Denne protokol er for objektiv påvisning af vævs-associerede bakterier i patient biopsier af 16S rRNA in situ hybridisering og konfokal mikroskopi.
Visualisering af samspillet mellem bakterier med Host slimhinde overflader og væv kan give værdifuld indsigt i mekanismer af patogenesen. Mens visualisering af bakterielle patogener i dyremodeller af infektion kan stole på bakteriestammer konstrueret til at udtrykke fluorescerende proteiner såsom GFP, visualisering af bakterier i slimhinden af biopsier eller væv opnået fra humane patienter kræver en upartisk metode. Her beskriver vi en effektiv metode til påvisning af vævs associerede bakterier i humane biopsi sektioner. Denne metode udnytter fluorescerende in situ-hybridisering (fisk) med et fluorercentligt mærket Universal oligonucleotid-sonde for 16S rRNA til at mærke vævs associerede bakterier i blære biopsi sektioner erhvervet fra patienter, der lider af recidiverende Urinvejsinfektion. Ved brug af en universel 16S rRNA-sonde kan bakterier påvises uden forudgående kendskab til arter, sleller eller biokemiske egenskaber, såsom lipopolysaccharid (LPS), som ville være påkrævet til påvisning ved immunofluorescens eksperimenter. Vi beskriver en komplet protokol for 16S rRNA fisk fra biopsi fiksering til Imaging af confokal mikroskopi. Denne protokol kan tilpasses til brug i næsten alle typer af væv og repræsenterer et kraftfuldt værktøj til den upartiske visualisering af klinisk relevante bakterie-vært interaktioner i patientens væv. Desuden kan denne protokol anvendes til påvisning af specifikke bakterielle patogener i patient vævet ved hjælp af arter eller SLA-specifikke sonder.
Urinvejene, bestående af urinrøret, blæren, urinlederne og nyrerne er konstant udsat for bakterier, der omfatter urin-mikrobiome samt invaderende uropatogener, ligesom uropatogene E. coli (upec), fra mave-tarmkanalen 1,2. Et lag af hydreret Slim bestående af glycosaminoglycaner og en uigennemtrængelig plak af glykosyleret uroplakin proteiner udtrykt på overfladen af de overfladiske celler udgør en barriere, der rutinemæssigt beskytter blæreepitelet fra invasion af klæber bakterier3,4. Under urinvejsinfektion (UTI), er disse barrierer forstyrret eller ødelagt, lette fastgørelse til og invasion af blæreepitelet af uropatogene bakterier5,6. Arbejde i murine modeller har afsløret, at mange uropatogene bakterier, herunder UPEC, Klebsiella pneumoniae, og Enterococcus fæalis kan danne replikerende intracellulære samfund (IBCs) inden for cytoplasmaet af overfladiske celler og latent intracellulære reservoirer (qirs) inden for overgangs epiteliale celler7,8,9. Selv om UPEC er blevet identificeret i kaste epiteliale celler fra humane UTI patienter, interaktion af uropatogener med blære slimhinde hos mennesker havde ikke tidligere visualiseret10.
Vi tilpassede en fælles teknik, fluorescens in situ hybridisering (fisk), til at opdage bakterier i slimhinden i blære biopsier opnået fra postmenopausale patienter, der gennemgår Cystoskopi med elektro fulguration af trigonitis (CEFT) for den avancerede håndtering af antibiotika-refraktær recidiverende UTI11. Ved hjælp af en universel sonde til 16S rRNA, vi var i stand til objektivt at opdage bakteriearter forbundet med blære slimhinde af recidiverende UTI patienter og bestemme deres position i blæren væggen12. Den universelle 16S rRNA nucleotid sonde var tidligere designet til at målrette en bevaret region af bakteriel 16S rRNA13, som svarer til positioner 388-355 af E. coli 16S rRNA. 16S rRNA og scramble Probe sekvenser er tidligere blevet valideret og offentliggjort til brug i mus mavetarmkanalen14,15. Prøvenes sekvenser og egenskaber er beskrevet i tabel 1. Det er vigtigt at bruge to sekventielle sektioner i denne protokol, en for 16S rRNA Probe og en for scramble Probe, at være i stand til at skelne mellem true og baggrunds signal som blære epithelium, kollagen og elastin udviser autofluorescens16 . I denne protokol, 16S rRNA og scramble sonder blev designet med fluorescerende Alexa fluor 488 etiketter på både 3 ‘ og 5 ‘ Termini via N-hydroxysuccinimide (NHS) ester forbindelser for at øge fluorescerende signal.
Selv om denne protokol blev udviklet til brug på human blære biopsi sektioner, det kan let tilpasses til brug på paraffin-indlejrede sektioner fra ethvert væv, hvor bakterier menes at opholde sig. I modsætning til immun histokemi eksperimenter, der er rettet mod specifikke antigener (f. eks. lipopolysaccharid) på den bakterielle overflade, kræver denne metode ingen forudgående viden om antigener udtrykt ved vævs associerede bakterier10,17 . Brug af Universal 16S rRNA-sonden giver mulighed for objektiv påvisning af alle bakteriearter i prøven, men tillader ikke bestemmelse af deres identitet. For at bestemme identifikation af fundne bakterier, arter eller slægt-specifikke 16S eller 23S rRNA sonder skal anvendes. Denne protokol vil heller ikke afsløre svampe patogener, såsom Candida albicans, forbundet med værtsvæv. Til påvisning af svampe patogener skal 28S eller 18S rRNA-sonder anvendes18.
Her beskriver vi en protokol til påvisning af vævs associerede bakterier i humane blære biopsier af 16S rRNA FlSH. Denne protokol kan let tilpasses til biopsier taget fra andre væv, såsom mave-tarmkanalen eller huden, og kan udvides til væv høstet fra en række pattedyr model organismer. Den her beskrevne protokol kan også tilpasses til anvendelse af multiple fiksering (f. eks. formalin, ethanol, methacarn) og vævs Præparations teknikker (f. eks. paraffin eller harpiks indlejret og kryopræserverede væv). Den dobbelt mærkede Universal 16S rRNA-sonde giver mulighed for objektiv påvisning af alle bakteriearter, som findes i vævet, og kan give værdifuld indsigt i, hvordan patogener og mikrobiota rumligt interagerer med slimhinde overflader i sygdom og sund Stater. Ved hjælp af ressourcer såsom probeBase, PhylOPDb eller PROBE_DESIGN-værktøjet i ARB-softwarepakken til udvælgelse eller design af arter eller slægter specifikke 16S eller 23S rRNA-sonder, kan denne protokol tilpasses til påvisning af specifikke bakteriearter eller slægter inden for vævs15,21,22. En vigtig fremtidig retning for denne metode er multiplexing ved hjælp af arter-eller genera-specifikke sonder mærket med forskellige, diskrete fluorophorer til evaluering af mikrobiel mangfoldighed i blæren slimhinde.
Den primære begrænsning af denne metode til brug på humane prøver er tilgængeligheden af biopsieret væv. Institutionel revision bestyrelsen godkendelse og informeret patientsamtykke er forpligtet til at opnå biopsier og direkte samarbejde med klinikeren udfører proceduren er nødvendig for optimal prøveindsamling og adgang til patientens metadata. CEFT-proceduren selv ødelægger blæreepitelet, så vi var i stand til at retfærdiggøre biopsi af disse områder før proceduren. Der kræves en stinkhætte eller et passende monteret biosikkerheds kabinet til denne protokol på grund af brugen af giftige xylener i afparaffinserings trinnet og behovet for at opretholde et sterilt miljø under hele proceduren. Et fluorescerende mikroskop, fortrinsvis Konfokal, med en 63x eller en 100x objektiv og passende filter sæt til visualisering af Hoechst, Alexa-555, og Alexa-488 er påkrævet for denne protokol. De repræsentative resultater i figur 1 blev afbildet ved hjælp af et laser scannings Konfokal mikroskop. Tilsvarende laser scannings mikroskoper bør producere sammenlignelige billeder. Denne protokol er begrænset af dens evne til kun at detektere vævs-associerede bakterier og ikke, for eksempel, svampe. Sonder specifikke svampe 18S eller 28S rRNA skal anvendes til at identificere svampe patogener i vævs18.
Kritiske trin til denne protokol omfatter opretholdelse af et sterilt miljø under hele proceduren og sikring af, at vævet ikke tørrer ud mellem hybridiserings-og farvnings trin. Hvis vævet tørrer ud under proceduren, kan signalet blive dæmpet, eller vævet kan falde ned fra diaset under et vaske trin. Det er også vigtigt altid at bruge to serielle sektioner til denne protokol – en til 16S rRNA-sonden og en til scramble-sonden. Uden denne kontrol kan det være meget vanskeligt at skelne falske positiver, og de indhentede data er muligvis ikke nyttige eller informative. Hvis denne protokol tilpasses til brug med en anden sonde end den universelle 16S-rRNA-sonde, skal der udvises forsigtighed ved valg af en passende hybridiseringstemperatur, ca. 5 °C lavere end sondens forventede smeltetemperatur. For at opretholde signal intensiteten må vævet ikke udsættes for lys i længere tid, efter at sonden er blevet tilsat, og må ikke være overeksponeret under mikroskopi. Endelig skal de samme indstillinger for kanalen, der svarer til fluoroforet konjugeret til fiske sonden, under mikroskopi holdes sammenhængende mellem eksperimentel (16S rRNA-sonde) og kontrol (scramble Probe) dias. Visualisering af det rumlige forhold mellem bakterier inden for slimhinde overflader af patient afledte væv er afgørende for at forstå og opbygge klinisk relevante hypoteser om vært-patogen interaktioner underliggende smitsomme sygdomme.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Kim Orth og Marcela de Souza Santos for protokol rådgivning og Amanda Arute for teknisk support. Dette arbejde blev delvist støttet af Cecil H. og Ida Green Chair i Systems Biology Science, som indehaves af K.P.
Alexa-555 Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Staining Actin |
Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Invitrogen | W32464 | Staining Mucin |
Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-741-07 | Sterilization |
Coplin Jar | Simport | M900-12W | Deparaffinization/washing |
Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | Microscopy |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-224 | Rehydration |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311-500 | TE |
Frosted Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-343 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen | H21492 | Staining Nucleus |
Hydrophobic marker | Vector Laboratories | H-4000 | Hydrophobic barrier |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11 | |
Oil Immersol 518 F | Fisher Scientific | 12-624-66A | Microscopy |
Paraformaldehyde (16%) | Thermo Scientific | TJ274997 | Fixation |
ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Mounting medium |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | Hybridization buffer/PBS |
Sodium Dodecyl Sulphate | Fisher Scientific | BP166-500 | Hybridization buffer |
Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | PBS |
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher Scientific | S369-500 | PBS |
Syringe | VWR | 75486-756 | Sterilization |
Tris-HCl | Fisher Scientific | BP152-5 | TE/Hybridization buffer |
Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL | Deparaffinization |
0.22 micron syringe filter | Fisher Scientific | 09-754-29 | Sterilization |