Summary
Neural Stem/stamceller viser ulike uttrykk dynamikk av notch signalering komponenter som fører til ulike utfall av cellulære hendelser. Slike dynamiske uttrykk kan avsløres av sanntids overvåking, ikke av statisk analyse, ved hjelp av en svært følsom bioluminesens Imaging system som muliggjør visualisering av raske endringer i genuttrykk.
Abstract
Notch signalering regulerer vedlikehold av Neural Stem/stamceller ved celle-celle interaksjoner. Komponentene i notch signaliserer viser dynamisk uttrykk. Notch signalering effektor Hes1 og notch ligand delta-like1 (Dll1) uttrykkes på en oscillasjon måte i neural Stem/stamceller. Fordi perioden av oscillasjon uttrykk for disse genene er svært kort (2 h), er det vanskelig å overvåke deres sykliske uttrykk. For å undersøke slike raske endringer i genuttrykk eller protein dynamikk, er rask respons journalister nødvendig. På grunn av sin raske modning Kinetics og høy følsomhet, den bioluminesens reporter luciferase er egnet til å overvåke raske genuttrykk endringer i levende celler. Vi brukte en destabilisert luciferase reporter for overvåking arrangøren aktivitet og en luciferase-smeltet reporter for visualisering av protein dynamikk på én celle oppløsning. Disse bioluminesens journalistene viser rask omsetning og genererer svært svake signaler; Derfor har vi utviklet et svært følsomt bioluminesens bildesystem for å oppdage slike svake signaler. Disse metodene gjør oss i stand til å overvåke ulike genuttrykk dynamikk i levende celler og vev, som er viktig informasjon for å hjelpe forstå den faktiske cellulære stater.
Introduction
Pattedyr hjernen består av et stort antall ulike typer neurons og gliacellene celler. Alle celler er generert fra neural Stem/stamceller (NPCer), som først sprer seg for å utvide sine tall, og deretter begynne å differensiere til neurons, og til slutt gi opphav til gliacellene celler1,2,3,4,5. Når cellene har differensiert inn i neurons, kan de ikke sprer eller øke sine tall, og derfor vedlikehold av NPCer til senere stadier er viktig. Hakk signalering via celle-celle interaksjoner spiller en viktig rolle i å opprettholde NPCer6,7. Notch ligander samhandle med membran protein, notch, på overflaten av nærliggende celler og aktiverer notch protein. Etter aktivering, proteinolyse av hakk protein oppstår, og dermed slippe intracellulære domene av hakk (NICD) fra cellemembranen i kjernen8,9,10. I kjernen, binder NICD til arrangøren regionene Hes1 og Hes5 (Hes1/5) og aktiverer uttrykk for disse genene. Hes1/5 undertrykke uttrykk for proneural gener Ascl1 og Neurogenin1/2 (Neurog1/2)11,12,13,14. Fordi proneural gener induserer neuronal differensiering, Hes1/5 spille viktige roller i å opprettholde NPCer. Videre, som proneural gener kan aktivere uttrykket av notch ligand delta-like1 (Dll1), Hes1/5 også undertrykke uttrykk for Dll1. Derfor, uttrykk for Dll1 fører til nærliggende celler blir negativt for Dll1 via notch signalering. På denne måten cellene hemme tilstøtende celler fra å følge deres samme skjebne, et fenomen som kalles lateral hemming8. I den utviklende hjernen, lateral hemming spiller en rolle i å generere ulike celletyper.
Real-Time Imaging på enkelt cellenivå avslører dynamiske uttrykk for komponentene i hakk signalering i NPCer15,16,17. Notch signalering aktiverer uttrykk for Hes1, men Hes1 protein binder seg til sin egen promoter og fortrenger sitt eget uttrykk. Videre er Hes1 en ekstremt ustabil protein, som er degradert av ubiquitin-proteasomet veien; Derfor er undertrykkelse av sin egen promoter bare kortvarig og deretter transkripsjon starter igjen. På denne måten uttrykket av Hes1 svinger på både transkripsjon og translational nivåer i en 2 h syklus18. Den oscillasjon uttrykk for Hes1, i sin tur induserer oscillasjon uttrykk for nedstrøms mål gener, for eksempel Ascl1, Neurog2, og Dll1, via periodisk undertrykkelse15,16,17,19. Mens proneural gener kan indusere neuronal differensiering, er deres oscillasjon uttrykk ikke tilstrekkelig for neuronal differensiering; snarere deres vedvarende uttrykk er avgjørende for neuronal differensiering. Den oscillasjon uttrykk for proneural gener er viktig for å opprettholde NPCer snarere enn for inducing neuronal differensiering14,15,16. Uttrykket av Dll1 svinger på både transkripsjon og translational nivåer under ulike morphogenesis, slik som neurogenesis og somitogenesis. Den dynamiske uttrykk for Dll1 er viktig for normal morphogenesis og jevn uttrykk for Dll1 medfører defekter i neurogenesis og somitogenesis17. Disse funnene viser den viktige funksjonen som dynamikken i genet uttrykk og protein Kinetics har på regulering av ulike utviklingsmessige hendelser (dvs. ulike uttrykk dynamikk produsere ulike utganger i cellulære atferd).
Å analysere dynamikken i notch signalering, den statiske analyse av vev og celler er utilstrekkelig fordi de er i stadig endring. Real-Time Imaging av enkeltceller er et kraftig verktøy for å avdekke dynamikken i genet uttrykk. Den dynamiske uttrykk for notch signalering molekyler gjennomgår rask syklisk svar i perioden 2-3 h. Dette raske periodiske uttrykket presenterer to vanskelige problemer for sanntids overvåking: (1) uttrykket av molekylene er undertrykt til lave nivåer, og (2) rask omsetning krever rask respons journalister. For å overkomme disse problemene, har vi tidligere utviklet en bioluminesens sann tids avbildnings metode20. Fordi bioluminesens reporteren har en høyere følsomhet og kortere modningstid enn fluorescerende journalister, gjør denne strategien oss til å overvåke den raske dynamikken i levende celler. Ved hjelp av sanntids visualisering, fant vi ut at flere gener utstilt dynamiske uttrykk enn vi tidligere hadde trodd. I tillegg har antall rapporter som viser uttrykk og protein dynamikk i levende celler og betydningen av disse dynamikken i ulike biologiske hendelser økt, noe som tyder på en fundamental rolle av dynamikken i genuttrykk21,22.
I denne rapporten beskriver vi en måte å visualisere uttrykket av notch ligand Dll1 i NPCer i både dissosiert kulturer og i kortikale Slice kulturer. For å overvåke dynamikken i Dll1 transkripsjon på enkelt celle nivåer, genererte vi dissosiert kulturer av NPCer avledet fra den embryonale Telencephalon av transgene mus bærer PDll1-UB-svingninger reporter, en Dll1 promoter-drevet destabilisert luciferase reporter. For å overvåke Dll1 protein dynamikk in vivo introduserte vi Dll1-svingninger fusjons reporter til NPCer i cortex og visualisere uttrykket av reporteren i NPCer i kortikale skive kulturer. Real-Time Imaging aktivert oss å fange de ulike funksjonene i genuttrykk og protein dynamikk i levende celler ved høy Temporal oppløsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle fremgangsmåten inkluderer dyr emner ha blitt anerkjent av institusjonell dyr bekymre og bruk komité for det off for Frontier livet og legeundersøkelse vitenskap, Kyoto universitet.
1. bioluminesens journalister
Merk: luciferase reporter er egnet for å måle den raske dynamikken i promoter aktivitet ved å smelte ned brytnings signalet. Videre muliggjør luciferase Fusion reporter overvåking av protein dynamikk i enkelt celle. Begge typer journalister er tilgjengelige for mono-lags kultur (dissosiasjon kultur) og vev kultur (Slice kultur) eksperiment.
- Reporter for overvåking Dll1 promoter aktivitet17
Merk: for å overvåke de raske endringene i genuttrykk, er den raske responsen og ustabil reporter avgjørende. Firefly luciferase (svingninger) viser rask modning sammenlignet med fluorescein journalister. Fordi ubiquitin smeltet luciferase reporter (UB-svingninger) viser rask nedbrytning og rask omsetning, er det svært nyttig å overvåke den dynamiske genuttrykk i levende celler20.- Bruk Dll1 promoter-drevet destabilisert luciferase reporter, ubiquitinated luciferase (pDll1-UB-svingninger, figur 1A øvre panel), for å overvåke raske endringer i Dll1 uttrykk på et transcriptional nivå17.
- Generer en transgene muse linje som bærer pDll1-UB-svingninger for et stabilt uttrykk for denne reporteren.
- Reporter for overvåking Dll1 protein dynamikk17.
- For generering av knock-in mus, sett luciferase cDNA inn i 3 ́ Termini i Dll1 koding regionen slik at Dll1-luciferase Fusion protein er uttrykt (Dll1-svingninger reporter, figur 1A, nedre panel)17.
- Overvåk uttrykket dynamikken i Dll1 på proteinnivåer ved å måle luciferase aktivitet.
- For overvåking Dll1 protein dynamikk på vev nivåer, innføre Dll1-svingninger reporter i NPCer i den embryonale Telencephalon av i Utero electroporation.
2. bioluminesens tenkelig system
- Konstruere en bioluminesens Live-Imaging system ved hjelp av en invertert mikroskop installert med en svært følsom, vannkjølt CCD kamera. For å redusere støyen og oppnå høy følsomhet, Avkjøl kameraet med kjølt vann som tilbys av vann circulator ved en optimert temperatur på-90 ° c.
- For levende celle/vev Imaging, installere inkubasjons systemet, kontrollere temperaturen og blandet gass, til mikroskopet scenen.
- For Imaging uttrykk for destabilisert luciferase reporter, bruk høy numerisk vinkel (NA: 1,30) 40x olje-nedsenking objektiv linse. Arbeidsavstand av dette objektivet er 0,2 mm, er det tilgjengelig for ikke bare mono-lags cellekultur, men også skive kultur.
- For dobbelovervåkning av luciferase og fluorescein reporter-uttrykk, Monter LED-belysningen på lys banen til mikroskopet.
- Kontroller tidsforløp bildebehandling med en programvare tilknyttet mikroskopet (for eksempel programvare for flerdimensjonale oppkjøp av programmet-programvare).
- Forbered hele systemet i et mørkt rom, fordi signalet av destabilisert luciferase reporteren er svært svak, og for å unngå overflødig lys hindre oppkjøpet.
3. neural Stem/stamfar Cell (NPC) dissosiasjon kulturer
- Utarbeidelse av kultur Media, retter, og reagenser for NPC dissosiasjon kultur
- Klargjør N2/B27 medium for dyrking av nevrale Stem/stamceller med en endelig konsentrasjon på 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acetylcysteine, 10 ng/mL bFGF og 50 U/mL penicillin/Streptomycin i DMEM/F12 Media.
- Forbered Papain løsning for dissosiasjon som inneholder 7 U/mL Papain, 0,006% DNase og 1 mM N-acetylcysteine i EBSS Media.
- Forbered 100 mM luciferin natrium oppløsning for luminescence bildebehandling. Fortynne 100 mM luciferin oppløsning i N2/B27 medium til en endelig konsentrasjon på 1 mM.
Merk: luciferin viser automatisk fluorescein selv. I tilfelle av luciferase-fluorescens dual Imaging, spesielt EGFP, senke konsentrasjonen av luciferin til 0,5 mM er bedre. - Coat en 35-mm glassbunn retter (glass diameter 27-mm) med 40 μg/mL av Poly-L-lysin (PLL) løsning for 1 t ved romtemperatur. Etter inkubasjons, vask platene 3x med PBS og la den tørke.
- Disseksjon av embryo og dissosiasjon av NPCer
- Etter å ha euthanizing en gravid pDll1-UB-Luc transgene Mouse (embryonale dag 12,5 (E 12.5)) av CO2 kvelning og cervical forvridning, skjære gjennom magen og ta ut livmoren.
Merk: forskere må følge regelverket og retningslinjer for dyre forskningskomité av institusjonen sin. Hvis anestesi eller smertelindring narkotika brukes, bruke dem riktig. - Overfør livmoren i en 10 cm Petri parabolen inneholder 25 mL av iskald PBS. Ta ut embryo fra livmoren i iskald PBS, ved hjelp av mikro saks og fine tang.
- Klipp av hodet på hvert embryo ved hjelp av saks og overføre den til 10 cm Petri retter som inneholder iskald DMEM/F12. Fjern epidermis og brusk rundt hjernen og overføre hjernen til 35 mm Petri parabolen inneholder iskald 3 mL av N2/B27 Media.
- Klipp av høyre og venstre Telencephalon fra Diencephalon (figur 1ba-f, C, D). Fjern hjernehinnene som dekker overflaten av Telencephalon ved hjelp av fin tang (figur 1bi). Bruke fine tang igjen, ta ut dorso-lateral del av cortex fra Telencephalon (figur 1BG, h, j-l E).
- Overfør vevet til nye 1,5 mL rør ved hjelp av en P1000 pipette og fjern eventuelle ekstra medium med en P200 pipette. Tilsett 0,1 mL Papain oppløsning per hjernevev (et par i cortex). Etter 15 minutter av inkubasjons ved 24 ° c, Pipetter prøvene 10 ganger med P1000 pipette. Ruge prøvene igjen i 15 min ved 24 ° c.
- Pipette prøvene forsiktig 10 ganger med P1000 pipette. Sentrifuger prøvene i 3 minutter ved 400 x g og romtemperatur (RT). Kast supernatanten.
- Tilsett 1 mL DMEM/F12 Media til pellet. Pipetter forsiktig 10 ganger med P1000 pipette. Sentrifuger prøvene i 3 minutter ved 400 x g og RT. kast supernatanten. Gjenta dette minst 2 ganger til.
- Til pellet, tilsett 0,5 mL av N2/B27 medium inneholdende 1 mM luciferin og bland godt. Seed cellene (1 x 106 celler) til en PLL-belagt glassbunn parabolen. Kultur cellene i CO2 inkubator for 1 time. Når cellene holder seg til fatet, tilsett 2 mL av N2/B27 medier, inneholder 1 mM luciferin.
- Etter å ha euthanizing en gravid pDll1-UB-Luc transgene Mouse (embryonale dag 12,5 (E 12.5)) av CO2 kvelning og cervical forvridning, skjære gjennom magen og ta ut livmoren.
- Visualisering av luciferase reporter uttrykk i NPC dissosiasjon kultur
- Start opp luminescence Live-Imaging system før du utfører disseksjon. For NPC kultur, angi temperaturen på scenen inkubator ved 37 ° c og angi innstillingen av gassblandingen 20% O2,5% co2.
- Sett nedsenking oljen til objektiv linse. Plasser prøve fatet på scenen på mikroskopet. Vis-feltet manuelt, og velg den beste plasseringen og fokus for cellene av interesse. Klikk Live for å hente testbildet.
- Kjør time-lapse oppkjøpet av 2-dimensjonale (luminescence og lyse felt) oppkjøp for 24 h med multi-dimensjonale Acquisition program. Velg multi-dimensjonale Acquisition program og angi oppkjøpet innstillingen som følger (trinn 3.3.6).
- For luminescence image oppkjøpet, bruk følgende kamerainnstillinger: lav overføringshastighet (50 kHz), 2 x 2/4 x 4 binning, 10 min/5 min eksponeringstid. For bilder med lyse felt, bruk følgende innstillinger: middels overføringshastighet (1 MHz), 1 x 1 binning og 100 MS eksponeringstid.
4. i Utero electroporation
Merk: Dette er utført for innføring av Dll1-svingninger reporter i nevrale stamceller.
- Utarbeidelse av verktøy og reagenser for electroporation
- Forbered mikro blodkar for injeksjon av DNA i ventrikkel av den embryonale Telencephalon. Strekk en gress kapillær med varme og klipp og poler tuppen av den med polerings maskinen.
- Forbered en blanding av DNA med fargestoff (f. eks, Trypan blå). Konsentrasjonen av hvert DNA er 1 μg/μL i PBS og tilsett fargestoff til en endelig konsentrasjon på 10%.
Merk: Bruk blandingen av DNA for visualisering av Dll1 protein dynamikk som følger: Dll1-svingninger (Dll1 protein reporter, figur 2E øvre) og PEF-EGFP (EF promoter Driven EGFP uttrykk Vector, figur 2E lavere), overvåking plasseringen og morfologi av transfekterte celler. - Forbered to typer anestesi: 3,88 mg/mL pentobarbital og 0,12% av xylazine, i steril 1x PBS.
- Bruk de sterile instrumentene og de kirurgiske hanskene under bruk.
- I Utero electroporation
- Bedøve en tid gravid ICR mus (E 12.5) ved intraperitoneal administrering av anestesi med 500 μL av 3,88 mg/mL pentobarbital og 500 μL av 0,12% xylazine.
Merk: forskerne må følge regulering av dyre eksperimenter. Hvis man trenger å bruke anestesi eller smertelindring narkotika, bruke dem riktig. - Klipp håret og desinfisere huden med kirurgisk skrubb.
- Sjekk for mangelen på tå knipe respons. Når pedal refleks ikke er observert, gjør en 2-3 cm skåret gjennom magen langs midtlinjen. Sett gauzes rundt den dissekert delen og fukt gauzes med varm PBS ikke å tørke opp snittet. Ta ut riktig livmor Hornet forsiktig med ring-formet tang og telle antall embryo.
- Injiser 1-2 μL av blandet DNA i ventrikkel av Telencephalon av embryo forsiktig med mikro kapillær.
Merk: Når injeksjonen er vellykket, kan man se den blå fargen på fargestoff over overflaten av livmoren. - Fukt livmoren og elektroden før du gir spenning pulser, og deretter holde hodet på et embryo forsiktig. Sett positivt ladet elektroden til siden av halvkule, der DNA ble injisert. Sørg for at tilstanden til pulsen på electroporation er 30-50 V for 50 MS, intervallet for pulser er 1 s (50 MS lading og 950 MS uten kostnad). Gi 5 pulser til ett embryo og kontroller at boblene er generert fra den negativt ladet elektroden.
Merk: Sørg for at retningen på elektroden: DNA er innlemmet i celler på siden av positiv elektrode. Under denne prosedyren må du ikke flytte elektrode posisjonen. - Gjenta trinnene 4.2.3-4.2.4 for andre embryo og returnere livmor Hornet til bukhulen. Gjennomføre samme fremgangsmåte til embryo i venstre livmor horn.
- Etter å sette tilbake venstre side, Sutur snittet av en silke Sutur (4-0) med en nål (17 mm). Før du lukker snittet helt, sette varm PBS i bukhulen
Merk: intervallet mellom sting er rundt 2 mm. - Etter endt kirurgi, plasserer musen på en oppvarming pad for post anestesi utvinning. Hus musa individuelt.
Merk: forskerne må følge sine lokale instiutional regulering av dyre eksperimenter. Hvis man trenger å bruke smertelindring narkotika, bruke dem riktig.
- Bedøve en tid gravid ICR mus (E 12.5) ved intraperitoneal administrering av anestesi med 500 μL av 3,88 mg/mL pentobarbital og 500 μL av 0,12% xylazine.
5. utarbeidelse av skive kulturer av utviklings barken og visualisering av luciferase reporter uttrykk i kortikale skiver
- Utarbeidelse av kultur Media og reagenser for skive kulturer i cortex
- Forbered beriket Media for dyrking kortikale skiver som inneholder 5% fosterets storfe serum og 5% hest serum i N2/B27 Media.
- Bubble 100% O2 gass gjennom DMEM/F12 Media for disseksjon og lage kortikale skiver.
Merk: for å bruke oksygen gass trygt, Oppbevar O2 sylinder i sylinderen kabinett og overvåke oksygenkonsentrasjonen i luften av en oksygen konsentrasjon meter. - Fortynne 100 mM luciferin natrium oppløsning i beriket Media til en endelig konsentrasjon på 1 mM.
Merk: luciferin viser automatisk fluorescein selv. I tilfelle av luciferase-fluorescens dual Imaging, spesielt EGFP, lavere konsentrasjon av luciferin (0,5 mM) er bedre. - Sett multi-gass inkubator ved 37 ° c med 40% O2 og 5% co2.
- Disseksjon av embryo og undersøkelse av uttrykk for fluorescerende reporter
- Etter euthanizing den gravide musen som journalister (E 13.5) er innført av i Utero electroporation (trinn 4,2), skjære gjennom magen og ta ut livmoren.
Merk: forskerne må følge regulering av dyre eksperimenter. Hvis du bruker anestesi eller smertelindring narkotika, bruke dem riktig. - Overfør livmoren til en 10 cm Petri parabolen inneholder PBS. Ta ut embryo fra livmoren i PBS, ved hjelp av mikro saks og fine tang. Klipp av hodet på hvert embryo og overføre til en 10 cm Petri parabolen inneholder DMEM/F12 Media boblet med 100% O2 gass. Fjern epidermis og brusk rundt hjernen i DMEM/F12 Media.
- Sett hjernen på lokket på Petri parabolen med ring-formet tang og sette lokket på fluorescens stereoskopisk mikroskop scenen. Kontroller regionen i cortex som uttrykker fluorescerende protein under det eksitasjon lyset (figur 2A, B).
- Overfør hjernen til en silikon gummi skjærebrett fylt med 30 mL DMEM/F12 Media boblet med 100% O2 gass. Fjern hjernehinnene som dekker overflaten av Telencephalon av fine tang.
- Skjær grensen mellom midtre og laterale del av rygg Telencephalon og skille i to halvkuler ved hjelp av mikro kirurgisk kniv eller fin tang. Ved hjelp av en mikro kirurgisk kniv, kutt cortex som striper og lage kortikale skiver (figur 2C, D). Pipette skiver med medium ved hjelp av pipette og overføre dem til beriket Media i en 35 mm parabolen.
- Sett skiver på kulturen setter inn i glasset bunnen retter med beriket Media. Riktig retning av skiver ved hjelp av fine tang. Sett opp kuttet overflaten av skiver til overflaten av kultur sette inn. Fjern de ekstra mediene med en pipette. Ruge skiver i multi-gass inkubator satt av 40% O2 og 5% co2 ved 37 ° c i 30 min.
- Tilsett 300 μL av beriket medium som inneholder 1 mM luciferin til utsiden av kulturen inn i glasset bunn parabolen.
- Etter euthanizing den gravide musen som journalister (E 13.5) er innført av i Utero electroporation (trinn 4,2), skjære gjennom magen og ta ut livmoren.
- Visualisering av luciferase reporter uttrykk i skive kulturer
- Start det luminescence Live-Imaging-systemet før du starter disseksjon. Bruk følgende betingelse av kortikale sektor kulturer: 40% O2,5% co2 og 37 ° c.
- Sett nedsenking olje til 40x objektiv linse. Sett prøven rett til scenen av mikroskop. Tilegne seg test bilde av fluorescerende og sette posisjon og fokus planet til regionen av interesse under belysning av eksitasjon lys.
- Kjøretime-lapse oppkjøpet av 3-dimensjonalt (luminescence, fluorescens og lyse felt) oppkjøp for 24 h (figur 2F-h). Bruk følgende kamerainnstillinger for å luminescence bildeopptak: lav overføringshastighet (50 kHz), 2x2/4x4-binning, 10 min/5 min eksponeringstid. For fluorescens og lyse felt image oppkjøpet, bruk følgende innstillinger: Intermediate-overføringshastighet (1 MHz), 1x1 binning og 100 MS eksponeringstid.
6. bildebehandling og analyse
- Koble hvert bilde og gjøre stabelen bildene. Klikk Importer bildesekvens fra fil- menyen (fil | Importere | Image Sequence) og velg mappen, hvor de kjøpte bildene er lagret. Putte noe ord inneholdt inne arkiv navnet å kolonnen av FIle navnet behersker.
- Å fjerne støyen av kosmisk stråle på bioluminesens bilder, bruke SpikeNoise filter plug-in av ImageJ/Fiji. Åpne stabelen bildene og klikk SpikeNoise filter.
- Påfør Savitzky Golay Temporal filter plug-in for å få klare dynamikken i reporter uttrykk. Åpne stabelen bildene og klikk Savitzky Golay Temporal filter.
- For å måle intensiteten av reporter uttrykk, gjelder Z Axis profil pluss plug-in til hver enkelt celle. Velg cellene og sett ROIs, region av interesse og klikk Z Axis profil Plus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uttrykk av genene Hes1/7 Exhibit 2 h pendling syklus i ulike cellelinjer og under somitogenesis. Videre er perioden med pendling svært kort og både deres mRNAs og proteiner er ekstremt ustabile med halv livene til rundt 20 min. Hvis du bruker en langsom respons reporter, kan vi ikke spore slike rask dynamikk, og hvis du bruker en stabil reporter, akkumuleres det gradvis mens genet uttrykket svinger. Dermed må reporteren være raskt degradert til å overvåke den raske omsetningen av slike syklisk uttrykt gener. For å overvinne disse problemene, brukte vi luciferase reporter til å overvåke dynamiske uttrykk for oscillatorer. Fordi bioluminesens reporter har en kort modningstid og høy følsomhet, gjør det oss til å overvåke den raske dynamikken i ultradian oscillatorer. Som en fluorescerende reporter, kan luciferase reporter overvåke uttrykket dynamikk av et protein ved å være smeltet til genet Coding Sequence (figur 1a, figur 2E og Figur 3D). Luciferase-smeltet gen produkter viser samme uttrykk, omsetning og translokasjon Kinetics i celler som gjør endogene proteiner. Videre, for å overvåke arrangøren aktivitet av svingte genet Dll1, brukte vi ubiquitinated luciferase, en destabilisert luciferase reporter (figur 1a og Figur 3a)23, hvis halveringstid er ca 10 min20. Ved hjelp av ulike typer luciferase journalister genererte vi transgene mus eller banket inn mus for å få et stabilt uttrykk for reporteren i NPCer under neurogenesis17. For å visualisere reporter uttrykk på ett cellenivå i vev kultur, er spredt innføring av reporter foretrekke. Dermed brukte vi forbigående transfeksjoner av reporter genet i NPCer via i Utero electroporation (figur 2F-H). Luciferase reporter-systemet har blitt brukt innen døgn rytmer for å overvåke dynamiske uttrykk for klokke gener i en lang periode (f.eks. 1 uke), noe som tyder på at luciferin (D-luciferin), underlaget av Firefly luciferase enzymet, er veldig stabilt og har ingen toksisitet for levende celler24,25. Vi bruker vanligvis luciferin i konsentrasjoner på 1 mM i Media, som er tilstrekkelig for over natten Live-celle Imaging. Videre gjør mikroskop BAS ert bildesystem det mulig for oss å anskaffe de multi-dimensjonale bilder, lyse felt bilder, fluorescens bilder og kjemiluminescens bilder (figur 2F-H og Figur 3E).
Ved hjelp av disse forholdene, vi visualisere uttrykk for ulike ultradian klokke gener, inkludert Hes1, Ascl1, Neurog2 og Dll1 (figur 2 og Figur 3). Representative resultater er vist i Figur 3. Reporteren av Dll1 promoter aktivitet utstilt oscillasjon uttrykk i NPCer avledet fra Telencephalon av Dll1-UB-svingninger reporter mus. Den destabilisert luciferase reporter (Figur 3A) indikert skarp opp-og ned regulering av uttrykk for promoter aktivitet (Figur 3B, C). I dette tilfellet vises enkelt nevrale stamceller en ca 2,5 h pendling syklus med ulike amplituder i løpet av 13 h (Figur 3C). Den raske responsen luciferase reporter gjør oss i å fange overføring dynamikken i notch signalering mellom to levende celler (Figur 3D-F og supplerende Movie S1). Vi utarbeidet to typer DNA blandinger: (1) Hes1 promoter reporter (pHes1-UB-Luc) og EGFP uttrykk vektor, og (2) Dll1 protein reporter (Dll1-Luc) og mCherry uttrykk vektor og transfekterte dem i NPCer separat. Da vi samlet de to typer celler og co-kultivert å måle uttrykk for journalister i levende celler. Representative resultater er vist i Figur 3E, F. Tilstøtende EGFP positive celler bærer Hes1 reporter og mCherry positive celler uttrykker Dll1 protein reporter kontaktet med hverandre under observasjon. Hes1 reporter uttrykk i en grønn celle syntes å starte ca 60 min etter to celler kontakt (Figur 3E, F). Dette foreslo at tidsforsinkelsen for overføring av notch signalering mellom tilstøtende celler var om lag 1 t. Videre, under signaloverføring, Dll1 protein uttrykk viste dynamisk translokasjon i en rød celle (Figur 3E).
Figur 1: Disseksjon av den embryonale musen hjernen. (A) strukturen av luciferase journalister, Dll1 promoter reporter og Dll1 protein reporter. (B) prosedyre for disseksjon. (a) lateral visning av en mus embryo. (b) klipp av hodet sammen med den stiplede linjen. (c) Fjern epidermis og brusk fra gapet mellom Telencephalon og mellomhjernen. (d) skjær omkringliggende vev langs midtlinjen mellom høyre og venstre halvkuler. (e) Fjern vevet fra sentrum pause til begge sider. (f) Telencephalon og mellomhjernen etter fjerning av det omgivende vevet. (g) Skill Telencephalon (tlf), mellomhjernen (midten) og olfactory pære (OB). (h) tverrsnitt av Telencephalon, vist i prikkete linje i (g). (i) Fjern hjernehinnene rundt overflaten av Telencephalon. (j) Skill Telencephalon i to deler: midtre og laterale del. (k) skjær grensen av cortex og ganglionic DOMINANS (GE). (l) dorso-lateral del av cortex brukes for dissosiasjon kultur. (C) hjernen på embryonale dag 14 (E14), bestående av venstre (a) og høyre (b) halvkuler av Telencephalon og mellomhjernen (C). (D) telencephalic halvkuler separert fra mellomhjernen. (E) en dissekert halvkule av Telencephalon: den ventrolateral delen av Telencephalon inkludert ganglionic forrang (d), den dorsolateral delen av Telencephalon som brukes for dissosiert kulturer og skjær kulturer (e), den midtre del av Telencephalon (f) og hjernehinnene dekker overflaten av hjernen (g). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Making The kortikale skiver av embryonale Telencephalon og visualisere Dll1 protein dynamikk i kortikale skive kulturer. (A) kontroll av UTTRYKKET for EGFP ved hjelp av fluorescens stereoskopisk mikroskop. Rød pil viser regionen i cortex uttrykke EGFP. Venstre halvkule (a), høyre halvkule (b) og mellomhjernen (c). (B) prikkede linjer indikerer konturene av hjernens regioner vist i (A). (C) dissekert cortex på dorsolateral Telencephalon. Hvite pilspisser angir skjærekantene. (D) kortikale skiver av dorso-lateral Telencephalon. (E) gen strukturer av journalister for å visualisere Dll1 protein dynamikk i NPCer. Den Dll1 protein reporter, Dll1-svingninger (øvre) ble introdusert i NPCer med en EGFP uttrykk vektor (lavere) for å overvåke morfologi og migrasjon av celler i kortikale skiver. (F-H) Tredimensjonale bilder av lyse felt (F), GFP-uttrykk (G) og bioluminesens (H) i kortikale-sektoren. Den bioluminesens Imaging system lov til å spore uttrykk for luciferase og fluorescens reporter samtidig. Vektstenger: 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representative data for visualisering og analyse av dynamiske uttrykk for Dll1 genet i NPC kultur. (A) reporteren konstruere for å visualisere Dll1 uttrykk på transcriptional nivå, ved hjelp av en destabilisert luciferase reporter (UB-luciferase, ubiquitinated luciferase). (B) visualisering av uttrykk for Dll1 i en enkelt NPC med en bioluminesens reporter. Tallene i panelet viser toppen poeng av oscillasjon uttrykk for Dll1 tilsvarende tallene i panel C. (C) en tid kurs plot av bioluminesens den dissosiert NPC vist i (B), stiller den dynamiske uttrykk for Dll1. (D-F) Visualisering av uttrykk for Hes1 promoter reporter og Dll1 protein reporter uttrykt i nabocellene. (D) strukturen i Hes1 promoter Activity reporter (PHes1-UB-Luc) og Dll1 protein reporter (Dll1-Luc). (E og F) Den EGFP positive celle bærer Hes1 reporter (Cell1) og mCherry positiv celle bærer Dll1 protein reporter (Cell2) var co-kultivert og luminescence fra begge typer journalister ble målt. Uttrykket av Hes1 reporter i den grønne cellen (cell1) syntes å starte ca 60 min etter at de to cellene kontaktet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende Movie S1: visualisering av uttrykk for Hes1 promoter reporter og Dll1 protein reporter uttrykt i nabocellene, knyttet til Figur 3D-3F. please Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Komponentene i notch signalering viser oscillasjon uttrykk i Synchrony under somitogenesis men ut av Synchrony under neurogenesis, fører til vanskeligheter i å fange uttrykket dynamikk ved statisk analyse i sistnevnte tilfelle. Således, virkelig-tid avlytting er krevde å avsløre uttrykket dynamikken av hakk signalering komponentene, som Hes1 og Dll1. Fordi periodene i uttrykkene for Hes1 og Dll1 svingninger er ekstremt korte, er omtrent 2-3 h, rask respons og ustabile journalister nødvendig for å overvåke deres uttrykks dynamikk. For dette formålet har vi utviklet bioluminesens reporter og Imaging system. Den bioluminesens reporter luciferase viser rask modning Kinetics og høy følsomhet for å spore den raske omsetningen av slike sykliske genuttrykk. Den raske omsetningen av journalister fører til svært svake signaler generert. Å merker slik svak signaler produsert av det bioluminesens reportere, vi bruk en optimert bioluminesens tenkelig system, inkluderer en høy følsomheten, vann-avkjøle CCD kameraet med en ultra-lav avlesning fart (50 kHz), hvilke reduserer støyen å en minst mulig. Videre, en høy numerisk blenderåpning (N.A.) objektiv objektiv gjør det mulig for oss å samle lyset frigjøres fra destabilisert luciferase reporter til det fulle. For å oppnå høyere følsomhet bruker vi vanligvis høyere binning (f.eks. 2 x 2, 4 x 4, 8 x 8) og holder lukkeren åpen i lang tid (f.eks. 5-20 min). Fordi signalet fra luciferase journalister er svært svakt, presenterer forstyrrelser av lys fra miljøet også et problem i å oppdage svakt signal: således må mikroskop rommet være helt mørkt. Dette systemet gjør det mulig for oss å måle dynamiske uttrykk for Hes1 og Dll1 gener i NPCer i både transcriptional og protein nivå (Figur 3). I tillegg kan vi visualisere protein dynamikken i intracellulære translokasjon med luciferase smeltet protein journalister. Videre bruker rask respons luciferase reporter, kan vi fange overføring dynamikken i notch signalering og måle tidsforsinkelsen for signaloverføring mellom to levende celler (Figur 3D-F og supplerende Movie S1). Videre, kombinasjonen av arrangøren reporter (UB-luciferase reporter) og protein reporter (luciferase fusjon) av et enkelt gen gjør oss i å måle tidsforsinkelsen mellom transkripsjon og oversettelse av genet. På denne måten flere Imaging av ulike typer luminescence journalister og fluorescens reporter er tilgjengelig for å måle tidsforsinkelsen/rate for biokjemiske reaksjoner.
Sanntids overvåking av genuttrykk på én celle oppløsning har avdekket at det er variasjoner i uttrykket dynamikk av samme genet. Noen celler uttrykker Dll1/Neurog2 på oscillasjon måte, mens andre viser vedvarende mønstre. Videre induserer ulike uttrykket dynamikk (oscillasjon versus stødig) ulike utganger i tilstanden til cellene. Det som ser ut til å være klart, er at ulike uttrykk Dynamics påvirke celle atferd på forskjellige måter, noe som tyder på at uttrykket Dynamics koder mer informasjon21,22,26,27,28,29,30,31,32. Den statiske analyser kan ikke fange dynamikken i genuttrykk, og Real-Time analyser er nødvendig for å forstå biologiske fenomener å avdekke uttrykket dynamikk i cellulære hendelser. Tilnærmingen som vi introduserer her kan overvåke dynamikken i ultradian oscillatorer under neural utvikling ved høy Temporal oppløsning. Ved hjelp av denne metoden, fant vi at mange flere gener er dynamisk uttrykt enn vi tidligere hadde trodd, og vi kan spore ikke bare dynamikken i protein uttrykk, men også dynamikken i protein lokalisering i cellen ved høy Temporal oppløsning. Slike dynamiske uttrykks mønstre kan ha biologiske betydninger som ennå ikke er belyst.
Bioluminesens journalister har en stor fordel i Temporal oppløsning og lav toksisitet til levende celler sammenlignet med fluorescens journalister33. Men i motsetning til fargevariasjoner i fluorescerende journalister, er det bare noen få farger i bioluminesens journalister, innføre en begrensning på antall gener som kan overvåkes samtidig. Likevel er økende antall variable luciferase blir isolert og klonet fra ulike skapninger34,35, og bruker en slik rekke luciferases, vil vi være i stand til å samtidig spore flere genuttrykk dynamikk i en enkelt celle ved høy Temporal oppløsning. Den molekylære størrelsen av Firefly luciferase er større enn fluorescens journalister, som presenterer noen vanskeligheter med å konstruere reporter-smeltet proteiner å overvåke protein dynamikk, men nylig, en ny, mindre og lysere luciferase har blitt klonet36, som ville tillate oss å visualisere protein dynamikk enklere enn noensinne. Et økende antall rapporter har nylig vist ulike typer dynamikk i genuttrykk og protein translokasjon i ulike biologiske hendelser21,22,26,27,28,29,30,31,32. Analyser av slike dynamikk i spatiotemporal regulering ved hjelp av et sanntids overvåkingssystem vil bli stadig viktigere å fange de faktiske tilstander av celler og avdekke regulering av cellulære systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen motstridende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Yumiko Iwamoto for å støtte produksjonen av videoen. Vi er også takknemlige for Akihiro Isomura for diskusjon og støtte av bildeanalyse, Hitoshi Bramidan for teknisk støtte for generering av transgene dyr, Yuji Shinjo (Olympus Medical Science), Sangchul Egawa (Olympus Medical Science), Takuya Ishizu ( Olympus Medical Science) og Ouin Kunitaki (Andor Japan) for teknisk støtte og diskusjoner av bioluminesens Imaging system. Dette arbeidet ble støttet av Core Research for evolusjonære Science and Technology (JPMJCR12W2) (R.K.), Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på innovative områder (MEXT 24116705 for H.S. og MEXT 16H06480 for R.K.), Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning (C) (JSP 18K06254) (H.S.), Takeda Foundation (R.K. og H.S.), og plattform for dynamiske tilnærminger til Living system fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioluminescence Imaging System | |||
| Chilled water circulator (chiller) | Julabo | Model: F12-ED | |
| Cooled CCD camera | Andor Technology | Model: iKon-M 934 | |
| Incubator system | TOKAI HIT | Model: INU-ONICS | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX81 | |
| Inverted microscope | Olympus | Model: IX83 | |
| LED illumination device | CoolLED | Model: pE1 | |
| MetaMorph | MOLECULAR DEVICES | Model: 40000 | |
| Mix gas controller | Tokken | Model: TK-MIGM OLO2 | |
| Objective lens | Olympus | Model: UPLFLN 40X O | |
| Preparations for Dissection | |||
| Dissection microscope | Nikon | Model: SMZ-2B | |
| Fluorescence stereoscopic microscope | Leica | Model: MZ16FA | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Scissors, Micro scissors | |||
| Forceps | |||
| Ring-shaped forceps | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Reagents for NPC dissociation culture | |||
| B27 supplement | invitrogen | 12587-010 | |
| bFGF | invitrogen | 13256-029 | Stock solution: 1 μg/ml in 0.1% BSA/PBS |
| D-luciferin | Nacalai Tesque | 01493-85 | Stock solution: 100mM in 0.9% saline |
| DNase | Worthington Biochemical Corporation | LK003172 | Stock solution: 1000U/ml in EBSS |
| EBSS | Worthington Biochemical Corporation | LK003188 | |
| Glass bottom dish | IWAKI | 3910-035 | |
| N2 supplement (100x) | invitrogen | 17502-048 | |
| N-acetyl-cystein | Sigma | A-9165-25G | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LK003178 | Stock solution: 7U/ml in EBSS |
| Penicillin/Streptmycine | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P-6281 | 40 mg/ml in DW |
| Preparations for in utero electroporation | |||
| 50-ml syringe | TERUMO | 181228T | |
| Electrode | Neppagene | 7-mm | |
| Electroporator | Neppagene | CUY21 EDIT | |
| Forceps | |||
| Gauzes | Kawamoto co. | 7161 | |
| Micro capillary | Made in-house | ||
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Pentbarbital | Kyoritsuseiyaku | Somnopentyl | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Suture needle | Akiyama MEDICAL MFG. CO | F17-40B2 | |
| Xylazine | Bayer | Seractal | |
| Preparations for Slice culture | |||
| 10-cm plastic petri dish | greiner | 664160-013 | |
| 35-mm plastic petri dish | greiner | 627160 | |
| Culture insert | Millipore | PICM01250 | |
| DMEM/F12 | invitrogen | 11039-021 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 172012-500ML | |
| Fine forceps | DUMONT | INOX No.5 | |
| Forceps | |||
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | |
| Micro surgical knife | Alcon | 19 Gauge V-Lance | |
| Multi-gas incubator | Panasonic | MCO-5MUV-PJ | |
| N2/B27 media | Made in-house | ref. NPC dissociatioin culture | |
| PBS | Nacalai Tesque | 14249-24 | |
| Ring-shaped forceps | |||
| Scissors, Micro scissors | |||
| Silicon rubber cutting board | Made in-house |
References
- Ross, S. E., Greenberg, M. E., Stiles, C. D. Basic helix-loop-helix factors in cortical development. Neuron. 39, 13-25 (2003).
- Pontious, A., Kowalczyk, T., Englund, C., Hevner, R. F. Role of intermediate progenitor cells in cerebral cortex development. Developmental Neuroscience. 30, 24-32 (2007).
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Paridaen, J. T., Huttner, W. B. Neurogenesis during development of the vertebrate central nervous system. EMBO Reports. 15, 351-364 (2014).
- Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
- Louvi, A., Artavanis-Tsakonas, S. Notch signaling in vertebrate neural development. Nature Reviews Neuroscience. 7, 93-102 (2006).
- Pierfelice, T., Alberi, L., Gaiano, N. Notch in the Vertebrate Nervous System: An Old Dog with New Tricks. Neuron. 69, 840-855 (2011).
- Bray, S. Notch signalling: a simple pathway becomes complex. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 678-689 (2006).
- Bray, S. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 722-735 (2016).
- Kopan, R., Ilagan, M. X. G. The Canonical Notch Signaling Pathway: Unfolding the Activation Mechanism. Cell. 137, 216-233 (2009).
- Ishibashi, M., et al. Persistent expression of helix-loop-helix factor HES-1 prevents mammalian neural differentiation in the central nervous system. The EMBO Journal. 13, 1799-1805 (1994).
- Ohtsuka, T., et al. Hes1 and Hes5 as notch effectors in mammalian neuronal differentiation. The EMBO Journal. 18, 2196-2207 (1999).
- Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F., Kageyama, R. Roles of the Basic Helix-Loop-Helix Genes Hes1 and Hes5 in Expansion of Neural Stem Cells of the Developing Brain. Journal of Biological Chemistry. 276, 30467-30474 (2001).
- Kageyama, R., Ohtsuka, T., Kobayashi, T. The Hes gene family: repressors and oscillators that orchestrate embryogenesis. Development. 134, 1243-1251 (2007).
- Shimojo, H., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Oscillations in Notch Signaling Regulate Maintenance of Neural Progenitors. Neuron. 58, 52-64 (2008).
- Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Shimojo, H., et al. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes and Development. 30, 102-116 (2016).
- Hirata, H., et al. Oscillatory expression of the bHLH factor Hes1 regulated by a negative feedback loop. Science. 298, 840-843 (2002).
- Kageyama, R., Ohtsuka, T., Shimojo, H., Imayoshi, I. Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition. Nature Neuroscience. 11, 1247-1251 (2008).
- Masamizu, Y., et al. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 1313-1318 (2006).
- Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342, 1193-1200 (2013).
- Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152, 945-956 (2013).
- Luker, G. D., Pica, C. M., Song, J., Luker, K. E., Piwnica-Worms, D. Imaging 26S proteasome activity and inhibition in living mice. Nature Medicine. 9, 969-973 (2003).
- Yamaguchi, S., et al. Synchronization of Cellular Clocks in the Suprachiasmatic Nucleus. Science. 302, 1408-1412 (2003).
- Kiyohara, Y. B., et al. The BMAL1 C terminus regulates the circadian transcription feedback loop. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10074-10079 (2006).
- Behar, M., Hoffmann, A. Understanding the temporal codes of intra-cellular signals. Current Opinion in Genetics and Development. 20, 684-693 (2010).
- Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. Stochastic Gene Expression in a Single Cell. Science. 297, 1183-1186 (2002).
- Nelson, D. E., et al. Oscillations in NF-kappaB signaling control the dynamics of gene expression. Science. 306, 704-708 (2004).
- Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
- Hansen, A. S., O'Shea, E. K. Promoter decoding of transcription factor dynamics involves a trade-off between noise and control of gene expression. Molecular Systems Biology. 9, 704 (2014).
- Hansen, A. S., O'Shea, E. K. cis Determinants of Promoter Threshold and Activation Timescale. Cell Reports. 12, 1226-1233 (2015).
- Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling Dynamics Control Cell Fate in the Early Drosophila Embryo. Developmental Cell. 48, 361-370 (2019).
- Badr, C. E., Tannous, B. A. Bioluminescence imaging: Progress and applications. Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).
- Nakajima, Y., Ohmiya, Y. Bioluminescence assays: multicolor luciferase assay, secreted luciferase assay and imaging luciferase assay. Expert Opinion on Drug Discovery. 5, 835-849 (2010).
- Nakajima, Y., et al. Enhanced beetle luciferase for high-resolution bioluminescence imaging. PLoS One. 5, (2010).
- Stacer, A. C., et al. NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular Imaging. 12, (2013).
