Summary
Beskrevet er en proteomics workflow for at identificere protein interaktion partnere fra en nuklear subcellulære fraktion ved hjælp af immun affinitet berigelse af et givet protein af interesse og label-fri massespektrometri. Arbejdsprocessen omfatter subcellulære fraktionering, immunopræcipitation, filter Aided prøveforberedelse, offline oprydning, massespektrometri, og en downstream Bioinformatik pipeline.
Abstract
Immun affinitet rensning massespektrometri (IP-MS) er dukket op som en robust kvantitativ metode til at identificere protein-protein interaktioner. Denne publikation præsenterer en komplet interaktion proteomics workflow designet til at identificere lav overflod protein-protein interaktioner fra kernen, der også kunne anvendes til andre subcellulære rum. Denne arbejdsgang omfatter subcellulære fraktionering, immunoprecipitation, prøveforberedelse, offline oprydning, enkelt skudt label-fri massespektrometri, og downstream beregningsmæssige analyse og datavisualisering. Vores protokol er optimeret til påvisning af opdelte, lave overflod interaktioner, der er svære at identificere fra hele celle lysater (f. eks. transkriptionsfaktor interaktioner i kernen) ved immunopræcipitation af endogene proteiner fra fraktionerede subcellulære rum. Prøve forberedelses rørledningen skitseret her giver detaljerede instruktioner til fremstilling af HeLa celle nukleare ekstrakt, immun affinitet rensning af endogene agn protein, og kvantitativ massespektrometri analyse. Vi diskuterer også metodologiske overvejelser for at udføre storstilet immunopræcipitation i massespektrometri-baserede interaktions profilerings eksperimenter og giver retningslinjer for evaluering af datakvaliteten for at skelne ægte positivt protein interaktioner fra ikke-specifikke interaktioner. Denne fremgangsmåde er påvist her ved at undersøge den nukleare interactome af CMGC kinase, DYRK1A, en lav forekomst protein kinase med dårligt definerede interaktioner i kernen.
Introduction
Den menneskelige proteom udviser stor strukturel og biokemisk diversitet gennem dannelsen af stabile multisubunit komplekser og forbigående protein-protein interaktioner. Derfor er det almindeligt nødvendigt at identificere interaktions partnere for et protein af interesse i undersøgelser for at afdække molekyl mekanismen. Nylige fremskridt inden for affinitets rensning protokoller og fremkomsten af høj opløsning hurtig scanning massespektrometri instrumentering har gjort det muligt let kortlægning af protein interaktion landskaber i en enkelt upartisk eksperiment.
Protein interaktions protokoller anvender almindeligvis ektopiske udtryks systemer med affinitets mærkede fusions konstruktioner til at identificere protein interaktioner uden at kræve antistoffer af høj kvalitet, der genkender et protein af interesse1,2. Men, epitop tag-baserede metoder har flere ulemper. Fysiske interaktioner med epitop kan føre til påvisning af ikke-specifikke copurificerende proteiner3. Desuden kan fusion af disse epitop Tags til N-eller C-terminalen af et protein blokere indfødte protein-protein interaktioner, eller forstyrre proteinfoldning at fremme ikke-fysiologiske konstellationer4. Desuden overudtrykker ektopisk-udtryks systemer typisk agn-proteinet ved suprafysiologiske koncentrationer, hvilket kan resultere i identifikation af kunstige protein interaktioner, især for doserings følsomme gener5. For at omgå disse problemer, kan den endogene agn protein være immunoprecipitated sammen med tilhørende interagerende bytte proteiner, forudsat tilgængeligheden af en høj kvalitet antistof, der genkender den indfødte protein.
Forudsat her er en interaktion proteomics workflow for påvisning af nukleare interactome af et endogene protein ved hjælp af CMGC protein kinase DYRK1A som et eksempel. Afbrydelse af DYRK1A kopi nummer, aktivitetsniveau, eller udtryk kan forårsage alvorlige intellektuelle handicap hos mennesker, og embryonale dødelighed i mus6,7,8,9. DYRK1A udstiller dynamisk spatiotemporale regel10, og opdelte protein interaktioner11,12, der kræver tilgange i stand til at detektere lav overflod interaktions partnere specifikke for forskellige subcellulære rum.
Denne protokol anvender cellulær fraktionering af humane HeLa-celler til cytosol og nucleoplasma fraktioner, immunopræcipitation, prøveforberedelse til massespektrometri og en oversigt over en bioinformatisk pipeline til evaluering af datakvalitet og visualisering af resultater, med R-scripts til analyse og visualisering (figur 1). Proteomics softwarepakker, der anvendes i dette workflow er alle frit tilgængelige for download eller kan tilgås via en web-grænseflade. For yderligere information om software og beregningsmæssige metoder, dybdegående tutorials og instruktion er tilgængelige på de medfølgende links.
Protocol
Bemærk: alle buffer sammensætninger og proteaseblandinger er skitseret i tabel 1.
1. klargøring af celler
Bemærk: der ønskes et udgangsmateriale på 1 − 10 mg atomlyat pr. replikat for denne immunopcipitation-massespektrometri (IP-MS)-tilgang. Der vil blive givet celle mængder for 1 mg nukleare immunopræcipitationer i tre eksemplarer plus triplicatkontroller.
- Hvis du bruger en vedklædning cellelinje, vokse cellerne til 90% konfluency i 3 x 15 cm retter per replikat før høst.
Bemærk: det anbefales at udføre mindst tre replikate immunopræcipitationer for agn og kontrolbetingelser. Denne protokol vil antage brugen af "perler kun" Kontroller, som styrer for rigelige uspecifikke interaktioner med perlerne, begyndende ved punkt 4. Andre typer kontrolelementer kan være nyttige. Disse er beskrevet i dybden i diskussionsafsnittet.- Vask pladerne 2x med fosfat bufferet saltvand (PBS) og trypsinize celler med 3 mL 0,25% trypsin pr. 15 cm plade. Spin ned cellerne ved 1.200 x g i 5 min og dekanteres trypsin.
- For suspension celler, vokse til en lignende skala/tæthed for at opnå 70 − 80 mg af total protein.
- Pellet celler ved 1.200 x g og 4 °c i 5 min. dekor mediet omhyggeligt.
Bemærk: pellets kan kombineres under dette trin for at muliggøre effektiv behandling ved hjælp af den store subcellulære fraktionering, der er skitseret i afsnit 2.
- Pellet celler ved 1.200 x g og 4 °c i 5 min. dekor mediet omhyggeligt.
- Celle pellet 2x skylles med PBS + 5 mM MgCl2 suppleret med proteasehæmmere (pi'er) og fosfatasehæmmere (Phis) (Se tabel 1).
Bemærk: celle pellets kan være opfrosset i flydende nitrogen og opbevares ved-80 °C, indtil de er klar til fraktionering.
2. fremstilling af Atom ekstrakt
Bemærk: protease-og fosfatasehæmmere skal tilsættes til fraktionerings bufferne inden for 30 min. brug.
- Hvis frosset, tø cellen pellets for 15 min i 1x pellet volumen af kold buffer A + pi'er/PhIs. Celle pellet anbringes på en nutator ved 4 °C for at hjælpe med opslæmning under optøning. Ellers resuspension celle pellet fra trin 1,3 i 1x pellet Volume buffer A + pi'er/PhIs.
- Pellet ved 2.000 x g og 4 °c i 10 min. for at lokke bufferen.
- Afbryd cellerne med 5x den pakkede celle volumen med buffer A og Inkuber på is i 20 minutter.
- Pellet ved 2.000 x g og 4 °c i 10 min. decant bufferen og resuspension med 2x original pakket celle volumen buffer A + pi'er/Phis og dounce ~ 7x med "A"/løs Pestle.
- Du centrifugeres lyset i 10 minutter ved 2.000 x g og 4 °c.
- Pipetten forsigtigt af supernatanten og flash fryseren med flydende nitrogen. Opbevar lysbilledet ved-80 °C. Supernatanten fra dette trin er cytosolisk subcellulære fraktion.
Bemærk: den nukleare pellet kan gemmes under dette trin ved Flash frysning med flydende nitrogen og opbevaring ved-80 °C - Resuspension af pellet med 0,9 x pellet volumen buffer B + pi'er/PhIs og bland på en nutator i 5 min ved 4 °C.
- For at lyse kerner, dounce 20x med en strammere Pestle "B".
- Bland det nukleare lysværk på en nutator i 30 min ved 4 °C, så den er homogen.
- Det nukleare lysværk centrifugeres i 30 minutter ved 21.000 x g ved 4 °c. Pipette af supernatanten og Gem som et opløseligt nukleart proteinekstrakt.
Bemærk: Nukleasebehandling af den resulterende nukleare pellet giver mulighed for genopretning af en kromatin-associeret protein fraktion. - Det opløselige nukleare ekstrakt dialyserer mod buffer C + pi'er i 3 timer ved 4 °C.
- Skær en passende længde på 24 mm bredde dialyse slange med en 8 kDa molekylvægt afskåret. Klem den ene side af slangen og belastnings nukleoplasmaet ind i røret. Efter Ilægning af lysningen fast klemmer den anden ende og nedsænkes i en ren glasbeholder, der indeholder buffer C + pi'er.
- Det dialyserede nukleare ekstrakt/nucleoplasmaet centrifugeres ved 21.000 x g ved 4 °c i 30 min. aliquot 3X 20 μl volumener af Atom ekstrakt til fraktionerings validering af Western blot. Den nukleare ekstrakt, der anvendes til IP-MS-analyse kan aliciteres og blinke frosset i flydende nitrogen og opbevares ved-80 °C, hvis det er nødvendigt.
3. validering af subcellulære fraktionering
- Fuldfør en proteinanalyse for at bestemme proteinkoncentrationen af det nukleare lysværk. En bicinchoninsyre-proteinanalyse giver tilstrækkelig følsomhed for downstream-anvendelse.
- 20 μg af både cytosolisk og nukleare fraktioner på en SDS-side gel til den vestlige blot analyse som tidligere beskrevet13. Spring baner ved lastning for at undgå mischaracterization af en prøve.
- Sonde den vestlige blot for P84 (THOC1) som en nuklear markør, og gapdh som en cytosolisk markør. Bestemme omfanget af fraktionering med forholdet mellem cytosolisk markør i den nukleare fraktion og vice versa.
Bemærk: antistoffer for andre nukleare og cytosolisk markører kan anvendes.
4. immunopræcipitation af endogene nukleare agn protein
Bemærk: det anbefales at bruge lav retention rør fra dette punkt på. Dette vil reducere den uspecifikke binding til rørene under prøvehåndtering og undgå unødigt tab af prøven. Sørg desuden for, at LCMS grade H2O bruges til at forberede buffere til de resterende trin.
- Forbered en protein A/G perle blanding for hver replikat ved at kombinere 12,5 μL perle volumen for både protein-A og protein-G i mikrocentrifuge glas. Opbevar perle bestandene som en gylle, der indeholder 20% ethanol. Bestem koncentrationen af perler inden for gylle% (v/v) og pipetten den nødvendige volumen ved hjælp af en pipettespids, der er blevet skåret på spidsen for at sikre, at perlerne kan komme ind i spidsen.
- Vask proteinet A/G perle blandingen 2x med 300 μL af IP-buffer 1. Drej perlerne ved 1.500 x g ved 4 °c i 1 min. og dekanteres buffer.
- Forbered antistof-protein A/G perler: for at binde antistoffet til perlerne tilsættes 300 μL af IP-buffer 1 og 10 μg af det ønskede antistof. Lad perlen/antistof blandingen klippe på en nutator ved 4 °C natten over. For perle-kun kontrol, ikke tilføje nogen antistof.
Bemærk: i alt 10 μg antistof pr. replikat kan anvendes som udgangspunkt, men det nøjagtige beløb skal optimeres for hvert enkelt antistof og omfanget af det lysat, der anvendes i forsøget - Tø de nukleare lysater fra trin 2,10 i et vandbad og alikvotpassende volumener i mikrocentrifuge glas med lav retention for 1 mg protein input pr. replikat.
- Drej lysatet ved 16.000 x g i 30 min. og Overfør supernatanten til et nyt rør.
- Der tilsættes 1 μL benzonase (250 enheder/μL) pr. 1 mg af det nukleare lysværk og sten på en nutator ved 4 °C i 10 − 15 minutter.
- Forbered perler til preclea ring lysatet. Tilsæt 12,5 μL af hver protein A og protein G perler til 1,5 mL lav retention rør som i trin 4,1. Vask 2x med IP vask buffer 1 + pi'er og dekarre bufferen.
- Tilsæt 1 mg af det nukleare lysat til perlerne fra trin 4,5. Inkuber på en nutator i 1 time ved 4 °C.
- Der centrifugeres præclearede lysater ved 1.500 x g og 4 °c i 1 min.
- Mens nukleare lysater inkuberet med perler i trin 4.5.1, vask antistof-protein A/G perler 2x med IP buffer 1 + pi'er. Centrifugeres ved 1.500 x g og 4 °c i 1 min. og dekanteres buffer.
- Det præclearede nukleare lysværk overføres fra trin 4.6.1 til antistof-protein A/G-perlerne. Inkubér, mens du Rocking på en nutator ved 4 °C i 4 timer. centrifuge efter inkubatoren ved 1.500 x g og 4 °c i 1 min.
- Supernatanten overføres til rør, som er mærket som flow igennem for hver replikat.
- Antistof-protein A/G-perler vaskes med 1 mL IP-buffer 2 + pi'er. Centrifuge ved 1.500 x g og 4 °c i 1 min, dekanteres buffer, og Gentag for i alt 3x.
- Vask perlerne 2x med 1 mL IP-buffer 1 + pi'er centrifuger som i det foregående trin. Sørg for, at alle buffer er fjernet efter den sidste vask.
- Elute 2x med 20 μL 0,1 M Glycin (pH 2,75) i 30 minutter hver. Sørg for, at rørene rokker under inkubationen med elueringsbufferen. Spin ved 750 x g og 4 °c i 1 min, og afpipetteres supernatanten efter hver 30 min. inkubation.
Bemærk: mens den lave pH glycin metode, der er beskrevet her, elutter de fleste agn proteiner, nogle antistof-antigen interaktioner kræver strengere buffer betingelser. - Flash fryse eluerer i flydende nitrogen og opbevares ved-80 °C.
5. forberedelse af prøven
Bemærk: insulin spidset ind i immunopræcipitation elueringsprøver aids i genvinding af proteiner under trichloreddikesyre (TCA) nedbør og prøve behandling, hvilket er vigtigt for lav forekomst endogene agn proteiner.
- Tø eluaterne ved stuetemperatur, hvis de er frosne.
- Prøverne placeres på is og tilsættes 10 μL 1,0 mg/mL insulin for hver 100 μL eluat. Straks tilsættes 10 μL 1% natriumdeoxycholat. Vortex prøven igen, og tilsæt 30 μL 20% TCA efterfulgt af en sidste hvirvel.
- Prøverne inkubates i 20 min., derefter centrifugeres ved 21.000 x g ved 4 °c i 30 minutter.
- Supernatanten tilsættes, og 0,5 mL acetone, som er blevet forkølet til-20 °C. Vortex og drej derefter ved 21.000 x g og 4 °c i 30 min. Gentag dette trin.
- Aspirere supernatanten og lufttørre pellet tilbage i bunden af røret.
- Forbered prøven til massespektrometri ved hjælp af en modificeret filter assisteret prøve prep-metode (FASP), der er optimeret til at reducere prøve håndteringen, som beskrevet nedenfor14.
- Resuspension af protein pellet fra trin 5.1.4 med 30 μL SDS Alkylerings buffer (Se tabel 1). Prøven inkubates på en 95 °C varmeblok i 5 min. Lad det køle ved stuetemperatur i 15 min før forud for næste trin.
- Tilsæt 300 μL UA-opløsning og 30 μL 100 mM TCEP til hver prøve. Indlæs denne løsning på et 30k centrifugal filter. Drej centrifugal filteret ved 21.000 x g ved stuetemperatur i 10 minutter.
Bemærk: agn protein og dets formodede eksterne bør være bundet til filteret på dette punkt. Men strømmen gennem kan holdes, i tilfælde af at der er et problem med filteret. - Filteret vaskes med 250 μL UA, og der centrifugeres ved 21.000 x g i 10 min. du skal gennemgå flowet og gentage det i alt 3x.
- Filteret vaskes med 100 μL 100 mM Tris pH 8,5, og der centrifugeres ved 21.000 x g i 10 min. for at gennemgå flowet og gentage i alt 3x.
- Tilsæt 3 μL 1 μg/μL lys C ophængt i 0,1 M Tris pH 8,5. Fyld filtrene op til 100 μL mærket og lad det fordøje i 1 time ved 37 °C, mens du Rocking på en nutator.
- Tilsæt 1 μL 1 μg/μL MS-grad trypsin. Bland forsigtigt og gør det muligt for trypsin at inkubere med prøven natten over ved 37 °C, mens du Rocking på en nutator.
- Centrifugeres ved 21.000 x g i 20 minutter for at elueres peptid fra filteret.
Bemærk: der kan være behov for flere Centrifugerings runder for at inddrive hele eluatet. Hvis dette ikke er gjort, der er et potentiale for svær prøve tab.
- Afhold peptiderne ved hjælp af C18-spin kolonner. Følg den protokol, der er leveret af producenten.
- Det lyofiliserede peptid opslæmmes i 7 μL 0,1% TFA i 5% acetonitril. Prøv at soniere prøven i 3 minutter for at sikre, at peptiderne er blevet resuspenderet. Spin ned på 14.000 x g i 10 min.
- Det resuspenderede peptid overføres til et passende prøve hætteglas til lastning på væskekromatografi – massespektrometri (LC/MS) system.
6. LC/MS-systemets egnethed
Bemærk: på grund af den lille skala og generelt lavere overflod af protein fra affinitets rensede prøver, er det afgørende, at LC/MS platformen opererer med en maksimal følsomhed og robusthed.
- Der tilsættes 1 mL LC/MS-type myresyre til 1 liter LC/MS-kvalitet vand til Mobil fase A, og der tilsættes 1 mL LC/MS-type myresyre til 1 L LC/MS-klasse acetonitril til Mobil fase B.
- Forbered eller Installer en 75 μm sammensmeltet-silica kapillarkolonne pakket med < 2 μm omvendt fase C18-harpiks, der er ≥ 250 mm i længden. De bedste resultater vil blive haft med en direkte injektion af prøver i kolonnen.
- Fjern ultra Performance Liquid kromatografi (UPLC) systemet med nye mobile faser. Med en C18 kolonne installeret, etablere en stabil flowhastighed og elektro spray med en passende emitter (dvs., 20 μm id x 360 μm OD trukket til en 10 μm spids). Kolonnen bevares ved 40 − 60 °C.
- Test den samlede LC/MS systemydeevne ved at injicere en kompleks kvalitetskontrol standard, såsom 100 − 200ng af en HeLa hele celle lysat trypticase Digest. Elute med en passende gradient for en kompleks prøve (dvs. 2 − 3 h gradient elueringstid). Fastlægge et system for basissystemets ydeevne af peptid-og protein identifikationer.
Bemærk: for at opnå de bedste resultater vil 3000 − 5000 eller flere protein identifikationer fra 20000 − 35000 unikke peptider give optimal ydeevne til eksperimentelle prøver. - Ved rutinemæssig LC/MS-system egnethed indsprøjtes 100 − 200 fmol eller derunder af en enkelt protein fordøje standard, såsom bovin serum albumin (BSA). Elute med en kort gradient (dvs. 20 − 30 min).
Bemærk: flere injektioner af et protein Digest vil hjælpe med at etablere grundlæggende LC/MS systemydeevne, og Gentag injektion efter hver IP-MS prøve giver et mål for systemets ydeevne i hele eksperimentet og giver mulighed for påvisning af instrument drift, som kan bias label-fri eksperimenter. En grundlinje for Select Individual peak intensiteter og Peak figurer vil informere om MS, LC, og kolonne ydeevne. - For at undgå overbelastning af den analytiske kolonne skal en lille portion (15 − 30% af totalen) af en eksperimentel prøve indlades på søjlen og adskilles ved hjælp af en gradient, der egner sig til komplekse prøver (dvs. 2 − 3 timer). Hvis antallet af protein identifikationer er utilfredsstillende, indlæses hele prøven på søjlen.
- Kør en enkelt protein Digest standard i mellem prøver for at overvåge LC/MS-systemets ydeevne og prøveoverførsel. Der kan være behov for flere standarder for at reducere prøve fremløbet afhængigt af dine prøver.
7. data behandling
- Download den proteomics softwarepakke MaxQuant fundet på https://www.maxquant.org/.
Bemærk: Dette vil blive brugt til at behandle RAW MS data File fra trin 6,6 i datatabeller af protein-id'er, gennavne og kvantitative værdier, der er forbundet med identifikationen af disse til downstream-analyse.- Vælg Indlæs i under overskriften input data under fanen RAW-data . Åbn den filplacering, hvor MS RAW-filerne er gemt, og vælg RAW-filer for hver MS/MS-kørsel.
- Klik på den gruppespecifikke fane, og vælg fordøjelse. Inden for enzym listen skal du vælge Lysc og klikke på højre pil for at tilføje dette enzym til listen, der vil blive brugt i søgningen. Vælg derefter instrument , og sørg for, at den korrekte instrumenttype vises på rullelisten øverst på skærmen. Efterlad andre gruppespecifikke søgeparametre på standardindstillinger.
- Klik på fanen globale parametre , og vælg sekvenser. Tilføj den relevante FASTA-fil til den taksonomi, der skal bruges i denne søgning. Peptider vil ikke blive tildelt korrekt, hvis dette ikke er gjort. For den menneskelige proteome, downloade FASTA fil fra UniProt på https://www.uniprot.org/help/human_proteome.
- Klik på protein kvantificeringunder fanen globale parametre . I rullemenuen peptider til kvantificering skal du vælge Unique + Razor.
Bemærk: MaxQuant tilbyder alternativ kvantificering af proteiner gennem intensitets baseret absolut kvantitering (iBAQ) og label-fri kvantitation (LFQ). Oplysninger om peptidoptællingen er imidlertid tilstrækkelige til downstream-analysen i denne protokol15. - Vælg det antal processorer, der skal bruges til søgningen, nederst til venstre i grænsefladen MaxQuant. Dette vil direkte påvirke længden af tid, der kræves til kørslen, så vælg så mange som muligt for dette). Klik på Start nederst til venstre på skærmen for at starte kørslen. Vælg fanen ydeevne øverst på skærmen for at se status for søgningen.
- Når kørslen er fuldført, skal du åbne filen proteingroups. txt i Perseus, en proteomics beregning platform eller et andet regnearksprogram for at få vist dataene16.
- Brug Perseus til at fjerne almindeligt forurenende stoffer og hits til omvendte protein sekvenser. Følg den detaljerede Perseus dokumentation på http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:use_cases:interactions.
Bemærk: åbning af filen proteingroups. txt i Analysis software (f. eks., Excel) vil automatisk korrupte visse gen-og protein navne.
- Brug Perseus til at fjerne almindeligt forurenende stoffer og hits til omvendte protein sekvenser. Følg den detaljerede Perseus dokumentation på http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:use_cases:interactions.
- Analysér eksperimentelle data ved hjælp af Kontaminant depotet til affinitet rensning (CRAPome). Registrer en konto på denne repository http://crapome.org/og følg tutorial efter behov17,18.
- Brug arbejdsprocessen Analysér dine data , som findes på CRAPome-startsiden. Vælg eksterne kontrolelementer, der svarer til det affinitets rensningssystem, der bruges i dette interaktions eksperiment.
Bemærk: disse kontroller kan bruges til at beregne en anden fold ændring berigelse, der er nyttig til påvisning af almindeligt forurenende stoffer. - Generer en input-fil fra proteingroups. txt output fra MaxQuant ved hjælp af Perseus eller en passende regnearks applikation. Detaljer for manuel formatering kan findes på http://crapome.org/?q=fileformatting. Alternativt kan du bruge det medfølgende R-script "export_CRAPomeSAINT_Input_File. R" til at generere SAINT/CRAPome-input filen. Se README. txt i de supplerende kodnings filer.
- Kør en analyse for at bestemme fold-ændring berigelse og SAINT (signifikans analyse af INTeractome) sandsynlighed for hver lokkemad protein i immunoprecipitation. Sørg for, at ' User Controls' er valgt i rullemenuen under FC-A, ' crapome Controls ' eller ' all Controls ' er valgt i FC-B drop-down og Sandsynligheds score er valgt til at generere Saint sandsynligheder. Når kørslen er afsluttet, skal du se det output, der er tilgængeligt under "analyseresultater" sammen med et job-id. Download data matrixen fra ' analyseresultaterne ' for fremtidig plotning og datavisualisering.
- Brug arbejdsprocessen Analysér dine data , som findes på CRAPome-startsiden. Vælg eksterne kontrolelementer, der svarer til det affinitets rensningssystem, der bruges i dette interaktions eksperiment.
- Plot proteiner som en funktion af FC-A (IPs vs. User Controls) og SAINT sandsynlighed ved at følge R-scripts som fastsat i supplerende kodning filer.
Bemærk: der findes et sæt R-scripts til produktion af plots af FC-A vs. SAINT sandsynlighed og iBAQ vs. log2 (protein tæthed), farvet af den justerede p-værdi spænder fra empirisk Bayes-analyse af de etiket frie intensiteter. Detaljerne i den differentierede statistiske analyse og plotte findes i readme. txt og R script "main_differential_analysis. R "i de supplerende kodnings filer. - Evaluere, hvor kendte interagere proteiner af agn protein er rangeret af FC-A og SAINT. Lav en cutoff af FC-a > 3,00 og Saint > 0,7 for enkelt agn eksperimenter i tre eksemplarer som udgangspunkt.
NOTE: udvælgelse af nedskæringer for en "høj-tillid" interskuespiller og en "lav-tillid" interactor skal informeres af biologiske oplysninger.
8. data visualisering
Bemærk: der er mange programmer, der effektivt kan visualisere proteomics data (f. eks R, Perseus, Cytoscape, STRING-DB). Analysere forbindelsen mellem høj-tillid hits, og funktionelle berigelse af disse eksterne kan være en nyttig strategi for prioritering hits for yderligere validering og funktionel karakterisering.
- Download Cytoscape, et open source netværk visualisering værktøj på https://cytoscape.org/download.html19.
- Forbered en input-fil til interaktionsdata som en tabulatorsepareret fil, der er formateret med tre kolonner: agn (kilde node), bytte (målnode), interaktionstype (kanttype). Dette kan gøres i Perseus eller et regnearksprogram af dit valg.
- Vælg import tabellen fra filikonet øverst til venstre i programmet (angivet med en nedadgående pil og en matrix i ikonet). Cytoscape vil automatisk udfylde interaktionsdata i et netværk klar til brugerdefineret formatering og design.
- Vælg fanen typografi på kontrolpanelet for Cytoscape, og klik på firkanterne i def -kolonnen for at justere attributten for hele netværket. Vælg bestemte noder eller kanter i netværket, og vælg derefter kvadratet i Byp. -kolonnen i menuen typografi for at tilsidesætte standardindstillingerne og kun justere markerede objekter. Alternativt kan du klikke på rullemenuen øverst i menuen typografi for at få vist de forudindstillede netværks formater.
Bemærk: STRING-DB protein-protein interaktion data kan integreres i dette netværk på dette tidspunkt enten manuelt via input-fil eller gennem forskellige berigning værktøjer til rådighed som plug-ins i Cytoscape, http://apps.cytoscape.org/20. En anbefalet cytoscape plug-in til tilsætning analyse findes på http://apps.cytoscape.org/apps/cluego21. - For at øge tilliden til datasættet genereret i dette workflow, udføre gensidige IP-MS eller IP-vestlige eksperimenter, der er målrettet bytte proteiner af interesse som agn.
Representative Results
Størstedelen af den proteinmasse, der identificeres i et IP-MS-eksperiment, består af ikke-specifikke proteiner. En af de vigtigste udfordringer i et IP-MS-eksperiment er således fortolkningen af, hvilke proteiner der er højt tillidsskabende mellem aktører og ikke-specifikke interaktører. For at demonstrere de afgørende parametre, der anvendes i evalueringen af datakvalitet undersøgelsen analyserede tre eksemplarer immunoprecipitationer fra 5 mg Hela nukleare ekstrakt udnytter en perle kun kontrol. Den første interne kontrol for at sikre, at et IP-MS-eksperiment er pålideligt, er, om agn proteinet rangerer som et af de højest berigede proteiner, der identificeres ved begge fold-Skift over kontrol og HELGEN sandsynlighed. I dette tilfælde, agn DYRK1A rangeret blandt de tre bedste beriget proteiner over kontrol (figur 2a,B). I en nuklear interactome undersøgelse af DYRK1A udnytter fire uafhængige antistoffer, en FC-en cutoff af > 3.00 og Saint sandsynlighed cutoff > 0,7 leverede en streng cutoff til identifikation af både roman og tidligere validerede eksterne22. Ved anvendelse af dette eksperiment kunne der ses en klar adskillelse mellem de højt tillidsskabende interaktører og > 95% af de kopurificerede proteiner, som er identificeret som uspecifikke (figur 2a,B). Anvendelse af både en fold ændring berigelse og sandsynlighed tærskel øger strenghed ved at kræve en konsekvent høj berigelse af protein IDs på tværs af biologiske replikater.
Ud over statistisk scoring knytter CRAPome-analyse arbejdsgangen også tidligere rapporterede interaktioner til Bait-Prey-data23. Mens denne kortlægning kan være nyttig for tærskel høj og lav-tillid interaktioner, tidligere rapporterede interaktioner kan score dårligt af FC-A og Saint sandsynligheder, potentielt indikerer, at mange kendte interaktioner af en given agn kan eksistere kun i specifikke celletyper, sammenhænge, eller organelles. For eksempel DYRK1A DataSet var iREF interactor FC-A-værdierne så lave som 0,45, hvilket repræsenterer en meget lav berigelse over kontrol (figur 2c). For at undgå inflation af falske positiver bør statistisk tærskel udføres på en måde, der prioriterer strenghed over reduktion af falske negativer. Det skal bemærkes, at påvisning af disse interaktioner var uafhængig af protein overflod (figur 2c). Det beregnede absolutte kopi nummer for hver iREF-interaktion i HeLa-cellerne viste ingen korrelation til detekterings niveauerne for en interaktions partner af IP-MS24.
Cytoscape fungerer som et effektivt værktøj til visualisering af flere lag af interaktionsdata19. I det DYRK1A-eksperiment, der er beskrevet her, reducerede den kombinerede anvendelse af FC-A > 3,0 og Saint > 0,9 listen over eksterne med høj sikkerhed til seks proteiner (figur 2D). Men ved anvendelse af en FC-en cutoff af > 3,0 isoleret, blev yderligere otte proteiner føjet til netværket. Disse yderligere protein eksterne har høj konnektivitet med de eksterne allerede i netværket, hvilket tyder på de er forbundet i lignende komplekser eller funktionelle roller. Til dette formål blev dokumentation fra STRENGEN-DB af protein-protein interaktioner integreret i dette netværk som blå stiplede linjer20. Mens denne single-agn, tre eksemplarer eksperiment giver en begrænset stikprøve af den fulde DYRK1A interaktion netværk, brug af yderligere lokkemad, replikater, og integration af store offentlige datasæt kan bruges til at udvide netværket af høj-tillid interaktioner. De statistiske nedskæringer vil således være specifikke for hvert enkelt eksperiment og skal evalueres grundigt.
Figur 1: repræsentative proteomics workflow for subcellulære IP-MS. Celler dyrkes i enten 4 L runde nederste kolber eller 15 cm væv kultur retter og høstes på samme tid for subcellulære fraktionering. Celler er fraktioneret til en cytosolic, nuklear, og en nuklear pellet, og immunopræcipitationer er udført fra 1 − 10 mg af nukleare lysat ved hjælp af en eller flere antistoffer genkende den samme agn. Filter Aided Sample prep (FASP) og offline prøve oprydning udføres før Single Shot massespektrometri. En downstream-beregnings pipeline bruges til at behandle data i interaktionsdata, der kan fortolkes. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative data for et enkelt-antistof-IP-MS-eksperiment med én agn. A) FC-A-og Saint-Sandsynligheds udgang fra arbejdsgangen for CRAPome-analyse for et optimalt eksperiment med et enkelt antistof for KINASE DYRK1A (n = 3). Perler-kun kontrol blev brugt til sammenligning. Red solid Lines repræsenterer cutoffs sat i FC-A > 3,00 og SAINT > 0,7. B) estimater for maxquant protein tæthed (iBAQ)-output vs. LOG2 forholdet mellem protein tæthed i DYRK1A IP til kontrol, farvet af den justerede p-værdi spænder fra empirisk Bayes-analyse af de etiket frie intensiteter. C) FC-A og anslået kopiantal af proteiner, der er opført som interagerende proteiner i iref-databasen23,24. (D) Cytoscape netværks visualisering af DYRK1A Interactors. Blue nodes = FC-A > 3,00, Sankt > 0,7. Orange noder = FC-A > 3,00. Sorte kanter = proteiner identificeret som eksterne i ipms eksperiment. Blå stiplet kant = SAINT interaktion mellem Prey protein (tillid >. 150). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Blanding af proteasehæmmer (PI) | |
| Reagens | Endelig koncentration |
| Natriummetabisulfit | 1 mM |
| Benzamidin | 1 mM |
| Dithiothreitol (DTT) | 1 mM |
| Phenylmethanesulfonylfluorid (PMSF) | 0,25 mM |
| Blanding af fosfatasehæmmer (PhI) | |
| Reagens | Endelig koncentration |
| Microcystin LR | 1 μM |
| Natriumorthovanadat | 0,1 mM |
| Natriumfluorid | 5 mM |
| Subcellulære fraktionerings buffere: | |
| Buffer A pH 7,9 | |
| Reagens | Endelig koncentration |
| HEPES | 10 mM |
| MgCl2 | 1,5 mM |
| KCl | 10 mM |
| Buffer B pH 7,9 | |
| Reagens | Endelig koncentration |
| HEPES | 20 mM |
| MgCl2 | 1,5 mM |
| Nacl | 420 mM |
| Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) | 0,4 mM |
| Glycerol | 25% (v/v) |
| Buffer C pH 7,9 | |
| Reagens | Endelig koncentration |
| HEPES | 20 mM |
| MgCl2 | 2 mM |
| KCl | 100 mM |
| Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) | 0,4 mM |
| Glycerol | 20% (v/v) |
| Buffere med immunopræcipitation: | |
| IP-buffer 1 | |
| Reagens | Endelig koncentration |
| HEPES | 20 mM |
| KCl | 150 mM |
| Edta | 0,1 mM |
| NP-40 | 0,1% (v/v) |
| Glycerol | 10% (v/v) |
| IP-buffer 2 | |
| Reagens | Endelig koncentration |
| HEPES | 20 mM |
| KCl | 500 mM |
| Edta | 0,1 mM |
| NP-40 | 0,1% (v/v) |
| Glycerol | 10% (v/v) |
| SDS Alkylerings buffer pH 8,5 | |
| Reagens | Endelig koncentration |
| Sds | 4% (v/v) |
| Chloracetamid | 40 mM |
| TCEP | 10 mM |
| Tris | 100 mM |
| UA pH 8,5 | |
| Reagens | Endelig koncentration |
| Urinstof | 8 M |
| Tris | 0,1 M |
| * Brug HPLC grade H2O | |
Tabel 1: buffer sammensætninger
Supplerende kodnings filer. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Den proteomics workflow skitseret her giver en effektiv metode til at identificere høj-tillid protein eksterne for et protein af interesse. Denne fremgangsmåde mindsker kompleksiteten af eksemplet gennem subcellulære brøk og fokuserer på at øge identifikations interaktions partnerne gennem robust prøveforberedelse, offline prøve oprydning og streng kvalitetskontrol af LC-MS-systemet. Den analyse af downstream-data, der beskrives her, giver mulighed for en simpel statistisk vurdering af de proteiner, der identificeres som kopurificerende med agn. Men på grund af et stort antal eksperimentelle variabler (skala, cellelinje, antistof valg), hvert eksperiment kræver forskellige cutoffs og overvejelser vedrørende datavisualisering og berigelse.
Det første design overvejelse i et IP-MS eksperiment er udvælgelsen af antistoffer, der vil blive anvendt til copurifikation af det protein af interesse sammen med sine interagerende partnere. Mens tilgængeligheden af kommercielle antistoffer er udvidet til at dække større dele af den menneskelige proteom i løbet af de sidste mange årtier, er der stadig mange proteiner, for hvilke reagenser er begrænset. Desuden kan antistoffer, der er blevet valideret til applikationer såsom Western blot detektion, være ude af stand til selektiv berigelse af målproteinet i et immunopcipitation eksperiment. Forud for gennemførelsen af en storstilet interaktion proteomics eksperiment, foreslås det at fuldføre en IP fra en 90% flydende 10 cm parabol, eller tilsvarende celle nummer, og sonde for målet protein af interesse ved vestlige blotting. Hvis der er mere end et enkelt antistof til rådighed for immunopræcipitation, foreslås det desuden at vælge flere antistoffer, der genkender epitoper inden for forskellige dele af proteinet. Binding af et antistof til et lokkemad kan indbinde den nødvendige bindende grænseflade for formodede interagerende partnere. Udvælgelse af en sekundær epitop for agn protein vil øge dækningen af interaktionsprofilen identificeret ved en massespektrometri-baseret eksperiment.
En anden større overvejelse ligger i udvælgelsen af passende kontrol for at skelne høj-tillid interaktioner fra lav-tillid eller uspecifikke interaktioner fra dem, der identificeres som copurificerende med agn. Den strengeste kontrol for et IP-MS-eksperiment er at fuldføre chromatinimmunpræcipitation fra en crispr ko cellelinje af agn. En sådan kontrol muliggør identifikation og filtrering af ikke-specifikke proteiner, der binder direkte til antistoffet i stedet for agn proteinet. I tilfælde, hvor det ikke er muligt at generere en CRISPR KO-cellelinje af hvert lokkemad, kan der anvendes en IgG-perle kontrol af samme isotype af agn-antistoffet. I eksperimenter med et panel af antistoffer, der repræsenterer flere arter, kan brugen af en perler kun kontrol være passende, men vil øge antallet af falske positiver identificeret som høj-tillid Interactors.
Udvælgelsen af den cellelinje, der anvendes i et IP-MS-eksperiment, afhænger af flere nøglefaktorer. Protein ekspression og lokalisering er i høj grad afhængig af celletype. Mens RNA-udtryks estimater kan findes for de fleste gener i mange almindeligt anvendte cellelinjer, er protein ekspression dårligt korreleret med RNA-udtryk og skal bestemmes eksperimentelt25. Cellelinjer, hvor en agn protein udtrykkes i meget lav kopi nummer bør undgås at omgå problemer i forbindelse med drastiske stigninger i cellekultur skala, der kan være påkrævet. Det skal dog bemærkes, at prøveforberedelse kan optimeres til påvisning af meget lave forekomst proteiner. Den filter Aided prøve prep (FASP) metode, mens robust, kan forårsage en mere end 50% tab af peptid i en prøve. Single-pot solid-fase-forstærket Prøveforberedelse (SP3) er en effektiv metode til at generere prøver til massespektrometri analyse, der minimerer Sample tab26. Den forøgede opsving aktiveret af den SP3 metode i prøveforberedelse kan en nyttig alternativ i indeværende arbejdsgang nemlig kvantificering i proteiner at falde i nærheden af den grænse i opdagelse.
Denne proteomics workflow er blevet anvendt på tværs af mange nukleare lokturer, herunder kinaser, E3 ubiquitin ligaser, og stilladser medlemmer af multisubunit komplekser. Forudsat korrekt validering af antistof reagenser, vellykket udførelse af denne arbejdsgang vil resultere i påvisning af høj-tillid protein nukleare interaktion partnere for et protein af interesse.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af en stor udfordring Grant til W.M.O. fra Linda Crnic Institute for down Syndrome og af en DARPA samarbejdsaftale 13-34-RTA-FP-007. Vi vil gerne takke Jesse Kurland og Kira Cozzolino for deres bidrag i læsning og kommentering på manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin, 0.1% EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 1.5 ml low-rention microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| 4-20% Mini PROTEAN TGX Precast Protein Gels | Bio-Rad | 4561096 | |
| acetone (HPLC) | Thermo Fisher Scientific | A949SK-4 | |
| Amicon Ultra 0.5 ml 30k filter column | Millipore Sigma | UFC503096 | |
| Benzamidine | Sigma-Aldrich | 12072 | |
| benzonase | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Chloroacetamide | Sigma-Aldrich | C0267 | |
| Dialysis tubing closure | Caroline Biological Supply Company | 684239 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | 10197777001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47724 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | 887845 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| HeLa QC tryptic digest | Pierce | 88329 | |
| HEPES | Fisher Scientific | AAJ1692630 | |
| insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| KONTES Dounce homogenizer 7 ml | VWR | KT885300-0007 | |
| Large Clearance pestle 7ml | VWR | KT885301-0007 | |
| Lysyl endopeptidase C | VWR | 125-05061 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | 208337 | |
| Microcystin | enzo life sciences | ALX-350-012-C100 | |
| Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma-Aldrich | 98379 | |
| p84 antibody | GeneTex | GTX70220 | |
| Phosphate Buffered Saline | |||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Pierce BSA Protein Digest, MS grade | Thermo Fisher Scientific | 88341 | LCMS QC |
| Pierce C18 spin columns | Thermo Fisher Scientific | PI-89873 | |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | For mass spectrometry sample prep |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0780-01 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-0618-01 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Silica emitter tip | Pico TIP | FS360-20-10 | |
| Small Clearance pestle 7ml | VWR | KT885302-0007 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 201154 | |
| Sodium metabisulfite | Sigma-Aldrich | 31448 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| Spectra/ Por 8 kDa 24 mm dialysis tubing | Thomas Scientific | 3787K17 | |
| TC Dish 150, Standard | Sarstedt | 83.3903 | Tissue culture dish for adherent cells |
| TCA | Sigma-Aldrich | T9159 | |
| TCEP | Thermo Scientific | PG82080 | |
| TFA | Thermo Fisher Scientific | 28904 | |
| Thermo Scientific Orbitrap Fusion MS | Thermo Fisher Scientific | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | 29700 | |
| Waters ACQUITY M-Class UPLC | Waters | ||
| Waters ACQUITY UPLC M-Class Column Reversed-Phase 1.7µm Spherical Hybrid (1.7 µm, 75 µm x 250 mm) | Waters | 186007484 | nanoflow C18 column |
References
- Varjosalo, M., et al. The protein interaction landscape of the human CMGC kinase group. Cell Reports. 3, 1306-1320 (2013).
- Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. Overview of Affinity Tags for Protein Purification. Current Protocols in Protein Science. 73, (2013).
- Mahmood, N., Xie, J. An endogenous 'nonspecific' protein detected by a His-tag antibody is human transcription regulator YY1. Data in Brief. 2, 52 (2015).
- Zordan, R. E., Beliveau, B. J., Trow, J. A., Craig, N. L., Cormack, B. P. Avoiding the ends: internal epitope tagging of proteins using transposon Tn7. Genetics. 200, 47-59 (2015).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10, 715-721 (2013).
- Bronicki, L. M., et al. Ten new cases further delineate the syndromic intellectual disability phenotype caused by mutations in DYRK1A. European Journal of Human Genetics. 23, 1482-1487 (2015).
- Antonarakis, S. E. Down syndrome and the complexity of genome dosage imbalance. Nature Reviews Genetics. , (2016).
- Dowjat, W. K., et al. Trisomy-driven overexpression of DYRK1A kinase in the brain of subjects with Down syndrome. Neuroscience Letters. 413, 77-81 (2007).
- Fotaki, V., et al. Dyrk1A haploinsufficiency affects viability and causes developmental delay and abnormal brain morphology in mice. Molecular and Cellular Biology. 22, 6636-6647 (2002).
- Hämmerle, B., Elizalde, C., Tejedor, F. J. The spatio-temporal and subcellular expression of the candidate Down syndrome gene Mnb/Dyrk1A in the developing mouse brain suggests distinct sequential roles in neuronal development. European Journal of Neuroscience. 27, 1061-1074 (2008).
- Funakoshi, E., et al. Overexpression of the human MNB/DYRK1A gene induces formation of multinucleate cells through overduplication of the centrosome. BMC Molecular and Cell Biology. 4, 12 (2003).
- Yu, D., Cattoglio, C., Xue, Y., Zhou, Q. A complex between DYRK1A and DCAF7 phosphorylates the C-terminal domain of RNA polymerase II to promote myogenesis. Nucleic Acids Research. , 1-14 (2019).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11, 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13, 731-740 (2016).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: A contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10, 730-736 (2013).
- Choi, H., et al. SAINT: Probabilistic scoring of affinity purificationg-mass spectrometry data. Nature Methods. 8, 70-73 (2011).
- Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13, 2498-2504 (2003).
- Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45, 362-368 (2017).
- Bindea, G., et al. ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks. Bioinformatics. 25, 1091-1093 (2009).
- Guard, S. E., et al. The nuclear interactome of DYRK1A reveals a functional role in DNA damage repair. Scientific Reports. 9, 6539 (2019).
- Razick, S., Magklaras, G., Donaldson, I. M. iRefIndex: A consolidated protein interaction database with provenance. BMC Bioinformatics. 9, 405 (2008).
- Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells. Nature Methods. 11, 319-324 (2014).
- Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165, 535-550 (2016).
- Hughes, C. S., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10, 757 (2014).
