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Developmental Biology

मॉरिन न्यूरोजेनेसिस के दौरान नॉच सिग्नलिंग डायनेमिक्स की रियल-टाइम बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग

Published: December 12, 2019 doi: 10.3791/60455
Automatic Translation
1, 1,2,3,4
1Institute for Frontier Life and Medical Sciences, Kyoto University, 2Institute for Integrated Cell-Material Sciences (iCeMS), Kyoto University, 3Kyoto University Graduate School of Medicine, 4Kyoto University Graduate School of Biostudies

Summary

तंत्रिका स्टेम/जनक कोशिकाएं नॉच सिग्नलिंग घटकों की विभिन्न अभिव्यक्ति गतिशीलता प्रदर्शित करती हैं जो सेलुलर घटनाओं के विभिन्न परिणामों का कारण बनती हैं । इस तरह की गतिशील अभिव्यक्ति वास्तविक समय की निगरानी से प्रकट किया जा सकता है, स्थिर विश्लेषण से नहीं, एक अत्यधिक संवेदनशील बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके जो जीन अभिव्यक्तियों में तेजी से परिवर्तन के दृश्य को सक्षम बनाता है।

Abstract

नॉच सिग्नलिंग सेल-सेल इंटरैक्शन द्वारा तंत्रिका स्टेम/जनक कोशिकाओं के रखरखाव को नियंत्रित करता है । नॉच सिग्नलिंग के घटक गतिशील अभिव्यक्ति प्रदर्शित करते हैं। नॉच सिग्नलिंग इफेक्टर हेस1 और नॉच लिगामेंट डेल्टा-लाइक1 (Dll1) को तंत्रिका स्टेम/प्रोजेनिटर कोशिकाओं में दोलन तरीके से व्यक्त किया जाता है । क्योंकि इन जीनों की ऑसिलेक्टरी एक्सप्रेशन की अवधि बहुत कम (2 एच) होती है, इसलिए उनकी चक्रीय अभिव्यक्ति पर नजर रखना मुश्किल होता है। जीन अभिव्यक्ति या प्रोटीन गतिशीलता में इस तरह के तेजी से परिवर्तन की जांच करने के लिए, तेजी से प्रतिक्रिया संवाददाताओं की आवश्यकता है । अपनी तेजी से परिपक्वता गतिज और उच्च संवेदनशीलता के कारण, बायोल्यूमिनेसेंस रिपोर्टर लूसिफेरेज़ जीवित कोशिकाओं में तेजी से जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन ों की निगरानी करने के लिए उपयुक्त है। हम प्रमोटर गतिविधि की निगरानी के लिए एक अस्थिर लूसिफ़ेरेज रिपोर्टर का इस्तेमाल किया और एकल सेल संकल्प पर प्रोटीन गतिशीलता की दृश्य के लिए एक लूसिफ़ेरेज-फ्यूज्ड रिपोर्टर । ये बायोल्यूमिनेसेंस रिपोर्टर्स तेजी से कारोबार दिखाते हैं और बहुत कमजोर संकेत पैदा करते हैं; इसलिए, हमने ऐसे बेहोश संकेतों का पता लगाने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम विकसित किया है। ये विधियां हमें जीवित कोशिकाओं और ऊतकों में विभिन्न जीन अभिव्यक्ति गतिशीलता की निगरानी करने में सक्षम बनाती हैं, जो वास्तविक सेलुलर राज्यों को समझने में मदद करने के लिए महत्वपूर्ण जानकारी हैं।

Introduction

स्तनधारी मस्तिष्क बड़ी संख्या में विभिन्न प्रकार के न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं से बना है। सभी कोशिकाएं तंत्रिका स्टेम/जनक कोशिकाओं (एनपीसी) से उत्पन्न होती हैं, जो पहले अपनी संख्या का विस्तार करने के लिए पैदा होती हैं, फिर न्यूरॉन्स में अंतर करना शुरू करती हैं, और अंत में ग्लियल कोशिकाओं को जन्म देती हैं1,2,3,4,5। एक बार कोशिकाओं को न्यूरॉन्स में अंतर कर दिया है, वे पैदा या अपनी संख्या में वृद्धि नहीं कर सकते हैं, और इसलिए, बाद के चरणों तक NPCs के रखरखाव महत्वपूर्ण है । सेल-सेल इंटरैक्शन के माध्यम से पायदान सिग्नलिंग एनपीसी6,7को बनाए रखने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । पायदान लिगांड पड़ोसी कोशिकाओं की सतह पर झिल्ली प्रोटीन, पायदान के साथ बातचीत करते हैं और नॉच प्रोटीन को सक्रिय करते हैं। सक्रियण के बाद, नॉच प्रोटीन का प्रोटेलियोलिसिस होता है, जिससे कोशिका झिल्ली से नॉभलियस8,9,10में नॉच (एनआईसीडी) के इंट्रासेल्युलर डोमेन को जारी किया जाता है। नाभिक में, एनआईसीडी Hes1 और Hes5 (Hes1/5)के प्रमोटर क्षेत्रों को बांधता है और इन जीन की अभिव्यक्ति को सक्रिय करता है । Hes1/5 प्रवण जीन Ascl1 और Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14की अभिव्यक्ति को दबाना । क्योंकि प्रवण जीन न्यूरोनल भेदभाव को प्रेरित करते हैं, Hes1/5 एनपीसी को बनाए रखने में आवश्यक भूमिकाएं निभाते हैं । इसके अलावा, के रूप में प्रवण जीन पायदान लिगांड डेल्टा की अभिव्यक्ति को सक्रिय कर सकते है-like1 (Dll1), Hes1/5 भी Dll1की अभिव्यक्ति को दबाना । इसलिए, Dll1 की अभिव्यक्ति पड़ोसी कोशिकाओं को नॉच सिग्नलिंग के माध्यम से Dll1 के लिए नकारात्मक होने की ओर ले जाती है। इस तरह, कोशिकाएं आसन्न कोशिकाओं को उनके समान भाग्य का पालन करने से रोकती हैं, एक घटना जिसे पार्श्व अवरोध8के रूप में जाना जाता है। विकासशील मस्तिष्क में, पार्श्व अवरोध विभिन्न विभिन्न कोशिका प्रकारों को उत्पन्न करने में भूमिका निभाता है।

एकल कोशिका स्तर पर रीयल - टाइम इमेजिंग एनपीसी15,16,17में नॉच सिग्नलिंग के घटकों की गतिशील अभिव्यक्ति का पता चलता है । नॉच सिग्नलिंग Hes1की अभिव्यक्ति को सक्रिय करता है, लेकिन Hes1 प्रोटीन अपने प्रमोटर को बांधता है और अपनी अभिव्यक्ति को दबाता है। इसके अलावा, Hes1 एक अत्यंत अस्थिर प्रोटीन है, जो सर्वव्यापी-प्रोटेसोम मार्ग से अपमानित है; इसलिए, अपने स्वयं के प्रमोटर का दमन केवल अल्पकालिक होता है और फिर प्रतिलेखन फिर से शुरू होता है। इस तरह, Hes1 की अभिव्यक्ति 2 एच चक्र18में प्रतिलेखन और अनुवाद दोनों स्तरों पर दोलन करती है। हे1 की आदोलनीय अभिव्यक्ति,बदले में, आवधिक दमन15,16,17,19के माध्यम से एसीसीएल 1, न्यूरोजी2 और Dll1 जैसे डाउनस्ट्रीम लक्ष्य जीन की दोलन अभिव्यक्ति को प्रेरित करती है। जबकि प्रवण जीन न्यूरोनल भेदभाव को प्रेरित कर सकते हैं, उनकी दोलन अभिव्यक्ति न्यूरोनल भेदभाव के लिए पर्याप्त नहीं है; बल्कि उनकी निरंतर अभिव्यक्ति न्यूरोनल भेदभाव के लिए आवश्यक है। न्यूरोनल विभेदन14,15,16को प्रेरित करने के बजाय एनपीसी को बनाए रखने के लिए प्रवणीय जीन की आदोलनात्मक अभिव्यक्ति महत्वपूर्ण है । Dll1 की अभिव्यक्ति न्यूरोजेनेसिस और सोमिटोजेनेसिस जैसे विभिन्न मॉर्फोजेनेसिस के दौरान ट्रांसक्रिप्शन और ट्रांसलेशनल दोनों स्तरों पर दोलन करती है। Dll1 की गतिशील अभिव्यक्ति सामान्य मॉर्फोजेनेसिस के लिए महत्वपूर्ण है और Dll1 की स्थिर अभिव्यक्ति न्यूरोजेनेसिस और सोमिटोजेनेसिस17में दोषलाती है । ये निष्कर्ष विभिन्न विकासात्मक घटनाओं के नियमन पर जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन काइनेटिक्स की गतिशीलता वाले महत्वपूर्ण कार्य को प्रदर्शित करते हैं (यानी, विभिन्न अभिव्यक्ति गतिशीलता सेलुलर व्यवहार में विभिन्न आउटपुट का उत्पादन करती है)।

नॉच सिग्नलिंग की गतिशीलता का विश्लेषण करने के लिए, ऊतकों और कोशिकाओं का स्थिर विश्लेषण अपर्याप्त है क्योंकि वे लगातार बदल रहे हैं। एकल कोशिकाओं की वास्तविक समय इमेजिंग जीन अभिव्यक्ति में गतिशीलता को प्रकट करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। नॉच सिग्नलिंग अणुओं की गतिशील अभिव्यक्ति 2-3 घंटे की अवधि में तेजी से चक्रीय प्रतिक्रियाओं से गुजरती है। यह तेजी से आवधिक अभिव्यक्ति वास्तविक समय की निगरानी के लिए दो कठिन समस्याओं को प्रस्तुत करता है: (1) अणुओं की अभिव्यक्ति को निम्न स्तर तक दबा दिया जाता है, और (2) तेजी से कारोबार के लिए तेजी से प्रतिक्रिया संवाददाताओं की आवश्यकता होती है। इन समस्याओं को दूर करने के लिए, हमने पहले एक बायोल्यूमिनेसेंस रियल-टाइम इमेजिंग विधि20विकसित की थी। क्योंकि बायोल्यूमिनेसेंस रिपोर्टर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स की तुलना में उच्च संवेदनशीलता और कम परिपक्वता समय है, यह रणनीति हमें जीवित कोशिकाओं में तेजी से गतिशीलता की निगरानी करने में सक्षम बनाती है। वास्तविक समय दृश्य का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि अधिक जीन गतिशील अभिव्यक्ति का प्रदर्शन से हम पहले सोचा था । इसके अलावा, जीवित कोशिकाओं में अभिव्यक्ति और प्रोटीन गतिशीलता और विभिन्न जैविक घटनाओं में इन गतिशीलता के महत्व को दिखाने वाली रिपोर्टों की संख्या में वृद्धि हुई है, जो जीन अभिव्यक्तियों21,22में गतिशीलता की मौलिक भूमिका का सुझाव देता है।

इस रिपोर्ट में, हम दोनों विसोसिएटसंस्कृतियों और कॉर्टिकल स्लाइस संस्कृतियों में एनपीसी में नॉच लिगांड Dll1 की अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए एक तरीका का वर्णन करते हैं । एकल सेल स्तर पर Dll1 प्रतिलेखन की गतिशीलता की निगरानी करने के लिए, हमने पीडीसी1-यूबी-फ्लूक रिपोर्टर, एक Dll1 प्रमोटर संचालित अस्थिर लूसिफ़ेरे रिपोर्टर को ले जाने वाले ट्रांसजेनिक चूहों के भ्रूण टेलेंसेफेलोन से प्राप्त एनपीसी की विसोशिएट संस्कृतियों को उत्पन्न किया। वीवो में Dll1 प्रोटीन गतिशीलता की निगरानी के लिए, हमने कॉर्टेक्स में एनपीसी में Dll1-Fluc फ्यूजन रिपोर्टर पेश किया और कॉर्टिकल स्लाइस संस्कृतियों में एनपीसी में रिपोर्टर की अभिव्यक्ति की कल्पना की । रीयल-टाइम इमेजिंग ने हमें उच्च लौकिक संकल्प पर जीवित कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन गतिशीलता की विभिन्न विशेषताओं को पकड़ने में सक्षम बनाया।

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Protocol

क्योटो विश्वविद्यालय के फ्रंटियर लाइफ एंड मेडिकल साइंसेज संस्थान में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा पशु विषयों सहित सभी प्रक्रिया को अनुमोदित किया गया है ।

1. बायोल्यूमिनेसेंस रिपोर्टर

नोट: लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर गिरावट संकेत को फ्यूज करके प्रमोटर गतिविधि की तेजी से गतिशीलता को मापने के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, लूसिफ़ेरेफ्यूजन रिपोर्टर एकल कोशिका में प्रोटीन गतिशीलता की निगरानी में सक्षम बनाता है। दोनों प्रकार के रिपोर्टर मोनो-लेयर कल्चर (विसोशन कल्चर) और टिश्यू कल्चर (स्लाइस कल्चर) एक्सपेरिमेंट के लिए उपलब्ध हैं ।

  1. Dll1 प्रमोटर गतिविधि की निगरानी के लिए रिपोर्टर17
    नोट: जीन अभिव्यक्ति में तेजी से परिवर्तन की निगरानी के लिए, तेजी से प्रतिक्रिया और अस्थिर रिपोर्टर आवश्यक है । जुगनू लूसिफ़ेराज़ (Fluc) फ्लोरेसिन संवाददाताओं की तुलना में तेजी से परिपक्वता दिखाता है। क्योंकि सर्वव्यापी जुड़े ल्यूसिफ़ेरेज रिपोर्टर (यूबी-फ्लूक) तेजी से गिरावट और तेजी से कारोबार से पता चलता है, यह बहुत जीवित कोशिकाओं में गतिशील जीन अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए उपयोगी है20।
    1. Dll1 प्रमोटर संचालित अस्थिर ल्यूसिफ़ेरेरिपोर्टर, सर्वव्यापी ल्यूसिफ़ेरेज़ (pDll1-Ub-Fluc, चित्रा 1एक ऊपरी पैनल), एक प्रतिलेखन स्तर17पर Dll1 अभिव्यक्ति में तेजी से परिवर्तन की निगरानी के लिए।
    2. इस रिपोर्टर की स्थिर अभिव्यक्ति के लिए pDll1-Ub-Fluc ले जाने के लिए एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन उत्पन्न करें।
  2. Dll1 प्रोटीन गतिशीलता17की निगरानी के लिए रिपोर्टर ।
    1. दस्तक चूहों की पीढ़ी के लिए, Dll1 कोडिंग क्षेत्र के 3 ' टर्मिनी में लूसिफ़ेरेसी सीडीएनए डालें ताकि Dll1-ल्यूसिफ़ेरेस फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त किया जाए (Dll1-Fluc रिपोर्टर, चित्रा 1ए,लोअर पैनल)17।
    2. लूसिफ़ेरे गतिविधि को मापने के द्वारा प्रोटीन स्तर पर Dll1 की अभिव्यक्ति गतिशीलता की निगरानी करें।
    3. ऊतक के स्तर पर Dll1 प्रोटीन गतिशीलता की निगरानी के लिए, गर्भाशय इलेक्ट्रोपोराशन में द्वारा भ्रूण टेलेंसेफेलोन में एनपीसी में Dll1-Fluc रिपोर्टर परिचय ।

2. बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम

  1. अत्यधिक संवेदनशीलता, पानी-कूल्ड सीसीडी कैमरे के साथ स्थापित उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके बायोल्यूमिनेसेंस लाइव-इमेजिंग सिस्टम का निर्माण करें। शोर को कम करने और उच्च संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए, कैमरे को -90 डिग्री सेल्सियस के अनुकूलित तापमान पर पानी परिसंचरण द्वारा प्रदान किए गए ठंडा पानी के साथ ठंडा करें।
  2. लाइव सेल/टिश्यू इमेजिंग के लिए इन्क्यूबेशन सिस्टम इंस्टॉल करें, तापमान और मिश्रित गैस को नियंत्रित करें, माइक्रोस्कोप स्टेज पर ।
  3. अस्थिर लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर की अभिव्यक्ति इमेजिंग के लिए, उच्च संख्यात्मक कोण (एनए: 1.30) 40x तेल-विसर्जन उद्देश्य लेंस का उपयोग करें। इस लेंस की वर्किंग डिस्टेंस 02 एमएम है, यह न केवल मोनो लेयर सेल कल्चर बल्कि स्लाइस कल्चर के लिए भी उपलब्ध है।
  4. लूसिफ़ेरेस और फ्लोरेसइन रिपोर्टर अभिव्यक्ति की दोहरी निगरानी के लिए, माइक्रोस्कोप के प्रकाश पथ पर एलईडी रोशनी डिवाइस स्थापित करें।
  5. माइक्रोस्कोप (जैसे, मेटामॉर्फ सॉफ्टवेयर के बहुआयामी अधिग्रहण कार्यक्रम) से जुड़े सॉफ्टवेयर के साथ समय-चूक इमेजिंग को नियंत्रित करें।
  6. एक अंधेरे कमरे में पूरे सिस्टम को तैयार करें, क्योंकि अस्थिर लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर का संकेत बहुत बेहोश होता है, और बाहरी प्रकाश से बचने के लिए अधिग्रहण को रोकते हैं।

3. तंत्रिका स्टेम/जनक प्रकोष्ठ (एनपीसी) विसोशन संस्कृतियों

  1. एनपीसी विसोजन संस्कृति के लिए संस्कृति मीडिया, व्यंजन और अभिकर्मकों की तैयारी
    1. 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetylcysteine, 10 एनजी/mL bFGF और ५० U/mL Penicillin/DMEM/F12 मीडिया में Streptomycin की अंतिम एकाग्रता के साथ तंत्रिका स्टेम/जनक कोशिकाओं की सूची के लिए N2/B27 मीडिया तैयार करें ।
    2. ईबीएसएसएस मीडिया में 7 यू/एमएल पाओकिन, 0.006% डीएनएसे और 1 एमएम एन-एसीटाइलसिस्टीन युक्त विसोशन के लिए पाकिन समाधान तैयार करें।
    3. ल्यूमिनेसेंस इमेजिंग के लिए लूसिफेरिन सोडियम सॉल्यूशन का 100 एमएम तैयार करें। N2/B27 मीडिया में 1 mM लूसिफेरिन समाधान को 1 mM की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला करें ।
      नोट: लूसिफ़ेरिन ऑटो-फ्लोरेसिन को दिखाता है। लूसिफ़ेरेज़-फ्लोरेसेंस डुअल इमेजिंग, विशेष रूप से ईजीएफपी के मामले में, लूसिफ़ेरिन की एकाग्रता को 0.5 mM तक कम करना बेहतर है।
    4. कक्ष के तापमान पर 1 घंटे के लिए पॉली-एल-लाइसिन (PLL) समाधान के 40 μg/mL के साथ एक 35 मिमी ग्लास नीचे व्यंजन (ग्लास व्यास 27-मिमी) कोट करें। ऊष्मायन के बाद प्लेट्स को पीबीएस से धोकर सूखने दें।
  2. भ्रूण का विच्छेदन और एनपीसी का विच्छेदन
    1. एक गर्भवती pDll1-Ub-luc ट्रांसजेनिक माउस (भ्रूण दिन 12.5 (E12.5) सीओ2 asphyxiation और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा इच्छामृत्यु के बाद, पेट के माध्यम से काट और गर्भाशय बाहर ले।
      नोट: शोधकर्ताओं को अपनी संस्था की पशु अनुसंधान समिति के नियमों और दिशा-निर्देशों का पालन करना चाहिए । यदि संज्ञाहरण या दर्द से राहत दवाओं का उपयोग किया जाता है, तो उनका सही उपयोग करें।
    2. गर्भाशय को 10 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें 25 मिलीएल बर्फ-ठंडा पीबीएस हो। माइक्रो कैंची और ठीक संदंश का उपयोग करके, बर्फ-ठंडे पीबीएस में गर्भाशय से भ्रूण को बाहर निकालें।
    3. कैंची का उपयोग कर प्रत्येक भ्रूण के सिर को काट लें और इसे बर्फ-ठंडा DMEM/F12 युक्त 10 सेमी पेट्री व्यंजनों में स्थानांतरित करें। मस्तिष्क के आसपास के एपिडर्मिस और उपास्थि को हटा दें और मस्तिष्क को ३५ मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें N2/B27 मीडिया का बर्फ-ठंडा 3 mL हो ।
    4. डाइएंसेफलन से दाएं और बाएं टेलेएन्सेफलन को काट लें(चित्रा 1बीए-एफ, सी, डी)। ठीक संदंश(चित्रा 1द्वि)का उपयोग करके टेलेएन्सेफलन की सतह को कवर करने वाली मेनिंग्स को हटा दें। फिर से ठीक संदंश का उपयोग करते हुए, टेलेंसेफेलन(चित्रा 1बीजी, एच, जे-एल ई)से कॉर्टेक्स के डोर्सो-लेटरल भाग को बाहर निकालें।
    5. ऊतकों को P1000 पिपेट का उपयोग करके नए 1.5 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें और पी 200 पिपेट के साथ किसी भी अतिरिक्त माध्यम को हटा दें। मस्तिष्क के ऊतकों (कॉर्टेक्स की एक जोड़ी) प्रति पाकिन समाधान का 0.1 एमएल जोड़ें। 24 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के 15 मिन के बाद, धीरे से P1000 पिपेट के साथ 10 बार नमूने पिपेट । नमूनों को 24 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए फिर से इनक्यूबेट करें।
    6. धीरे P1000 पिपेट के साथ 10 बार नमूनों पिपेट । 400 x ग्राम और कमरे के तापमान (आरटी) पर 3 न्यूनतम के लिए नमूने अपकेंद्रित्र। अधिस्थान त्यागें।
    7. गोली के लिए DMEM/F12 मीडिया के 1 mL जोड़ें । धीरे P1000 पिपेट के साथ 10 बार पिपेट । सेंट्रलाइज 3 मिन के लिए 400 एक्स जी और आरटी पर सैंपल छोड़ें। इसे कम से कम 2 बार और दोहराएं।
    8. गोली के लिए, N2/B27 मीडिया के ०.५ mL जोड़ें जिसमें 1 mM लूसिफेरिन होता है और अच्छी तरह से मिलाएं । कोशिकाओं (1 x 106 कोशिकाओं) को एक PLL-लेपित ग्लास बॉटम डिश में बीज करें। 1 घंटे के लिए सीओ2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को संस्कृति। एक बार कोशिकाओं पकवान का पालन करें, N2/B27 मीडिया के 2 mL जोड़ें, 1 mM लूसिफेरिन युक्त ।
  3. एनपीसी विसोजन संस्कृति में लूसिफ़ेरे रिपोर्टर अभिव्यक्ति का दृश्य
    1. विच्छेदन करने से पहले ल्यूमिनेसेंस लाइव-इमेजिंग सिस्टम शुरू करें। एनपीसी संस्कृति के लिए, स्टेज इनक्यूबेटर का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें और गैस मिश्रण की सेटिंग 20% O2,5% सीओ2निर्धारित करें।
    2. विसर्जन तेल को ऑब्जेक्टिव लेंस में डाल दें। सैंपल डिश को माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें। मैन्युअल रूप से क्षेत्र देखें और सर्वोत्तम स्थिति और रुचि की कोशिकाओं का ध्यान चुनें। परीक्षण छवि प्राप्त करने के लिए लाइव क्लिक करें।
    3. बहु-आयामी अधिग्रहण कार्यक्रम के साथ 24 घंटे के लिए 2-आयामी (ल्यूमिनेसेंस और उज्ज्वल क्षेत्र) अधिग्रहण द्वारा समय-चूक अधिग्रहण चलाएं। बहुआयामी अधिग्रहण कार्यक्रम चुनें और अधिग्रहण सेटिंग को इस प्रकार सेट करें (चरण 3.3.6)।
    4. ल्यूमिनेसेंस इमेज एक्विजिशन के लिए, निम्नलिखित कैमरा सेटिंग्स का उपयोग करें: कम हस्तांतरण दर (50 किलोहर्ट्ज), 2 x 2/4 x 4 बिनिंग, 10 min/5 मिन एक्सपोजर समय। उज्ज्वल-क्षेत्र छवि अधिग्रहण के लिए, निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें: मध्यवर्ती-हस्तांतरण दर (1 मेगाहर्ट्ज), 1 x 1 बिनिंग और 100 एमएस एक्सपोजर समय।

4. गर्भाशय इलेक्ट्रोपोराशन में

नोट: यह तंत्रिका जनक कोशिकाओं में Dll1-Fluc रिपोर्टर की शुरूआत के लिए किया जाता है ।

  1. इलेक्ट्रोपोराशन के लिए उपकरण और अभिकर्मकों की तैयारी
    1. भ्रूणीय टेलेएन्सेफलन के वेंट्रिकल में डीएनए के इंजेक्शन के लिए माइक्रो केशिकातैयार करें। गर्मी के साथ एक घास केशिका खिंचाव और काट और चमकाने मशीन के साथ इसकी नोक पॉलिश।
    2. डाया (जैसे, ट्राइपैन ब्लू) के साथ डीएनए का मिश्रण तैयार करें। प्रत्येक डीएनए की एकाग्रता पीबीएस में 1 μg/μL है और 10% की अंतिम एकाग्रता के लिए रंगे जोड़ें ।
      नोट: Dll1 प्रोटीन गतिशीलता के दृश्य के लिए डीएनए के मिश्रण का उपयोग इस प्रकार है: Dll1-Fluc (Dll1 प्रोटीन रिपोर्टर, चित्रा 2ई ऊपरी)और पीईएफ-EGFP (EF प्रमोटर संचालित EGFP अभिव्यक्ति वेक्टर, चित्रा 2ईकम),ट्रांससंक्रमित कोशिकाओं के स्थान और आकृति विज्ञान की निगरानी ।
    3. दो प्रकार के एनेस्थेटिक्स तैयार करें: 3.88 मिलीग्राम/एमएल पेंटोबार्बिटल और 0.12% जाइलाज़ीन, बाँझ 1x पीबीएस में।
    4. ऑपरेशन के दौरान बाँझ उपकरणों और सर्जिकल दस्ताने का प्रयोग करें।
  2. गर्भाशय इलेक्ट्रोपोराशन में
    1. एनेस्थेटाइज एक समय गर्भवती आईसीआर माउस (E12.5) एनेस्थेटिक्स के इंट्रापेरिटोनियल प्रशासन द्वारा 3.88 मिलीग्राम/एमएल पेंटोबार्बिटल के 500 माइक्रोन और 0.12% जाइलाज़ीन के 500 माइक्रोन के साथ।
      नोट: शोधकर्ताओं को पशु प्रयोगों के नियमन का पालन करना चाहिए । यदि किसी को संज्ञाहरण या दर्द से राहत दवाओं का उपयोग करने की आवश्यकता है, तो उनका ठीक से उपयोग करें।
    2. बालों को क्लिप करें और त्वचा को सर्जिकल स्क्रब से कीटाणुरहित करें।
    3. अंगूठे चुटकी प्रतिक्रिया की कमी के लिए जांच करें । एक बार पेडल पलटा नहीं देखा जाता है, मिडलाइन के साथ पेट के माध्यम से एक 2-3 सेमी कट बनाओ । विच्छेदित भाग के चारों ओर गॉज़ रखो और गर्म PBS के साथ धुंध गीला चीरा सूख नहीं है । सही गर्भाशय सींग को धीरे से अंगूठी के आकार के संदंश के साथ बाहर निकालें और भ्रूण की संख्या गिनें।
    4. मिश्रित डीएनए के 1-2 μL को माइक्रो केशिका के साथ धीरे-धीरे भ्रूण के टेलेएन्सेफलन के वेंट्रिकल में इंजेक्ट करें।
      नोट: जब इंजेक्शन सफल होता है, तो कोई भी गर्भाशय की सतह पर रंग का नीला रंग देख सकता है।
    5. वोल्टेज दालें प्रदान करने से पहले गर्भाशय और इलेक्ट्रोड गीला, और फिर एक भ्रूण के सिर को धीरे से पकड़ो। सकारात्मक आवेशित इलेक्ट्रोड को गोलार्द्ध के किनारे सेट करें, जिसमें डीएनए इंजेक्ट किया गया था। सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोपोराशन की नब्ज की स्थिति 50 एमएस के लिए 30-50 वी है, दालों का अंतराल 1 एस (50 एमएस चार्ज और 950 एमएस नॉन चार्ज) है। एक भ्रूण को 5 दालें प्रदान करें और जांच करें कि बुलबुले नकारात्मक रूप से चार्ज किए गए इलेक्ट्रोड से उत्पन्न होते हैं।
      नोट: सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड की दिशा: डीएनए सकारात्मक इलेक्ट्रोड के पक्ष में कोशिकाओं में शामिल है । इस प्रक्रिया के दौरान, इलेक्ट्रोड की स्थिति को स्थानांतरित न करें।
    6. अन्य भ्रूणों के लिए चरण 4.2.3-4.2.4 दोहराएं और गर्भाशय के सींग को पेट की गुहा में वापस करें। बाएं गर्भाशय सींग में भ्रूण के लिए एक ही प्रक्रिया को पूरा करें।
    7. बाईं ओर वापस डालने के बाद, एक सुई (17 मिमी) के साथ एक रेशम सीवन (4-0) द्वारा चीरा सीवन। चीरा पूरी तरह से बंद करने से पहले, पेट गुहा में गर्म PBS डाल
      नोट: टांके के बीच अंतराल 2 मिमी के आसपास है।
    8. सर्जरी खत्म करने के बाद, माउस को पोस्ट एनेस्थीसिया रिकवरी के लिए एक हीटिंग पैड पर रखें। माउस को व्यक्तिगत रूप से घर दें।
      नोट: शोधकर्ताओं को पशु प्रयोगों के अपने स्थानीय instiutional विनियमन का पालन करना चाहिए । अगर किसी को दर्द से राहत दवाओं का सेवन करने की जरूरत है तो उनका सही इस्तेमाल करें।

5. कॉर्टिकल स्लाइस में लूसिफ़ेरे रिपोर्टर अभिव्यक्ति के विकासशील प्रांतस्था और दृश्य की स्लाइस संस्कृतियों की तैयारी

  1. कॉर्टेक्स की स्लाइस संस्कृतियों के लिए संस्कृति मीडिया और अभिकर्मकों की तैयारी
    1. N2/B27 मीडिया में 5% भ्रूण गोजातीय सीरम और 5% घोड़े सीरम युक्त कॉर्टिकल स्लाइस की कटाई के लिए समृद्ध मीडिया तैयार करें ।
    2. बबल १००% O2 गैस DMEM के माध्यम से/विच्छेदन के लिए F12 मीडिया और कॉर्टिकल स्लाइस बनाने ।
      नोट: ऑक्सीजन गैस का सुरक्षित रूप से उपयोग करने के लिए, सिलेंडर कैबिनेट में ओ2 सिलेंडर स्टोर करें और ऑक्सीजन एकाग्रता मीटर द्वारा हवा में ऑक्सीजन एकाग्रता की निगरानी करें।
    3. समृद्ध मीडिया में 100 एमएम लूसिफ़ेरिन सोडियम समाधान को 1 mM की अंतिम एकाग्रता के लिए पतला करें।
      नोट: लूसिफ़ेरिन ऑटो-फ्लोरेसिन को दिखाता है। लूसिफ़ेरेज़-फ्लोरेसेंस डुअल इमेजिंग, विशेष रूप से ईजीएफपी के मामले में, लूसिफ़ेरिन (0.5 एमएम) की कम एकाग्रता बेहतर है।
    4. मल्टी गैस इनक्यूबेटर को 40% ओ2 और 5% सीओ2द्वारा 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  2. भ्रूण का विच्छेदन और फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की अभिव्यक्ति की जांच
    1. गर्भवती माउस को इच्छामृत्यु के बाद, जिसके लिए रिपोर्टर्स (E13.5) को गर्भाशय इलेक्ट्रोपोराशन (चरण 4.2) में पेश किया जाता है, पेट के माध्यम से काट कर गर्भाशय को बाहर निकालदिया जाता है।
      नोट: शोधकर्ताओं को पशु प्रयोगों के नियमन का पालन करना चाहिए । यदि संज्ञाहरण या दर्द से राहत दवाओं का उपयोग कर रहे हैं, तो उनका ठीक से उपयोग करें।
    2. गर्भाशय को पीबीएस युक्त 10 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। माइक्रो कैंची और ठीक संदंश का उपयोग करके, पीबीएस में गर्भाशय से भ्रूण को बाहर निकालें। प्रत्येक भ्रूण के सिर को काट लें और डीएमईएम युक्त 10 सेमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें/ DMEM/F12 मीडिया में मस्तिष्क के आसपास एपिडर्मिस और उपास्थि निकालें ।
    3. रिंग के आकार के संदंश के साथ पेट्री डिश के ढक्कन पर मस्तिष्क रखो और फ्लोरेसेंस स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप चरण पर ढक्कन सेट करें। उत्तेजना प्रकाश(चित्रा 2ए, बी)के तहत फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाले कॉर्टेक्स के क्षेत्र की जांच करें।
    4. एक सिलिकॉन रबर काटने DMEM के 30 mL से भरा बोर्ड के लिए मस्तिष्क हस्तांतरण/ ठीक संदंश द्वारा टेलेएन्सेफलन की सतह को कवर करने वाली मेनिंग्स को हटा दें।
    5. पृष्ठीय टेलेएन्सेफलन के मध्यस्थ और पार्श्व भाग के बीच सीमा को काटें और माइक्रो सर्जिकल चाकू या ठीक संदंश का उपयोग करके दो गोलार्द्धों में अलग करें। एक माइक्रो सर्जिकल चाकू का उपयोग करना, धारियों की तरह प्रांतस्था काट और कॉर्टिकल स्लाइस(चित्रा 2सी, डी)बनाते हैं । पिपेट का उपयोग कर मध्यम के साथ पिपेट स्लाइस और उन्हें एक 35 मिमी पकवान में समृद्ध मीडिया के लिए स्थानांतरित करें।
    6. समृद्ध मीडिया के साथ ग्लास बॉटम व्यंजनों में संस्कृति आवेषण पर स्लाइस रखो। ठीक संदंश का उपयोग कर स्लाइस की दिशा को सही करें। स्लाइस की कट सतह को संस्कृति डालने की सतह पर सेट करें। एक पिपेट द्वारा अतिरिक्त मीडिया निकालें। मल्टी गैस इनक्यूबेटर में स्लाइस इनक्यूबेट 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 40% ओ2 और 5% सीओ2 द्वारा निर्धारित किया गया है।
    7. ग्लास बॉटम डिश में संस्कृति डालने के बाहर 1 mM लूसिफेरिन युक्त समृद्ध मीडिया के 300 माइक्रोन जोड़ें।
  3. स्लाइस संस्कृतियों में लूसिफ़ेरे रिपोर्टर अभिव्यक्ति का दृश्य
    1. विच्छेदन शुरू करने से पहले ल्यूमिनेसेंस लाइव-इमेजिंग सिस्टम शुरू करें। कॉर्टिकल स्लाइस संस्कृतियों की निम्नलिखित स्थिति का उपयोग करें: 40% O2,5% सीओ2 और 37 डिग्री सेल्सियस।
    2. विसर्जन तेल को 40x ऑब्जेक्टिव लेंस में डाल दें। नमूना पकवान माइक्रोस्कोप के चरण में रखो। फ्लोरोसेंट की परीक्षण छवि प्राप्त करें और उत्तेजना प्रकाश की रोशनी के तहत रुचि के क्षेत्र में स्थिति और फोकस विमान निर्धारित करें।
    3. 24 घंटे(चित्रा 2एफ-एच)के लिए 3-डाइमेंशनल (ल्यूमिनेसेंस, फ्लोरेसेंस और उज्ज्वल क्षेत्र) अधिग्रहण द्वारा समय-चूक अधिग्रहण चलाएं। ल्यूमिनेसेंस इमेज एक्विजिशन के लिए, निम्नलिखित कैमरा सेटिंग्स का उपयोग करें: कम हस्तांतरण दर (50 किलोहर्ट्ज), 2x2/4x4 बिनिंग, 10 min/5 मिन एक्सपोजर समय। फ्लोरेसेंस और ब्राइट फील्ड इमेज एक्विजिशन के लिए, निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें: मध्यवर्ती-हस्तांतरण दर (1 मेगाहर्ट्ज), 1x1 बिनिंग और 100 एमएस एक्सपोजर समय।

6. इमेज प्रोसेसिंग और एनालिसिस

  1. प्रत्येक छवि को कनेक्ट करें और ढेर छवियों को बनाएं। क्लिक करें फाइल मेन्यू से इम्पोर्ट इमेज सीक्वेंस ( फाइल. आयात । इमेज सीक्वेंस)और फ़ोल्डर चुनें, जहां अधिग्रहीत छवियों को सहेजा जाता है। फाइल नाम में शामिल कुछ शब्दों को एफइले नामके कॉलम में रखें ।
  2. बायोल्यूमिनेसेंस छवियों पर कॉस्मिक रे के शोर को दूर करने के लिए, इमेजजे/फिजी के स्पाइकनॉड फिल्टर प्लग-इन को लागू करें। स्टैक इमेज खोलें और स्पाइकनॉस फ़िल्टरपर क्लिक करें।
  3. रिपोर्टर अभिव्यक्ति की स्पष्ट गतिशीलता प्राप्त करने के लिए सविट्जकी गोले लौकिक फ़िल्टर प्लग-इन लागू करें। ढेर छवियों को खोलें और Savitzky Golay लौकिक फिल्टरक्लिक करें ।
  4. रिपोर्टर अभिव्यक्ति की तीव्रता को मापने के लिए, प्रत्येक एकल कोशिका के लिए जेड एक्सिस प्रोफाइल प्लस प्लग-इन लागू करें। कोशिकाओं का चयन करें और ROIs, ब्याज के क्षेत्र और क्लिक करें Z Axis प्रोफाइल प्लस सेट ।

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Representative Results

जीन Hes1/7 के भाव विभिन्न कोशिका रेखाओं में और सोमिटोजेनेसिस के दौरान 2 एच दोलन चक्र प्रदर्शित करते हैं । इसके अलावा, दोलन की अवधि बहुत कम है और उनके mRNAs और प्रोटीन दोनों लगभग 20 min के आधे जीवन के साथ बेहद अस्थिर हैं । यदि धीमी प्रतिक्रिया रिपोर्टर का उपयोग करते हैं, तो हम ऐसी तीव्र गतिशीलता का पता नहीं लगा सकते हैं, और यदि एक स्थिर रिपोर्टर का उपयोग करते हैं, तो यह धीरे-धीरे जमा हो जाता है जबकि जीन अभिव्यक्ति दोलन करती है। इस प्रकार, रिपोर्टर को इस तरह के चक्रीय रूप से व्यक्त किए गए जीन के तेजी से कारोबार की निगरानी करने के लिए तेजी से अपमानित किया जाना चाहिए । इन समस्याओं को दूर करने के लिए, हमने ऑसिलेटर्स की गतिशील अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए लूसिफ़ेरेरिपोर्टर का उपयोग किया। क्योंकि बायोल्यूमिनेसेंस रिपोर्टर में कम परिपक्वता का समय और उच्च संवेदनशीलता होती है, इसलिए यह हमें अल्ट्राडियन ऑसिलेटर्स की तेजी से गतिशीलता की निगरानी करने में सक्षम बनाता है। फ्लोरोसेंट रिपोर्टर की तरह लूसिफ़ेरेज रिपोर्टर जीन कोडिंग सीक्वेंस(फिगर 1ए, फिगर 2ई और फिगर 3डी)से जुड़े होने से प्रोटीन की अभिव्यक्ति की गतिशीलता की निगरानी कर सकता है । लूसिफ़ेरेज-फ्यूज्ड जीन उत्पाद कोशिकाओं में एक ही अभिव्यक्ति, कारोबार और स्थानांतरण गतिज को प्रदर्शित करते हैं जैसा कि एंडोजेनस प्रोटीन करते हैं। इसके अलावा, दोलन जीन Dll1के प्रमोटर गतिविधि की निगरानी करने के लिए, हम सर्वव्यापी लूसिफ़ेरेज, एक अस्थिर लूसिफ़ेरेज रिपोर्टर(चित्रा 1ए और चित्रा 3ए)23,जिसका आधा जीवन के बारे में 10 min20है इस्तेमाल किया । विभिन्न प्रकार के लूसिफ़ेरेरिपोर्टर्स का उपयोग करके, हमने न्यूरोजेनेसिस17के दौरान एनपीसी में रिपोर्टर की स्थिर अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए ट्रांसजेनिक चूहों या खटखटाए गए चूहों का उत्पादन किया। ऊतक संस्कृति में एकल कोशिका के स्तर पर रिपोर्टर अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए, रिपोर्टर का बिखरा हुआ परिचय बेहतर है । इस प्रकार, हमने गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन(चित्रा 2एफ-एच)के माध्यम से एनपीसी में रिपोर्टर जीन के क्षणिक क्षणिक क्षणिक का उपयोग किया। लूसिफ़ेरास रिपोर्टर सिस्टम का उपयोग लंबी अवधि (जैसे, 1 सप्ताह) के लिए घड़ी जीन की गतिशील अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए सर्कैडियन लय के क्षेत्र में किया गया है, जिसमें यह सुझाव दिया गया है कि जुगनू लूसिफ़ेरेएंजाइम का सब्सट्रेट लूसिफ़ेरिन (डी-लूसिफेरिन), बहुत स्थिर है और जीवित कोशिकाओं24,25के लिए कोई विषाक्तता नहीं है। हम आमतौर पर मीडिया में 1 mM की सांद्रता में लूसिफेरिन का उपयोग करते हैं, जो रातोंरात लाइव-सेल इमेजिंग के लिए पर्याप्त है। इसके अलावा, माइक्रोस्कोप आधारित इमेजिंग सिस्टम हमें बहु-आयामी छवियों, उज्ज्वल क्षेत्र छवियों, फ्लोरेसेंस छवियों और रसायनिकों छवियों(चित्र ा 2एफ-एच और चित्रा 3ई)प्राप्त करने में सक्षम बनाता है।

इन स्थितियों का उपयोग करते हुए, हमने हे1, एएससीएल1, न्यूरोजी2 और डीएल1 (आंकड़े 2 और चित्रा 3)सहित विभिन्न अल्ट्राडियन क्लॉक जीन की अभिव्यक्ति की कल्पना की। प्रतिनिधि परिणाम चित्र 3में दिखाए जाते हैं । Dll1 प्रमोटर गतिविधि के रिपोर्टर ने Dll1-Ub-Fluc रिपोर्टर चूहों के telencephalon से प्राप्त NPCs में दोलन अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया । अस्थिर लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर(चित्रा 3ए)ने प्रमोटर गतिविधि की अभिव्यक्ति के तेज ऊपर और नीचे नियमन का संकेत दिया(चित्रा 3बी, सी)। इस मामले में, एकल तंत्रिका जनक कोशिकाओं ने 13 घंटे(चित्रा 3सी)के दौरान विभिन्न आयामों के साथ लगभग 2.5 घंटे दोलन चक्र प्रदर्शित किया। रैपिड रिस्पांस लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर हमें दो जीवित कोशिकाओं(चित्रा 3डी-एफ और पूरक मूवी S1)के बीच नॉच सिग्नलिंग के ट्रांसमिशन गतिशीलता पर कब्जा करने में सक्षम बनाता है। हमने दो प्रकार के डीएनए मिश्रण तैयार किए: (1) हेस1 प्रमोटर रिपोर्टर (pHes1-Ub-luc) और EGFP अभिव्यक्ति वेक्टर, और (2) Dll1 प्रोटीन रिपोर्टर (Dll1-Luc) और mCherry अभिव्यक्ति वेक्टर और उन्हें अलग से NPCs में ट्रांसारेट । फिर हमने जीवित कोशिकाओं में संवाददाताओं की अभिव्यक्ति को मापने के लिए दो प्रकार की कोशिकाओं और सह-संस्कारी एकत्र किए। प्रतिनिधि परिणाम चित्र ा 3ई, एफमें दिखाए जाते हैं । निकटवर्ती EGFP सकारात्मक कोशिकाओं Hes1 रिपोर्टर और mCherry सकारात्मक कोशिकाओं को ले जाने Dll1 प्रोटीन रिपोर्टर व्यक्त अवलोकन के दौरान एक दूसरे के साथ संपर्क किया । एक हरे रंग की कोशिका में Hes1 रिपोर्टर अभिव्यक्ति के बारे में ६० मिन दो कोशिकाओं से संपर्क(चित्रा 3ई, एफ)के बाद शुरू लग रहा था । यह सुझाव दिया है कि आसन्न कोशिकाओं के बीच पायदान संकेत के संचरण के लिए समय देरी के बारे में 1 घंटे था । इसके अलावा, सिग्नल ट्रांसमिशन के दौरान, Dll1 प्रोटीन अभिव्यक्ति एक लाल कोशिका(चित्रा 3ई)में गतिशील स्थानांतरण दिखाया ।

Figure 1
चित्रा 1: भ्रूण माउस मस्तिष्क का विच्छेदन। (A)लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर्स, Dll1 प्रमोटर रिपोर्टर और Dll1 प्रोटीन रिपोर्टर की संरचना । (ख)विच्छेदन की प्रक्रिया। (क)माउस भ्रूण का पार्श्व दृश्य। (ख)बिंदीदार रेखा के साथ सिर काट दिया। (ग)टेलेएंसेफलन और मिडब्रेन के बीच के अंतर से एपिडर्मिस और उपास्थि को हटा दें । (ग)दाईं और बाएं गोलार्द्धों के बीच मिडलाइन के साथ आसपास के ऊतकों को काट लें । (ई)केंद्र तोड़ने से ऊतक को दोनों पक्षों में निकालें। (च)आसपास के ऊतकों को हटाने के बाद टेलेएन्सेफलन और मिडब्रेन। (जी)टेलेंसेफलन (टेल), मिडब्रेन (मिड) और घ्राण बल्ब (ओबी) को अलग करें । (ज)टेलेंसेफलन का क्रॉस सेक्शन, जो बिंदीदार लाइन(जी)में दिखाया गया है । (i)टेलेएन्सेफलन की सतह के आसपास के मेनिंग्स को हटा दें। (ज)टेलेएंसेफलन को दो भागों में अलग करें: मध्यस्थ और पार्श्व भाग। (k)कॉर्टेक्स और गैंगलियन एमिनेंस (जीई) की सीमा को काटें। (l)कॉर्टेक्स के डोर्सो-पार्श्व भाग का उपयोग विसोशन संस्कृति के लिए किया जाता है। (ग)भ्रूण दिवस 14 (E14) में मस्तिष्क, जिसमें टेलेएन्सेफलन और मिडब्रेन(सी)के बाएं(ए)और दाएं(बी)गोलार्द्ध शामिल हैं । (D)टेलेसेफेलिक गोलार्द्ध मिडब्रेन से अलग हो गए । (ई)टेलेएन्सेफलन का एक विच्छेदित गोलार्द्ध: गैंगेन्सेनिक एमिनेंस(डी),विसोसिएट संस्कृतियों और स्लाइस संस्कृतियों(ई)के लिए उपयोग किए जाने वाले टेलेएन्सेफलन का डोरसोलेटरल हिस्सा , तेल का मध्यस्थ हिस्सा(एफ)और मस्तिष्क की सतह को कवर करने वाले मेनिंग्स सहित टेलेएन्सेफलन का वेंट्रोलेटरल हिस्सा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: भ्रूण टेलेंसेफेलोन के कॉर्टिकल स्लाइस बनाना और कॉर्टिकल स्लाइस संस्कृतियों में Dll1 प्रोटीन गतिशीलता की कल्पना करना। (क)फ्लोरेसेंस स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप का उपयोग करईजीएफपी की अभिव्यक्ति की जांच करना। लाल तीर एगएफपी व्यक्त करने वाले कॉर्टेक्स के क्षेत्र को दिखाता है। बायां गोलार्द्ध(ए),दाहिना गोलार्द्ध(ख)और मिडब्रेन(सी)। (ख)बिंदीदार रेखाएंमस्तिष्कक्षेत्रों की रूपरेखा का संकेत देती हैं । (ग)डोरसोलेटरल टेलेएन्सेफलन के विच्छेदित कॉर्टेक्स। सफेद तीर सिर कट किनारों का संकेत देते हैं। (D)डोर्सो-लेटरल टेलेएन्सेफलन के कॉर्टिकल स्लाइस। (ई)एनपीसी में Dll1 प्रोटीन गतिशीलता की कल्पना के लिए संवाददाताओं की जीन संरचनाएं । कॉर्टिकल स्लाइस में कोशिकाओं की आकृति विज्ञान और प्रवास की निगरानी के लिए एलएल1 प्रोटीन रिपोर्टर, Dll1-Fluc (ऊपरी) को ईजीएफपी एक्सप्रेशन वेक्टर (लोअर) के साथ एनपीसी में पेश किया गया था । (एफ-एच) कॉर्टिकल स्लाइस में उज्ज्वल क्षेत्र(एफ),जीएफपी अभिव्यक्ति(जी),और बायोल्यूमिनेसेंस(एच)की त्रि-आयामी छवियां। बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम ने एक साथ लूसिफ़ेरेस और फ्लोरेसेंस रिपोर्टर के भावों का पता लगाने की अनुमति दी। स्केल बार: 200 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एनपीसी संस्कृति में Dll1 जीन की गतिशील अभिव्यक्ति के दृश्य और विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि डेटा। (क)रिपोर्टर ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर Dll1 अभिव्यक्ति की कल्पना के लिए निर्माण, एक अस्थिर लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर (यूबी-लूसिफ़ेराज़, सर्वव्यापी लूसिफ़ेरेज़) का उपयोग करके। (ख)एक एकल एनपीसी में एक जैव स्नेहन रिपोर्टर के साथ Dll1 की अभिव्यक्ति का दृश्य । पैनल में संख्या पैनल सी(सी)में संख्या के अनुरूप Dll1 की दोलन अभिव्यक्ति के शिखर अंक दिखाओ (बी) में दिखाया गया है कि बायोल्यूमिनेसेंस का एक समय पाठ्यक्रम साजिश (बी) में दिखाया गया है, जो Dll1की गतिशील अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करता है। (डी-एफ) Hes1 प्रमोटर रिपोर्टर और Dll1 प्रोटीन रिपोर्टर की अभिव्यक्ति का दृश्य पड़ोसी कोशिकाओं में व्यक्त किया । (D)Hes1 प्रमोटर गतिविधि रिपोर्टर (pHes1-Ub-luc) और Dll1 प्रोटीन रिपोर्टर (Dll1-ल्यूक) की संरचना । (ई और एफ) HEs1 रिपोर्टर (Cell1) और Dll1 प्रोटीन रिपोर्टर (Cell2) ले जाने वाले एमचेरी पॉजिटिव सेल को सह-संस्कारी किया गया और दोनों प्रकार के संवाददाताओं से ल्यूमिनेसेंस मापा गया । ग्रीन सेल (cell1) में Hes1 रिपोर्टर की अभिव्यक्ति के लिए दो कोशिकाओं से संपर्क करने के बाद के बारे में ६० मिन शुरू लग रहा था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फिल्म S1: Hes1 प्रमोटर रिपोर्टर और Dll1 प्रोटीन रिपोर्टर की अभिव्यक्ति का दृश्य पड़ोसी कोशिकाओं में व्यक्त की, चित्रा 3डी3F से संबंधित है । कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक।)

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Discussion

नॉच सिग्नलिंग के घटक सोमिटोजेनेसिस के दौरान सिंक्रोनी में दोलन अभिव्यक्ति दिखाते हैं लेकिन न्यूरोजेनेसिस के दौरान सिंक्रोनी से बाहर होते हैं, जिससे बाद के मामले में स्थिर विश्लेषण द्वारा अभिव्यक्ति गतिशीलता को कैप्चर करने में कठिनाइयां होती हैं। इस प्रकार, हे1 और Dll1जैसे नॉच सिग्नलिंग घटकों की अभिव्यक्ति गतिशीलता को प्रकट करने के लिए वास्तविक समय की निगरानी की आवश्यकता होती है। क्योंकि Hes1 और Dll1 दोलनों की अभिव्यक्ति की अवधि बेहद कम हैं, लगभग 2-3 घंटे, तेजी से प्रतिक्रिया और अस्थिर संवाददाताओं उनकी अभिव्यक्ति गतिशीलता की निगरानी के लिए आवश्यक हैं । इसी उद्देश्य से हमने बायोल्यूमिनेसेंस रिपोर्टर और इमेजिंग सिस्टम विकसित किया है। बायोल्यूमिनेसेंस रिपोर्टर लूसिफेरेस इस तरह के चक्रीय जीन अभिव्यक्तियों के तेजी से कारोबार का पता लगाने के लिए तेजी से परिपक्वता काइनेटिक्स और उच्च संवेदनशीलता दिखाता है । संवाददाताओं के तेजी से कारोबार से बहुत बेहोश संकेत उत्पन्न होते हैं । बायोल्यूमिनेसेंस रिपोर्टर्स द्वारा उत्पादित ऐसे बेहोश संकेतों का पता लगाने के लिए, हम एक अनुकूलित बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करते हैं, जिसमें एक उच्च संवेदनशीलता, अल्ट्रा-कम रीडआउट गति (50 किलोवाट) के साथ पानी ठंडा सीसीडी कैमरा शामिल है, जो शोर को न्यूनतम कम कर देता है। इसके अलावा, एक उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) उद्देश्य लेंस हमें अस्थिर लूसिफ़ेरेज रिपोर्टर से जारी प्रकाश को पूरा करने में सक्षम बनाता है। एक उच्च संवेदनशीलता प्राप्त करने के लिए हम आमतौर पर उच्च बिनिंग (जैसे, 2 x 2, 4 x 4, 8 x 8) का उपयोग करते हैं और शटर को लंबे समय तक खोलने के लिए रखते हैं (जैसे, 5-20 min)। क्योंकि लूसिफ़ेरेस रिपोर्टर्स से संकेत बेहद बेहोश है, पर्यावरण से प्रकाश का हस्तक्षेप भी बेहोश संकेत का पता लगाने में एक समस्या प्रस्तुत करता है: इस प्रकार, माइक्रोस्कोप कमरे में पूरी तरह से अंधेरा होना चाहिए । यह प्रणाली हमें ट्रांसक्रिप्शनल और प्रोटीन दोनों स्तरों(चित्रा 3)में एनपीसी में Hes1 और Dll1 जीन की गतिशील अभिव्यक्ति को मापने में सक्षम बनाती है । इसके अलावा, हम ल्यूसिफ़ेरे फ्यूज्ड प्रोटीन रिपोर्टर्स के साथ इंट्रासेलर ट्रांसलोकेशन की प्रोटीन गतिशीलता की कल्पना कर सकते हैं। इसके अलावा, रैपिड रिस्पांस लूसिफ़ेरेज़ रिपोर्टर का उपयोग करके, हम नॉच सिग्नलिंग की ट्रांसमिशन गतिशीलता पर कब्जा कर सकते हैं और दो जीवित कोशिकाओं(चित्रा 3डी-एफ और पूरक मूवी S1)के बीच सिग्नल ट्रांसमिशन के लिए समय की देरी को माप सकते हैं। इसके अलावा, एक ही जीन के प्रमोटर रिपोर्टर (यूबी-लूसिफ़ेरेज रिपोर्टर) और प्रोटीन रिपोर्टर (लूसिफ़ेरेज फ्यूजन) का संयोजन हमें जीन के ट्रांसक्रिप्शन और अनुवाद के बीच समय की देरी को मापने में सक्षम बनाता है । इस तरह विभिन्न प्रकार के ल्यूमिनेसेंस रिपोर्टर्स और फ्लोरेसेंस रिपोर्टर की मल्टीपल इमेजिंग बायोकेमिकल प्रतिक्रियाओं के लिए समय में देरी/दर को मापने के लिए उपलब्ध है ।

एकल कोशिका संकल्प पर जीन अभिव्यक्तियों की वास्तविक समय की निगरानी से पता चला है कि एक ही जीन की अभिव्यक्ति गतिशीलता में भिन्नताएं हैं । कुछ कोशिकाएं दोलन तरीके से Dll1/Neurog2 व्यक्त करती हैं, लेकिन अन्य निरंतर पैटर्न दिखाते हैं । इसके अलावा, विभिन्न अभिव्यक्ति गतिशीलता (दोलन बनाम स्थिर) कोशिकाओं की स्थिति में विभिन्न आउटपुट को प्रेरित करती है। स्पष्ट प्रतीत होता है कि विभिन्न अभिव्यक्ति गतिशीलता विभिन्न तरीकों से कोशिका व्यवहार को प्रभावित करती है, यह सुझाव देती है कि अभिव्यक्ति गतिशीलता अधिक जानकारी21,22,26,27,28,29,30,31,32को एन्कोड करती है। स्थिर विश्लेषण जीन अभिव्यक्ति में गतिशीलता को कैप्चर नहीं कर सकते हैं, और सेलुलर घटनाओं में अभिव्यक्ति गतिशीलता प्रकट करने के लिए जैविक घटनाओं को समझने के लिए वास्तविक समय विश्लेषण की आवश्यकता होती है। हम यहां जो दृष्टिकोण पेश करते हैं, वह उच्च लौकिक संकल्प पर तंत्रिका विकास के दौरान अल्ट्राडियन ऑसिलेटरकी गतिशीलता की निगरानी कर सकता है । इस विधि का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि कई और जीन गतिशील रूप से व्यक्त किए जाते हैं जितना हमने पहले सोचा था, और हम न केवल प्रोटीन अभिव्यक्ति की गतिशीलता का पता लगा सकते हैं बल्कि उच्च लौकिक संकल्प पर कोशिका में प्रोटीन स्थानीयकरण में गतिशीलता का भी पता लगा सकते हैं। इस तरह के गतिशील अभिव्यक्ति पैटर्न में जैविक महत्व हो सकते हैं जो अभी तक स्पष्ट नहीं हैं।

बायोल्यूमिनेसेंस रिपोर्टर्स को लौकिक संकल्प और फ्लोरेसेंस रिपोर्टर्स33की तुलना में जीवित कोशिकाओं के लिए कम विषाक्तता में बहुत लाभ होता है। हालांकि, फ्लोरोसेंट संवाददाताओं में रंग विविधताओं के विपरीत, बायोल्यूमिनेसेंस रिपोर्टर्स में केवल कुछ रंग हैं, जो जीन की संख्या पर एक सीमा लागू करते हैं जिन पर एक साथ नजर रखी जा सकती है। फिर भी, चर लूसिफ़ेरेज़ की बढ़ती संख्या को विभिन्न प्राणियों34,35से अलग और क्लोन किया जा रहा है, और इस तरह के प्रकार के ल्यूसिफ़ेरेज़ का उपयोग करके, हम उच्च लौकिक संकल्प पर एक ही कोशिका में कई जीन अभिव्यक्ति गतिशीलता का पता लगाने में सक्षम होंगे। जुगनू लूसिफ़ेरेज़ का आणविक आकार फ्लोरेसेंस रिपोर्टर्स से बड़ा है, जो प्रोटीन गतिशीलता की निगरानी के लिए रिपोर्टर-फ्यूज्ड प्रोटीन के निर्माण में कुछ कठिनाइयों को प्रस्तुत करता है, लेकिन हाल ही में, एक नया, छोटा और उज्जवल लूसिफ़ेरेज़३६क्लोन किया गया है, जो हमें प्रोटीन गतिशीलता को पहले से कहीं ज्यादा आसान कल्पना करने की अनुमति देगा । हाल ही में विभिन्न जैविक आयोजनों में जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन के अंतर में विभिन्न प्रकार की गतिशीलता दिखाई गई है, जो 21,22,26,27,28,29,30,31,32. वास्तविक समय की निगरानी प्रणाली का उपयोग करके स्थानिक विनियमन में ऐसी गतिशीलता का विश्लेषण कोशिकाओं के वास्तविक राज्यों पर कब्जा करने और सेलुलर प्रणालियों के नियमन को प्रकट करने के लिए तेजी से महत्वपूर्ण होगा ।

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Disclosures

लेखकों का कोई परस्पर विरोधी वित्तीय हित नहीं है ।

Acknowledgments

हम वीडियो के उत्पादन का समर्थन करने के लिए Yumiko Iwamoto शुक्रिया अदा करते हैं । हम इमेज एनालिसिस की चर्चा और समर्थन के लिए अकिहिरो इसोमुरा के आभारी भी हैं, ट्रांसजेनिक जानवरों की पीढ़ी के लिए तकनीकी समर्थन के लिए हितोशी मियाची, युजी शिंजो (ओलंपस मेडिकल साइंस), मासातोशी इगावा (ओलंपस मेडिकल साइंस), ताकुया इशिज़ु (ओलंपस मेडिकल साइंस), ताकुया इशिज़ु ( ओलंपस मेडिकल साइंस) और ओइन कुनिताकी (एंडोर जापान) बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम की तकनीकी सहायता और चर्चाओं के लिए। इस काम को कोर रिसर्च फॉर इवोल्यूशनल साइंस एंड टेक्नोलॉजी (जेपीएमजेसीआर12डब्ल्यू2) (आरके), इनोवेटिव एरियापर साइंटिफिक रिसर्च के लिए ग्रांट-इन-एड (एचएस के लिए एमईएक्सटी 24116705 और आरकेएस के लिए एमईएक्सटी 16एच06480), ग्रांट-इन-एड फॉर साइंटिफिक रिसर्च (सी) (जेएसपीएस) द्वारा समर्थित किया गया था। 18K06254) (एचएस), Takeda फाउंडेशन (आरके और एचएस), और शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी, जापान मंत्रालय से रहने की प्रणाली के लिए गतिशील दृष्टिकोण के लिए मंच ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bioluminescence Imaging System
Chilled water circulator (chiller) Julabo Model: F12-ED
Cooled CCD camera Andor Technology Model: iKon-M 934
Incubator system TOKAI HIT Model: INU-ONICS
Inverted microscope Olympus Model: IX81
Inverted microscope Olympus Model: IX83
LED illumination device CoolLED Model: pE1
MetaMorph MOLECULAR DEVICES Model: 40000
Mix gas controller Tokken Model: TK-MIGM OLO2
Objective lens Olympus Model: UPLFLN 40X O
Preparations for Dissection
Dissection microscope Nikon Model: SMZ-2B
Fluorescence stereoscopic microscope Leica Model: MZ16FA
Fine forceps DUMONT INOX No.5
Scissors, Micro scissors
Forceps
Ring-shaped forceps
10-cm plastic petri dish greiner 664160-013
35-mm plastic petri dish greiner 627160
PBS Nacalai Tesque 14249-24
DMEM/F12 invitrogen 11039-021
Reagents for NPC dissociation culture
B27 supplement invitrogen 12587-010
bFGF invitrogen 13256-029 Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS
D-luciferin Nacalai Tesque 01493-85 Stock solution: 100mM in 0.9% saline
DNase Worthington Biochemical Corporation LK003172 Stock solution: 1000U/ml in EBSS
EBSS Worthington Biochemical Corporation LK003188
Glass bottom dish IWAKI 3910-035
N2 supplement (100x) invitrogen 17502-048
N-acetyl-cystein Sigma A-9165-25G
Papain Worthington Biochemical Corporation LK003178 Stock solution: 7U/ml in EBSS
Penicillin/Streptmycine Nacalai Tesque 09367-34
Poly-L-lysine Sigma P-6281 40 mg/ml in DW
Preparations for in utero electroporation
50-ml syringe TERUMO 181228T
Electrode Neppagene 7-mm
Electroporator Neppagene CUY21 EDIT
Forceps
Gauzes Kawamoto co. 7161
Micro capillary Made in-house
PBS Nacalai Tesque 14249-24
Pentbarbital Kyoritsuseiyaku Somnopentyl
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Suture needle Akiyama MEDICAL MFG. CO F17-40B2
Xylazine Bayer Seractal
Preparations for Slice culture
10-cm plastic petri dish greiner 664160-013
35-mm plastic petri dish greiner 627160
Culture insert Millipore PICM01250
DMEM/F12 invitrogen 11039-021
Fetal Bovine Serum Sigma 172012-500ML
Fine forceps DUMONT INOX No.5
Forceps
Horse Serum Gibco 16050-122
Micro surgical knife Alcon 19 Gauge V-Lance
Multi-gas incubator Panasonic MCO-5MUV-PJ
N2/B27 media Made in-house ref. NPC dissociatioin culture
PBS Nacalai Tesque 14249-24
Ring-shaped forceps
Scissors, Micro scissors
Silicon rubber cutting board Made in-house

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References

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Shimojo, H., Kageyama, R. Real-time… More

Shimojo, H., Kageyama, R. Real-time Bioluminescence Imaging of Notch Signaling Dynamics during Murine Neurogenesis. J. Vis. Exp. (154), e60455, doi:10.3791/60455 (2019).

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