvis dette ikke er gjort, er det et potensial for alvorlig prøve tap.
- Avsalte peptider ved hjelp C18 spin kolonner. Følg protokollen fra produsenten.
- Resuspend den lyofilisert peptid i 7 μL av 0,1% TFA i 5% acetonitril. Sonikere prøven i 3 minutter for å sikre at peptider er resuspendert. Spin ned på 14 000 x g i 10 min.
- Overfør resuspendert peptid til et passende prøve hetteglass til for lasting på flytende kromatografi-Mass massespektrometri (LC/MS) system.
6. LC/MS system egnethet
Merk: på grunn av småskala og generelt lavere overflod av proteiner fra affinitet-renset prøver, er det viktig at LC/MS plattformen opererer med maksimal følsomhet og robusthet.
- Tilsett 1 mL LC/MS grade maursyre acid til 1 L av LC/MS grade vann for mobile fase A, og tilsett 1 mL LC/MS grade maursyre syre til 1 L av LC/MS grade acetonitril for mobile fase B.
- Forbered eller Installer en 75 μm smeltet-silica kapillær kolonne fullpakket med < 2 μm reversert-fase C18 harpiks som er ≥ 250 mm i lengde. Best resultater ville være fikk med en direkte injeksjon av eksemplar inn i søylen.
- Tøm UPLC-systemet (Ultra Performance Liquid kromatografi) med friske, mobile faser. Med en C18-kolonne installert, etablere en stabil strømningshastighet og electrospray med en passende emitter (dvs. 20 μm ID x 360 μm OD trukket til en 10 μm spissen). Oppretthold kolonnen ved 40 − 60 ° c.
- Test den generelle LC/MS systemytelsen ved å injisere en kompleks kvalitetskontroll standard, for eksempel 100 − 200ng av en HeLa hele cellen lysat tryptic fordøye. Eluere med en passende gradering for en kompleks prøve (dvs. 2 − 3 t gradient eluering tid). Etablere en Baseline systemytelse av peptid og protein IDer.
Merk: for best resultat vil 3000 − 5000 eller mer protein IDer fra 20000 − 35000 unike peptider gi optimal ytelse for eksperimentelle prøver. - For rutinemessig LC/MS-systemet egnethet, injisere 100 − 200 fmol eller mindre av en enkelt protein Digest standard, slik som storfe serum albumin (BSA). Eluere med en kort gradering (dvs. 20 − 30 min).
Merk: flere injeksjoner av et protein fordøye vil bidra til å etablere Baseline LC/MS systemytelse, og gjenta injeksjon etter hver IP-MS prøve gir et mål på systemytelsen gjennom hele eksperimentet og gir mulighet for påvisning av instrumentet drift, som kan bias Label-gratis eksperimenter. En grunnlinje for de utvalgte individuelle topp-og topp-figurene vil informere om MS-, LC-og Kol onne ytelse. - For å unngå overbelastning av den analytiske søylen, Legg en liten del (15 − 30% av totalen) av en eksperimentell prøve på søylen og skill den med en gradering som passer for komplekse prøver (dvs. 2 − 3 h). Hvis antallet protein-IDer ikke er tilfredsstillende, laster du inn hele prøven på kolonnen.
- Kjør en enkelt protein fordøye standard i mellom prøvene å overvåke LC/MS systemytelse og prøve carryover. Flere standarder kan være nødvendig for å redusere prøve carryover avhengig av prøvene dine.
7. behandling av data
- Last ned Proteomikk programvarepakken MaxQuant funnet på https://www.maxquant.org/.
Merk: Dette vil bli brukt til å behandle RAW MS datafilen fra trinn 6,6 til datatabeller av protein IDer, gen navn, og kvantitative verdier knyttet til identifisering av disse for nedstrøms analyse.- Velg Load i Input data Subheader i RAW data -FANEN. Åpne filplasseringen der MS RAW-filene er lagret, og velg RAW-filer for hver MS/MS-kjøring.
- Klikk på gruppe-spesifikke kategorien og velg fordøyelsen. Innenfor enzymet listen velger LysC og klikk på høyre pilen for å legge dette enzymet inn i listen som skal brukes i søket. Deretter velger du instrument og kontrollerer at riktig instrument type vises i rullegardinlisten øverst på skjermen. La andre gruppespesifikke søkeparametre være på standardinnstillingene.
- Klikk kategorien globale parametere , og velg sekvenser. Legg til den aktuelle FASTA-filen for taksonomien som skal brukes i dette søket. Peptider vil ikke bli tildelt riktig hvis dette ikke er gjort. For den menneskelige proteom, laste ned FASTA filen fra UniProt på https://www.uniprot.org/help/human_proteome.
- I kategorien globale parametre klikker du på protein kvantifisering. I rullegardinmenyen for peptider for kvantifisering velger du unik + Razor.
Merk: MaxQuant tilbyr alternative kvantifisering av proteiner gjennom en intensitet-basert absolutt kvantifisering (iBAQ) og etikett fri kvantifisering (LFQ). Imidlertid er peptid telle informasjon tilstrekkelig for nedstrøms analyse i denne protokollen15. - Velg antall prosessorer som skal brukes for søket, nederst til venstre i MaxQuant-grensesnittet. Dette vil direkte påvirke hvor lang tid som kreves for å kjøre, så velg så mange som mulig for dette). Klikk på Start nederst til venstre på skjermen for å starte kjøringen. Velg kategorien ytelse øverst på skjermen for å vise fremdriften for søket.
- Når kjøringen er fullført, åpner du proteingroups. txt-filen i Perseus, en Proteomikk beregnings plattform eller et annet regnearkprogram for å vise dataene16.
- Bruk Perseus å fjerne vanlige forurensninger og treff til reversert protein sekvenser. Følg den detaljerte Perseus-dokumentasjonen på http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:use_cases:interactions.
Merk: åpning av proteingroups. txt filen i analyseprogramvare (for eksempel Excel) vil automatisk ødelegge visse gener og protein navn.
- Bruk Perseus å fjerne vanlige forurensninger og treff til reversert protein sekvenser. Følg den detaljerte Perseus-dokumentasjonen på http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:use_cases:interactions.
- Analyser eksperimentelle data ved hjelp av miljøgifter for affinitet rensing (CRAPome). Registrer en konto på dette depotet http://crapome.org/og Følg veiledningen som trengs17,18.
- Bruk Analyser data arbeidsflyten funnet på CRAPome hjemmeside. Velg eksterne kontroller som svarer til interesse rense systemet som brukes i dette samhandlings eksperimentet.
Merk: disse kontrollene kan brukes til å beregne en ny fold endring berikelse som er nyttig for å oppdage vanlige forurensninger. - Generer en inndatafil fra proteingroups. txt-utdata fra MaxQuant ved hjelp av Perseus eller et passende regnearkprogram. Du finner mer informasjon om manuell formatering på http://crapome.org/?q=fileformatting. Alternativt, bruk det forsynt R skriften "export_CRAPomeSAINT_Input_File. R" å utvikle det SAINT/CRAPome input arkiv. Se README. txt i Tilleggskode filer.
- Kjør en analyse for å bestemme fold-Change berikelse og SAINT (betydning analyse av INTeractome) sannsynlighet for hvert agn protein i immunutfelling. Kontroller at "bruker kontroller" er valgt i rullegardinmenyen under FC-A, "CRAPome kontroller" eller "alle kontroller" er valgt i FC-B rullegardinlisten og sannsynlighet score er valgt for å generere Saint sannsynligheter. Når kjøringen er fullført, kan du vise utdataene som er tilgjengelige under analyseresultater sammen med en jobb-ID. Last ned data Matrix fra "analyseresultater" for fremtidig plotting og data visualisering.
- Bruk Analyser data arbeidsflyten funnet på CRAPome hjemmeside. Velg eksterne kontroller som svarer til interesse rense systemet som brukes i dette samhandlings eksperimentet.
- Plot proteiner som en funksjon av FC-A (IPs vs bruker kontroller) og SAINT sannsynlighet ved å følge R-scripts som angitt i supplerende Coding files.
Merk: et sett med R-skript er gitt for å produsere plott av FC-A vs. SAINT sannsynlighet og iBAQ vs log2 (protein overflod), farget av justert p verdi spenner fra empirisk Bayes analyse av etiketten-frie intensitet. Detaljer om differensial statistisk analyse og plotting finnes i README. txt og R script "main_differential_analysis. R "i Tilleggskode filer. - Evaluer hvor kjent samspill proteiner av agn proteinet er rangert av FC-A og SAINT. Lag en grense på FC-A > 3,00 og SAINT > 0,7 for enkelt agn eksperimenter i tre eksemplarer som et utgangspunkt.
Merk: valg av cutoffs for en "High-Confidence" Interactor og en "lav-tillit" Interactor må informeres av biologisk informasjon.
8. data visualisering
Merk: det er mange programmer som effektivt kan visualisere Proteomikk data (f. eks R, Perseus, Cytoscape, STRING-DB). Analysering av tilkoblingsmuligheter mellom treff med høy sikkerhet og funksjonell berikelse av disse interaktører kan være en nyttig strategi for å prioritere treff for videre validering og funksjonell karakterisering.
- Last ned Cytoscape, en åpen kildekode nettverk visualisering verktøyet på https://cytoscape.org/download.html19.
- Klargjør en inndatafil for samhandlingsdata som en tabulatordelt fil som er formatert med tre kolonner: agn (kilde node), byttedyr (mål-node), samhandlings type (kant type). Dette kan gjøres i Perseus eller et regnearkprogram av ditt valg.
- Velg Importer tabell fra fil- ikonet mot øverst til venstre i programmet (angitt med en pil som peker nedover og en matrise i ikonet). Cytoscape vil automatisk fylle ut samhandlings dataene i et nettverk som er klart for egendefinert formatering og utforming.
- Velg stil -fanen på kontrollpanelet for Cytoscape og klikk på rutene i Def -kolonnen for å justere attributtet for hele nettverket. Velg bestemte noder eller kanter i nettverket, og velg deretter firkanten i Byp. Column i stil menyen for å hoppe over standardinnstillingene og bare justere markerte objekter. Du kan også klikke på rullegardinmenyen øverst i stil menyen for å vise de forhåndsinnstilte nettverks formatene.
Merk: STRING-DB protein-protein interaksjon data kan integreres i dette nettverket på dette tidspunktet enten manuelt gjennom input-filen eller gjennom ulike berikelse verktøy tilgjengelig som plug-ins i Cytoscape, http://apps.cytoscape.org/20. En anbefalt cytoscape plugg-inne for berikelse analyse er grunnlegge for http://apps.cytoscape.org/apps/cluego21. - For å øke tilliten til datasettet som genereres i denne arbeidsflyten, utfører du gjensidig IP-MS eller IP-vestlige eksperimenter som er rettet mot byttedyr proteiner av interesse som agn.
Representative Results
Flertallet av protein massen identifisert i et IP-MS eksperiment består av ikke-spesifikke proteiner. Dermed er en av de viktigste utfordringene i en IP-MS eksperiment tolkningen av hvilke proteiner er høy tillit interaktører vs uspesifisert interaktører. For å demonstrere de avgjørende parametrene som brukes i evalueringen av datakvalitet studien analysert tre eksemplarer immunoprecipitations fra 5 mg HeLa kjernefysisk ekstrakt utnytte en perle bare kontroll. Den første interne sjekken for å sikre at et IP-MS-eksperiment er pålitelig, er om lokke proteinet er rangert som en av de høyeste beriket proteinene som identifiseres av både fold-endring over kontroll og SAINT sannsynlighet. I dette tilfellet er agn DYRK1A rangert blant de tre øverste beriket proteiner over kontrollen (figur 2a,B). I en kjernefysisk interactome studie av DYRK1A utnytte fire uavhengige antistoffer, en FC-A cut-off på > 3.00 og SAINT sannsynlighet cut > 0.7 gitt en streng grense for identifisering av både romanen og tidligere validert interaktører22. Når brukt på dette eksperimentet, en klar separasjon kunne sees mellom høy tillit interaktører og > 95% av copurified proteiner identifisert som uspesifisert (figur 2a,B). Bruk av både en fold endring berikelse og sannsynlighet terskelen øker stringens ved å kreve en gjennomgående høy berikelse av protein IDer på tvers av biologiske replikerer.
I tillegg til statistisk scoring, den CRAPome analyse arbeidsflyt også kart tidligere rapportert interaksjoner på agn-byttedyr data23. Selv om denne tilordningen kan være nyttig for terskelverdi av høy og lav selvtillit, kan tidligere rapporterte samhandlinger score dårlig av FC-A og SAINT sannsynligheter, potensielt indikerer at mange kjente interaksjoner av et gitt agn kan eksistere bare i bestemte celletyper, kontekster, eller organeller. For eksempel DYRK1A datasett, iREF Interactor FC-A-verdier var så lavt som 0,45, som representerer en svært lav berikelse over kontroll (figur 2C). For å unngå inflasjon av falske positiver, statistisk terskelverdi bør utføres på en måte som prioriterer stringens over reduksjon av falske negativer. Det bør bemerkes at påvisning av disse interaksjoner var uavhengig av protein overflod (figur 2C). Beregnet absolutt kopi nummer av hver iREF interaksjon innen HeLa celler viste ingen sammenheng med oppdagelsen nivåer av en interaksjon partner ved IP-MS24.
Cytoscape fungerer som et effektivt verktøy for å visualisere flere lag med interaksjons data19. I DYRK1A immunutfelling eksperiment beskrevet her, den kombinerte bruken av FC-A > 3,0 og SAINT > 0,9 redusert listen over høy tillit interaktører til seks proteiner (figur 2D). Men når du bruker en FC-A-grense på > 3,0 i isolasjon, ble åtte ekstra proteiner lagt til nettverket. Disse ekstra protein interaktører har høy tilkoblingsmulighet med interaktører allerede i nettverket, noe som tyder på at de er forbundet i lignende komplekser eller funksjonelle roller. For dette formål ble bevis fra STRING-DB av protein-protein interaksjoner integrert i dette nettverket som blå stiplede linjer20. Mens dette enkelt agn, tre eksemplarer eksperiment gir et begrenset utvalg av full DYRK1A interaksjon nettverk, bruk av ekstra agn, replikerer, og integrering av store offentlige datasett kan brukes til å utvide nettverket av høy tillit interaksjoner. Den statistiske cutoffs vil dermed være spesifikk for hvert enkelt eksperiment og må evalueres grundig.
Figur 1: representant Proteomikk arbeidsflyt for SUBCELLULÆRE IP-MS. Cellene dyrkes i enten 4 L runde bunnen kanner eller 15 cm vev kultur retter og høstes på samme tid for subcellulære fraksjonering. Cellene fraksjonert inn i en cytosolic, kjernefysisk og en kjernefysisk pellet, og immunoprecipitations gjøres fra 1 − 10 mg Atom lysat ved hjelp av én eller flere antistoffer som anerkjenner den samme agnet. Filter hjulpet sample prep (FASP) og offline sample opprydding utføres før enkelt skudd masse massespektrometri. En nedstrøms pipeline brukes til å behandle data til interpretable samhandlingsdata. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representative data for et enkelt ANTISTOFF IP-MS-eksperiment med én agn. (A) FC-A og Saint sannsynlighet utdata fra CRAPome analyse arbeidsflyt for et optimalt eksperiment ved hjelp av et enkelt antistoff for kinase DYRK1A (n = 3). Kontroller med bare perler ble brukt til sammenligning. Røde solide linjer representerer cutoffs satt til FC-A > 3,00 og SAINT > 0,7. (B) MaxQuant protein overflod estimater (iBAQ) produksjon vs. log2 ratio av protein OVERFLOD i DYRK1A IP å kontrollere, farget av den justerte p verdi spenner fra empirisk Bayes analyse av etiketten-frie intensitet. (C) FC-A og estimert antall proteiner som er oppført som samhandling med proteiner i iRef-databasen23,24. (D) Cytoscape nettverk visualisering av DYRK1A interaktører. Blå noder = FC-A > 3,00, SAINT > 0,7. Oransje noder = FC-A-> 3,00. Sorte kanter = proteiner identifisert som interaktører i IPMS eksperiment. Blå stiplet kant = SAINT interaksjon mellom byttedyr protein (tillit >. 150). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Protease inhibitor (PI) blanding | |
| Reagens | Endelig konsentrasjon |
| Natrium Metabisulfite | 1 mM med |
| Benzamidine | 1 mM med |
| Dithiotreitol (DTT) | 1 mM med |
| Phenylmethanesulfonyl fluor (PMSF) | 0,25 mM |
| Fosfatase inhibitor (PhI) blanding | |
| Reagens | Endelig konsentrasjon |
| Microcystin LR | 1 μM av |
| Natrium Orthovanadate | 0,1 mM |
| Natrium Fluor | 5 mM av |
| Subcellulære fraksjonering buffere: | |
| Buffer A pH 7,9 | |
| Reagens | Endelig konsentrasjon |
| HEPES | 10 mM av |
| MgCl2 | 1,5 mM |
| KCl | 10 mM av |
| Buffer B pH 7,9 | |
| Reagens | Endelig konsentrasjon |
| HEPES | 20 mM |
| MgCl2 | 1,5 mM |
| Nacl | 420 mM |
| Ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) | 0,4 mM |
| Glyserol | 25% (v/v) |
| Buffer C pH 7,9 | |
| Reagens | Endelig konsentrasjon |
| HEPES | 20 mM |
| MgCl2 | 2 mM med |
| KCl | 100 mM |
| Ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) | 0,4 mM |
| Glyserol | 20% (v/v) |
| Immunutfelling buffere: | |
| IP-buffer 1 | |
| Reagens | Endelig konsentrasjon |
| HEPES | 20 mM |
| KCl | 150 mM |
| Edta | 0,1 mM |
| NP-40 | 0,1% (v/v) |
| Glyserol | 10% (v/v) |
| IP-buffer 2 | |
| Reagens | Endelig konsentrasjon |
| HEPES | 20 mM |
| KCl | 500 mM |
| Edta | 0,1 mM |
| NP-40 | 0,1% (v/v) |
| Glyserol | 10% (v/v) |
| SDS Alkylation buffer pH 8,5 | |
| Reagens | Endelig konsentrasjon |
| Sds | 4% (v/v) |
| Chloroacetamide | 40 mM |
| TCEP | 10 mM av |
| Tris | 100 mM |
| UA pH 8,5-er | |
| Reagens | Endelig konsentrasjon |
| Urea | 8 M |
| Tris | 0,1 til 5m |
| * Bruk HPLC grade H2O | |
Tabell 1: buffer komposisjoner
Supplerende Coding filer. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Den Proteomikk arbeidsflyten som er skissert her, gir en effektiv metode for å identifisere protein interaktører med høy tillit for et protein av interesse. Denne tilnærmingen reduserer utvalgs kompleksiteten gjennom subcellulære brøkdel og fokuserer på å øke identifikasjons samarbeidspartnerne gjennom robust prøve forberedelser, frakoblet prøve opprydding og streng kvalitetskontroll av LC-MS-systemet. Den nedstrøms dataanalyse beskrevet her gir mulighet for en enkel statistisk evaluering av proteiner identifisert som copurifying med agn. Men på grunn av et høyt antall eksperimentelle variabler (skala, cellelinje, antistoff valg), krever hvert eksperiment ulike cutoffs og betraktninger om data visualisering og berikelse.
Den første design vurdering i et IP-MS eksperiment er utvalget av antistoffer som vil bli brukt til copurification av protein av interesse sammen med sine samarbeidspartnere. Mens tilgjengeligheten av kommersielle antistoffer har ekspandert til å dekke større deler av den menneskelige proteom de siste ti årene, er det fortsatt mange proteiner som reagenser er begrenset. I tillegg kan antistoffer som har blitt validert for applikasjoner som Western Blot deteksjon, være ute av stand til selektiv berikelse av mål proteinet i et immunutfelling eksperiment. Før gjennomføre en storstilt interaksjon Proteomikk eksperiment, er det foreslått å fullføre en IP fra en 90% confluent 10 cm parabol, eller tilsvarende celle nummer, og sonde for målet protein av interesse av vestlige blotting. Hvis mer enn ett enkelt antistoff er tilgjengelig for immunutfelling, foreslås det i tillegg å velge flere antistoffer som gjenkjenner epitopes i ulike deler av proteinet. Bindingen av et antistoff til et agn protein kan tette det nødvendige bindings grensesnittet for antatte samarbeidspartnere. Valg av en sekundær epitope for agn proteinet vil øke dekningen av samspillet profilen identifisert av et masse massespektrometri-basert eksperiment.
En annen viktig faktor ligger i valg av den aktuelle kontrollen for å skille høy tillit interaksjoner fra lav-tillit eller uspesifisert interaksjoner fra de som er identifisert som copurifying med agn. Den strengeste kontrollen for et IP-MS-eksperiment er å fullføre immunutfelling fra en CRISPR KO-cellelinje på agnet. En slik kontroll gjør det mulig å identifisere og filtrere ut av ikke-spesifikke proteiner som binder seg direkte til antistoff i stedet for agn proteinet. I tilfeller der det ikke er mulig å generere en CRISPR KO-cellelinje for hvert agn protein, kan en IgG-perle kontroll av den samme isotype av agn-antistoff brukes. I eksperimenter ansette et panel av antistoffer som representerer flere arter, bruk av en perle bare kontroll kan være hensiktsmessig, men vil øke frekvensen av falske positiver identifisert som høy tillit interaktører.
Valg av cellelinjen som brukes i et IP-MS-eksperiment, er avhengig av flere nøkkelfaktorer. Protein uttrykk og lokalisering er i stor grad avhengig av celle type. Mens RNA uttrykket anslag kan bli funnet for de fleste gener i mange brukte cellelinjer, protein uttrykk er dårlig korrelert med RNA uttrykk og må fastsettes eksperimentelt25. Cellelinjer der et agn protein uttrykkes i svært lav kopi nummer bør unngås for å omgå problemer forbundet med drastiske økninger i celle kulturen skala som kan være nødvendig. Det bør bemerkes, men at prøven preparatet kan optimaliseres for påvisning av svært lav overflod proteiner. Den filter hjulpet sample prep (FASP) metoden, mens robust, kan føre til en mer enn 50% tap av peptid i en prøve. Den single-Pot solid-fase-forbedret sample Preparation (SP3) er en effektiv metode for å generere prøver for masse massespektrometri analyse som minimerer prøve tap26. Det forhøyet det å bli frisk satt i stand til av det SP3 metoden av eksemplar forberedelse kan en nyttig alternativ i denne arbeidsstyrke for kvantifisering av protein det falle like ved grensen av oppdagelsen.
Denne Proteomikk arbeidsflyten har blitt brukt på tvers av mange kjernefysiske agn, inkludert kinaser, E3 ubiquitin ligases, og stillas medlemmer av multisubunit komplekser. Hvis du antar at riktig validering av antistoff reagenser, vil en vellykket utførelse av denne arbeidsflyten føre til at protein samarbeidspartnere med høy tillit til proteiner er av interesse.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av en Grand Challenge Grant til W.M.O. fra Linda Crnic Institute for Down syndrom og av en DARPA samarbeidsavtale 13-34-RTA-FP-007. Vi vil gjerne takke Jesse Kurland og Kira Cozzolino for deres bidrag i å lese og kommentere manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| 4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561096 | |
| acetone (HPLC) | Thermo Fisher Scientific | A949SK-4 | |
| Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column | Millipore Sigma | UFC503096 | |
| Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | |
| benzonase | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| Dialysis tubing closure | Caroline Biological Supply Company | 684239 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47724 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 887845 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| HeLa QC tryptic digest | Pierce | 88329 | |
| HEPES | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| KONTES Dounce homogenizer 7 ml | VWR | KT885300-0007 | |
| Large Clearance pestle 7ml | VWR | KT885301-0007 | |
| Lysyl endopeptidase C | VWR | 125-05061 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Microcystin | enzo life sciences | ALX-350-012-C100 | |
| Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma-Aldrich | 98379 | |
| p84 antibody | GeneTex | GTX70220 | |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Pierce BSA Protein Digest, MS grade | Thermo Fisher Scientific | 88341 | LCMS QC |
| Pierce C18 spin columns | Thermo Fisher Scientific | PI-89873 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | For mass spectrometry sample prep |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0780-01 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0618-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Silica emitter tip | Pico TIP | FS360-20-10 | |
| Small Clearance pestle 7ml | VWR | KT885302-0007 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing | Thomas Scientific | 3787K17 | |
| TC Dish 150, Standard | Sarstedt | 83.3903 | Tissue culture dish for adherent cells |
| TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
| TCEP | Thermo Scientific | PG82080 | |
| TFA | Thermo Fisher Scientific | 28904 | |
| Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS | Thermo Fisher Scientific | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | 29700 | |
| Waters ACQUITY M-Class UPLC | Waters | ||
| Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7µm Spherical Hybrid (1.7 µm, 75 µm x 250 mm) | Waters | 186007484 | nanoflow C18 column |
References
- Varjosalo, M., et al. The protein interaction landscape of the human CMGC kinase group. Cell Reports. 3, 1306-1320 (2013).
- Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. Overview of Affinity Tags for Protein Purification. Current Protocols in Protein Science. 73, (2013).
- Mahmood, N., Xie, J. An endogenous 'nonspecific' protein detected by a His-tag antibody is human transcription regulator YY1. Data in Brief. 2, 52 (2015).
- Zordan, R. E., Beliveau, B. J., Trow, J. A., Craig, N. L., Cormack, B. P. Avoiding the ends: internal epitope tagging of proteins using transposon Tn7. Genetics. 200, 47-59 (2015).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10, 715-721 (2013).
- Bronicki, L. M., et al. Ten new cases further delineate the syndromic intellectual disability phenotype caused by mutations in DYRK1A. European Journal of Human Genetics. 23, 1482-1487 (2015).
- Antonarakis, S. E. Down syndrome and the complexity of genome dosage imbalance. Nature Reviews Genetics. , (2016).
- Dowjat, W. K., et al. Trisomy-driven overexpression of DYRK1A kinase in the brain of subjects with Down syndrome. Neuroscience Letters. 413, 77-81 (2007).
- Fotaki, V., et al. Dyrk1A haploinsufficiency affects viability and causes developmental delay and abnormal brain morphology in mice. Molecular and Cellular Biology. 22, 6636-6647 (2002).
- Hämmerle, B., Elizalde, C., Tejedor, F. J. The spatio-temporal and subcellular expression of the candidate Down syndrome gene Mnb/Dyrk1A in the developing mouse brain suggests distinct sequential roles in neuronal development. European Journal of Neuroscience. 27, 1061-1074 (2008).
- Funakoshi, E., et al. Overexpression of the human MNB/DYRK1A gene induces formation of multinucleate cells through overduplication of the centrosome. BMC Molecular and Cell Biology. 4, 12 (2003).
- Yu, D., Cattoglio, C., Xue, Y., Zhou, Q. A complex between DYRK1A and DCAF7 phosphorylates the C-terminal domain of RNA polymerase II to promote myogenesis. Nucleic Acids Research. , 1-14 (2019).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11, 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13, 731-740 (2016).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: A contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10, 730-736 (2013).
- Choi, H., et al. SAINT: Probabilistic scoring of affinity purificationg-mass spectrometry data. Nature Methods. 8, 70-73 (2011).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13, 2498-2504 (2003).
- Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45, 362-368 (2017).
- Bindea, G., et al. ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks. Bioinformatics. 25, 1091-1093 (2009).
- Guard, S. E., et al. The nuclear interactome of DYRK1A reveals a functional role in DNA damage repair. Scientific Reports. 9, 6539 (2019).
- Razick, S., Magklaras, G., Donaldson, I. M. iRefIndex: A consolidated protein interaction database with provenance. BMC Bioinformatics. 9, 405 (2008).
- Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells. Nature Methods. 11, 319-324 (2014).
- Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165, 535-550 (2016).
- Hughes, C. S., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10, 757 (2014).
