Summary
Этот протокол предназначен для объективного обнаружения связанных с тканями бактерий в биопсии пациента 16S rRNA на месте гибридизации и конфокальной микроскопии.
Abstract
Визуализация взаимодействия бактерий с слизистыми поверхностями и тканями-хозяинами может дать ценную информацию о механизмах патогенеза. В то время как визуализация бактериальных патогенов в животных моделях инфекции может опираться на бактериальные штаммы, разработанные для выражения флуоресцентных белков, таких как GFP, визуализация бактерий в слизистой оболочке биопсии или тканей, полученных от пациентов, требует беспристрастный метод. Здесь мы описываем эффективный метод обнаружения связанных с тканями бактерий в секциях биопсии человека. Этот метод использует флуоресцентные на месте гибридизации (FISH) с флуоресцентно помечены универсальный олигонуклеотидный зонд для 16S rRNA для обозначения тканей связанных бактерий в разделе биопсии мочевого пузыря, приобретенных у пациентов, страдающих от периодических инфекции мочевыводящих путей. С помощью универсального зонда 16S rRNA бактерии могут быть обнаружены без предварительного знания видов, родов или биохимических характеристик, таких как липополисахарид (LPS), которые потребуются для обнаружения с помощью иммунофлюоресценции экспериментов. Мы описываем полный протокол для 16S rRNA FISH от биопсии фиксации до визуализации с помощью конфокальной микроскопии. Этот протокол может быть адаптирован для использования практически в любом типе тканей и представляет собой мощный инструмент для объективной визуализации клинически значимых взаимодействий бактериального хозяина в тканях пациента. Кроме того, используя виды или гены конкретных зондов, этот протокол может быть адаптирован для обнаружения конкретных бактериальных патогенов в тканях пациента.
Introduction
Мочевые тракты, состоящие из уретры, мочевого пузыря, мочеточников и почек постоянно подвергаются воздействию бактерий, которые составляют микробиом мочевыводящих путей, а также вторжение уропатогенов, как уропатогенный кишечной палочки (UPEC), из желудочно-кишечного тракта 1,2. Слой гидратасной слизи, состоящий из гликозаминогликанов и непроницаемого налета гликозилатированных уроплакиновых белков, выраженных на поверхности поверхностных клеток, образует барьер, который регулярно защищает эпителий мочевого пузыря от вторжения адептов бактерии3,4. Во время инфекции мочевыводящих путей (UTI), эти барьеры нарушаются или разрушаются, облегчая привязанность к эпителию мочевого пузыря уропатогенными бактериями5,6. Работа в моделях мурин показала, что многие уропатогенные бактерии, включая UPEC, Klebsiella pneumoniaeи Enterococcus faecalis могут образовывать репликационные внутриклеточные сообщества (МКК) в цитоплазме поверхностных клеток и тихие внутриклеточные резервуары (ЗР) в переходных эпителиальных клетках7,8,9. Хотя UPEC был определен в сарае эпителиальных клеток от человека UTI пациентов, взаимодействие уропатогенов с слизистой оболочки мочевого пузыря у людей ранее не были визуализированы10.
Мы адаптировали общую технику, флуоресценцию на месте гибридизации (FISH), для обнаружения бактерий в слизистой оболочке биопсии мочевого пузыря, полученных от пациентов в постменопаузе, проходящих цистоскопию с электрофулгуляцией тригонита (CEFT) для передовых управление антибиотико-огнеупорной рецидивирующей UTI11. Используя универсальный зонд для 16S rRNA, мы смогли объективно обнаружить бактериальные виды, связанные с слизистой оболочки мочевого пузыря рецидивирующих пациентов UTI и определить их положение в стенке мочевого пузыря12. Универсальный нуклеотидный зонд 16S rRNA ранее был разработан для целевой области бактериальной 16S rRNA13,которая соответствует позициям 388-355 из E. coli 16s rRNA. 16S rRNA и карабкаться зонд последовательности были ранее проверены и опубликованы для использования в желудочно-кишечном тракте мыши14,15. Последовательности и свойства зондов описаны в таблице 1. Важно использовать два последовательных раздела в этом протоколе, один для зонда 16S rRNA и один для зонда схватки, чтобы иметь возможность различать истинный и фоновый сигнал, как эпителий мочевого пузыря, коллагена и эластина экспонат автофлюоресценции16 . В этом протоколе, 16S rRNA и карабкаться зонды были разработаны с флуоресцентными Alexa Fluor 488 этикетки на 3' и 5 ' termini через N-hydroxysuccinimide (NHS) эфир ные звенья для увеличения флуоресцентного сигнала.
Хотя этот протокол был разработан для использования на секциях биопсии мочевого пузыря человека, он может быть легко адаптирован для использования на парафин-встроенных разделов из любой ткани, где бактерии, как полагают, проживают. В отличие от экспериментов иммуногистохимии, нацеленных на конкретные антигены (например, липополисахарид) на бактериальной поверхности, этот метод не требует предварительного знания антигенов, выраженных бактериями, связанными с тканями10,17 . Использование универсального зонда 16S rRNA позволяет объективное обнаружение всех видов бактерий в образце, но не позволяет определить их личность. Для определения выявленных бактерий, видов или рода конкретных 16S или 23S rRNA зонды должны быть использованы. Этот протокол также не будет обнаруживать грибковые патогены, такие как Candida albicans, связанные с тканью хозяина. Для обнаружения грибковых патогенов необходимо использовать 28С или 18S rRNA зонды18.
Protocol
Протокол исследования был одобрен и следовал руководящим принципам Институциональных комитетов по биобезопасности и химической безопасности UT Dallas и UT Southwestern Medical Center. Использование биопсии от человека в этом протоколе был одобрен и следовал руководящим принципам институционального обзора советов UT Даллас и UT Southwestern Medical Center. Все лица, занимающиеся сбором и обработкой биопсии, имеют текущую защиту человека (HSP) и hipPA.
1. Ткань Подготовка к фиксации и параффин встраивания
ПРИМЕЧАНИЕ: Биопсия была взята из согласия женщин, проходящих цистоскопию с электро-фулгуляции тригонита для передового управления рецидивирующей инфекции мочевыводящих путей (UTI). UTI определяется как 3 ИТУ в 12-месячный период. Сбор биопсии проводился в операционной, пока пациент находился под наркозом после получения информированного согласия пациента по протоколу UTSW IRB STU 082010-016. Все образцы были закодированы и деидентифицированы до экспериментов.
- Получить холодную чашку (1 мм3) биопсии из мочевого пузыря trigone с урологическими щипцы через гибкий цистоскоп и место сразу в стерильные 2 мл криовиальной содержащие 1,5 мл 4% V / V параформдегида (PFA), подготовленный в 1x стерильных фосфатных солей (PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: 4% PFA в 1x PBS может быть сделано заранее и храниться при -20 градусов по Цельсию до тех пор, пока это необходимо. - Исправьте биопсию на 6 ч при комнатной температуре или на 16-24 ч при температуре 4 градусов по Цельсию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длительность фиксации должна быть рассчитана на основе размера образца ткани и чрезмерной фиксации следует избегать. Не рекомендуется использовать глютаральдегид в качестве фиксатора, поскольку он вводит автофлюоресценции. - В стерилизованном капоте или шкафе биобезопасности, удалить фиксатор путем pipetting и заменить 1,5 мл стерильных 1x PBS. Держите образцы на 4 кВ ночь или сразу же выполнять обработки тканей и парафин встраивания19.
- Используйте стерилизованный микротом для секции тканей блоков на 5 мкм толщины и придерживаться парафин ткани разделов заряженных стеклянный микроскоп слайды. Минимум два слайда на биопсию потребуется для протокола 16S rRNA FISH.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань биопсии должна быть поперечно расположена по отношению к плоскости резки, чтобы обеспечить визуализацию уротелиальных слоев во всех секциях. Следует также отметить, что толщина секций должна быть оптимизирована для обнаружения бактериального сообщества. Более тонкие секции или выборка нескольких серийных секций могут потребоваться в случае инфекций, когда бактерии, проживающие в тканях, крайне скудны (например, бактерия, проживающая в тканях на 1000 клеток млекопитающих).
2. Флуоресценция В ситу Гибридизация с универсальными 16S rRNA зондов
ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется два слайда на биопсию. Один слайд необходим для универсального зонда 16S rRNA и один слайд для управляющего зонда с скремблированным последовательность. Это важно для различения истинного сигнала от фонового сигнала во время микроскопии, так как эпителий мочевого пузыря является автоматически флуоресцентным в нескольких каналах. В дополнение к карабкаться зонд, блокирование с 0,1% Судан Черный B до монтажа может уменьшить фон аутофлуоресценции присущие ткани20.
- Приготовление реагентов и дымового капота
- Очистите пустой дым капот (или надлежащим образом оборудованы биобезопасности шкаф) с 70% этанола.
- Подготовьте буфер гибридизации, состоящий из 0,9 м хлорида натрия (NaCl), 20 мм Tris-HCl (pH 7.2), 0,1% сульфата натрия (SDS) в 10 мл стерильной фильтрованной воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильная фильтрованная вода может быть подготовлена путем прохождения автоматической дистиллированной воды через фильтр 0,22 мкм. Буфер гибридизации может храниться при комнатной температуре, но SDS может выпасть из раствора. Если SDS осаждает осадки, разогрейте раствор в водяной бане 50 градусов до начала использования. - Приготовьте не менее 100 мл каждый из 95% и 90% этанола в стерильной фильтруе воды в вымытых, автоматически хутоленных бутылках.
- Растворите флуоресцентно маркированные лиофилизированные зонды в 10 мм Tris-HCl (pH 8.0) и 1 мМ этиленденедиаминететраацетической кислоты (ЭДТА), подготовленном в фильтровальной стерилизованной нуклеазе свободной воды до конечной концентрации 100 мкм. Подготовьте разбавление 1 мкм в буфере TE для использования в этом протоколе. Храните как 100 концентрированных запасов, так и 1 мкм запас восстановленных зондов при -20 градусов по Цельсию, защищенных от света.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не растворяйте флуоресцентно маркированные зонды в воде. Буферизация необходима для предотвращения гидролизов эстер-облигаций ГСЗ, спряживающих фторофора с нуклеотидным зондом. - Очистите пять коплиновых банок с 70% этанола, дайте высохнуть, направьте следующим образом: ксилены I, ксилены II, 95% EtOH, 90% EtOH, ddH2O, и заполните 100 мл соответствующего раствора. Это поможет избежать путаницы в последующих шагах.
- Ткань депарафина и регидратация
- В капоте, поместите две горки за биопсию в вертикальную стойку слайда.
- Поместите вертикальную стойку слайда в банку xylenes I Coplin (содержащую 100 мл ксиленов) в течение 10 минут.
- Снимите стойку слайда с ксиленов I и промокните дно на бумажном полотенце, чтобы удалить излишки ксиленов. Место в ксилены II Коплин банку в течение 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не работайте с ксиленами за пределами сертифицированного капота дыма. - Регидратные депарафафинированные участки тканей в последовательных итаноловых смканях (95% и 90%) в течение 10 минут каждый в соответственно помечены Коплин банки.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, теплый буфер гибридизации до 50-56 градусов по Цельсию в водяной бане - Снимите стойку слайда с 90% этанола мыть, пятно дно на бумажные полотенца, чтобы удалить избыток этанола, и место в ddH2O Коплин банку, содержащую 100 мл фильтра стерилизованных ddH2O в течение 10 минут.
- В ожидании ddH2O мыть, разбавить зонды до 10 нм в буфере гибридизации для создания раствора окрашивания. Подготовьте 150 л окрашивающего раствора на слайд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите раствор окрашивания от света, обернув трубки в алюминиевую фольгу и храня в ящике. При работе с флуоресцентно помечены зонды на скамейке, рассмотреть вопрос о выключении накладных огней, когда это в состоянии. Зонды, разбавленные буфером гибридизации, не должны использоваться повторно.
- Гибридизация и контрокрасирование
- Подготовьте увлажняющую камеру для каждого зонда, поместив пропитанный, скомканный Кимуйп и стерильной воды в резервуар P1000 наконечник поле. Поместите картридж держателя наконечника на вершине - это где слайды будут сидеть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать увлажняющую камеру для предотвращения высыхания участков биопсии во время гибридизации. Следует отметить, что коммерчески доступные увлажнительные камеры предназначены для поддержания стабильной, влажной атмосферы. Тем не менее, техника, описанная здесь, достаточно контролирует влажность при существенно меньших затратах. - Снимите слайды со стеллажа и поместите на свежее бумажное полотенце (ткань вверх). Используйте Kimwipe, чтобы высушить слайд. Будьте осторожны, чтобы только осторожно мазок вблизи (не на) биопсии разделе фитиль от воды. Используя гидрофобную ручку, нарисуйте границу вокруг раздела биопсии и поместите слайд ткани вверх в увлажняющей камере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро, чтобы ткани не высохли перед гибридизацией. - Поместите увлажняющую камеру в инкубатор, установленный до 50 градусов по Цельсию. Пипетка 50-150 л окрашивающего раствора непосредственно на верхней части ткани, так что прямоугольник, сделанный гидрофобной границы вокруг ткани заполнен. Будьте осторожны, чтобы не добавить слишком много решения, чтобы переполнить гидрофобной границы. Закройте коробку осторожно.
- Инкубировать на ночь (16 ч) при 50 градусах По Цельсия в темноте. Если у инкубатора есть окно, накройте его алюминиевой фольгой, чтобы создать темную среду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для надежного сигнала требуется температура гибридизации ниже температуры плавления зонда FISH. 50 градусов по Цельсию является оптимальной температурой для универсального зонда 16S rRNA, но не может быть оптимальным для других зондов. - На следующее утро, подготовить по крайней мере 500 мл буфера мытья состоит из 0,9 М NaCl, 20 мМ Tris-HCl (pH 7.2) в ddH2O и фильтр-стерилизовать в стерильную бутылку с вакуумной бутылкой-топ фильтра. Теплый до 50-56 градусов по Цельсию на водяной бане.
- Удалите слайды из увлажняющих камер и тщательно фитиль от любого оставшегося решения гибридизации с Kimwipe. Поместите горки в вертикальную стойку для окрашивания.
- Поместите окрашивание стойки в непрозрачный Coplin банку, содержащую 100 мл предварительно подогретого буфера мыть в течение 10 минут. Если банки Коплин не являются непрозрачными (например, стекло), поместите их в темноте во время инкубационных шагов - возможно, под коробку или в ящик.
- Повторите шаг мытья дважды со свежим буфером мытья в новых банках Коплин.
- Во время мытья шаги, подготовить контр-пятно, разбавляя 100 мкг / мл бульонрешение Hoechst 33342 1:1,000 в мытье буфера. К той же трубке добавьте Алекса-555 зародышевой пшеницы агглютинин (WGA) к конечной концентрации 5 мкг/мл и Alexa-555 Phalloidin до конечной концентрации 33 нм. Хранить в темноте до готовности к использованию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Hoechst, Alexa-555 WGA, и Alexa-555 Phalloidin этикетке ДНК, муцин / уроплакины, и актин, соответственно, и может храниться в долгосрочной перспективе в темноте в соответствии с инструкциями производителя. Флуоресцентные метки, используемые для зондов и противоправных пятен, могут быть настроены для наборов фильтров, доступных для использования микроскопа. - Удалите слайды с последней стирки и аккуратно фитиль от избыточного буфера мыть с Kimwipe. Поместите слайды ткани вверх на бумажное полотенце и добавить 50-150 л противопят прямо на верхней части ткани, так что гидрофобная граница заполнена, но не переполнены. Обложка до четырех слайдов с криобокс-топ и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Поместите стороны обратно в окрашивание стойки и мыть в два раза больше в Коплин банки со свежим буфером мыть, в течение 10 минут каждый.
- Тщательно высушите горки после последней стирки и поместите ткань-сторону вверх на бумажное полотенце под криобокс-топ. Сожмите одну каплю монтажа носителя непосредственно на верхней части ткани. Аккуратно поместите соответствующий размер coverslip (будет зависеть от размера биопсии) на вершине. Аккуратно нажмите на любые пузыри, как они будут вмешиваться в визуализации и позволяют крышка скольжения слайды для лечения на ночь в темноте.
- На следующий день, печать края крышки слайда с легким слоем прозрачного лака для ногтей. Дайте высохнуть в течение 10 минут в темноте, а затем хранить в темноте при 4 квке для конфокальной микроскопии.
- Подготовьте увлажняющую камеру для каждого зонда, поместив пропитанный, скомканный Кимуйп и стерильной воды в резервуар P1000 наконечник поле. Поместите картридж держателя наконечника на вершине - это где слайды будут сидеть.
3. Визуализация 16S rRNA FISH с помощью конфокальной микроскопии
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола наилучшие результаты достигаются с помощью конфокального микроскопа лазерного сканирования с 63x и 100x целями. Требуются надлежащие наборы фильтров для визуализации Hoechst, Alexa-488 и Alexa-555 fluorescence. Однако стандартная флуоресцентная микроскопия может быть использована, если конфокальный микроскоп недоступен. Этот протокол предназначен для лазерного сканирования конфокального микроскопа.
- Включите конфокальный микроскоп и компьютерное программное обеспечение, связанное с микроскопом в инструкции производителя.
- Загрузите слайд и визуализировать с целью 10x в синий (DAPI / Hoechst) канал. Сосредоточьтесь внимательно, пока не будут видны ядра.
- После сосредоточения, изменить цель на высокое увеличение (63x или 100x). Добавить масло поверх крышки скольжения. Переориентируйтесь с новой целью, убедившись, что объектив контакта с маслом при фокусировке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только тонкую фокусировку при высоком увеличении (63x или 100x). Нефть должна использоваться только для достижения нефтяной цели. - Быстро оценить каждый слайд через глаз кусок в зеленый (eGFP/ Alexa-488) канал, чтобы определить, какие слайды FISH положительные и которые FISH отрицательный.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего, если эта первоначальная оценка / скоринг делается ослепленный отдельным человеком, чтобы уменьшить экспериментальные предубеждения. - Чтобы изображение окрашенных биопсий, начните с FISH положительный слайд и переключиться на компьютер режим визуализации. Выберите 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488), 555 (Alexa-555) каналов. Установите пинхол с помощью самого длинного канала длины волны, в данном случае 555. Найти правильную фокусную плоскость для визуализации помеченных бактерий в канале 488. Без изменения фокусной плоскости, установить усиление, лазерная мощность, и смещения для каждого канала так, что сигнал не насыщен, и фон не переисправлен. Приобретите изображение во всех трех каналах.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте те же настройки для канала 488 для изображения каждого слайда в эксперименте. Лазерная мощность может потребовать регулировки в 405 и 555 каналах, если оптимальная фокусная плоскость для бактериальной визуализации изменяется между полями. - Повторяйте на дополнительных полях до получения изображений всей эпителиальной поверхности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, вам придется немного изменить фокусную плоскость, чтобы визуализировать помеченные бактерии в различных областях, но никогда не изменяйте усиление, лазерную мощность или смещение для 488-го канала между полями. При работе над конфокальный микроскоп, это может быть информативным, чтобы захватить стек, так что трехмерная локализация бактерий в ткани могут быть проанализированы. - Обработка изображений и количественно помечены бактерий внутри или связанных с тканью с помощью ImageJ или аналогичного программного обеспечения. Рекомендуется минимальная обработка изображений (например, расщепление/слияние каналов и преобразование в файлы изображений), хотя при необходимости может быть выполнена коррекция фона. Все исправления или другие изменения должны оставаться последовательными между изображениями.
Representative Results
Протокол был оптимизирован для объективного обнаружения бактерий, связанных с слизистой оболочкой мочевого пузыря в парафин-встроенных секций биопсии мочевого пузыря. На рисунке 1 изображены репрезентативные конфокальные микрографы из эксперимента с использованием этого протокола на участках биопсии мочевого пузыря, полученных от женщин с рецидивирующей инфекцией мочевыводящих путей. Два серийных раздела были гибридизированы либо с универсальными 16S rRNA (верхние панели) или карабкаться (нижние панели) зондов. Изображения из той же области ткани были приняты и бактерии (зеленый) четко видны в ткани, гибридизированной с 16S rRNA зондов, а не с карабкаться зонда. Рисунок 2 представляет собой ложноположительный результат. Сигнал, соответствующий аутофлуоресцентному коллагену или эластину, обнаруживается в 405 и 488 каналах как в 16S rRNA, так и в секциях биопсии, связанных с зондом, подчеркивая важность всегда использования контроля скрембл-зонда.
| Зонд | Последовательности | Тм | Флюрофор | Связь |
| Универсальный 16S rRNA | 5'-GCTGCCTCCC Гастаггагт-3' |
54.9 | Алекса-488 (5' и 3') | ГСЗ Эстер |
| Схватка | 5'-АКТЧТАКГ GAGGCAGC-3' |
Na | Алекса-488 (5' и 3') | ГСЗ Эстер |
Таблица 1: Последовательности и характеристики зонда FISH. Тм указывает на температуру плавления и ГСЗ является аббревиацией для N-гидроксисуччинимид.
Рисунок 1: Представитель конфокальных микрографов FISH универсального 16S rRNA и карабкаться зонд в биопсии мочевого пузыря человека. Актин и Муцин помечены красным цветом, клеточные ядра помечены синим, а бактерии - зеленым. Ткань связанных бактерий обнаруживаются только с 16SrRNA зонд, а не схватка. Изображения, сделанные при 63x увеличении. Шкала бар 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Представитель конфокальных микрографов ложно-положительной зеленой аутуфлуоресценции в биопсии мочевого пузыря человека. Актин и муцин помечены красным цветом, клеточные ядра помечены синим цветом, а бактерии и аутофлуоресцентные компоненты внеклеточной матрицы (например, коллаген и эластин) зеленые. Зеленая флуоресценция наблюдается как с 16S rRNA и карабкаться зондов, указывающих на ложноположительный результат. Изображения принимаются при 63x увеличении. Шкала бар 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Здесь мы описываем протокол для обнаружения тканей связанных бактерий в биопсии мочевого пузыря человека 16S rRNA FlSH. Этот протокол может быть легко адаптирован для биопсии взяты из других тканей, таких как желудочно-кишечного тракта или кожи, и может быть распространен на ткани, собранные из различных организмов млекопитающих модели. Описанный здесь протокол также может быть адаптирован для использования нескольких фиксацийи (например, формалин, этанол, метакарн) и методов подготовки тканей (например, парафин или встроенная посевная, и криоконсервированные ткани). Двойной маркировкой универсальный зонд 16S rRNA позволяет объективное обнаружение всех бактериальных видов, присутствующих в ткани и может обеспечить ценную информацию о том, как патогенные микроорганизмы и микробиота пространственно взаимодействуют с слизистыми поверхностями при болезни и здоровой Государств. Используя такие ресурсы, как probeBase, PhylOPDb или инструмент PROBE-DESIGN программного пакета ARB для выбора или проектирования видов или родов, специфических 16S или 23S rRNA зондов, этот протокол может быть адаптирован для обнаружения конкретных видов бактерий или родов в пределах ткани15,21,22. Важным направлением для этого метода является мультиплексирование с использованием видов или родов конкретных зондов помечены различными, дискретные флюорофоры для оценки микробного разнообразия в слизистой оболочке мочевого пузыря.
Основным ограничением этого метода для использования на человеческих образцах является наличие биопсии ткани. Для получения биопсии требуется одобрение Институционального совета по обзору и информированное согласие пациента, и для оптимального сбора образцов и доступа к метаданным пациента необходимо прямое сотрудничество с врачом, выполняющим эту процедуру. Процедура CEFT сама разрушает эпителий мочевого пузыря, поэтому мы смогли оправдать биопсию этих областей перед процедурой. Дым капот или надлежащим образом оборудованы биобезопасности шкаф требуется для этого протокола из-за использования токсичных ксиленов в шаге депарафинизации и необходимость поддержания стерильной среды на протяжении всей процедуры. Флуоресцентный микроскоп, предпочтительно confocal, с 63x или 100x объективных и соответствующих наборов фильтров для визуализации Hoechst, Alexa-555, и Alexa-488 требуется для этого протокола. Репрезентативные результаты, изображенные на рисунке 1, были изображены с помощью лазерного сканирования конфокального микроскопа. Подобные лазерные сканирующие микроскопы должны создавать сопоставимые изображения. Этот протокол ограничен своей способностью обнаруживать только связанные с тканями бактерии, а не, например, грибы. Зонды конкретных грибковых 18S или 28S rRNA должны быть использованы для выявления грибковых патогенов в ткани18.
Критические шаги к этому протоколу включают поддержание стерильной среды на протяжении всей процедуры и обеспечение того, чтобы ткань не высохла между гибридизацией и этапами окрашивания. Если ткань высыхает во время процедуры, сигнал может быть смочен или ткань может упасть с горки во время стирки шага. Также важно всегда использовать два серийных раздела для этого протокола - один для зонда 16S rRNA и один для зонда скремблирования. Без этого контроля может быть очень трудно различить ложные срабатывания, а полученные данные могут быть бесполезными или информативными. Если этот протокол адаптируется для использования с зондом, кроме универсального зонда 16S rRNA, необходимо позаботиться о том, чтобы выбрать соответствующую температуру гибридизации, примерно на 5 градусов ниже прогнозируемой температуры плавления зонда. Для поддержания интенсивности сигнала, ткань не должна подвергаться воздействию света в течение длительных периодов времени после того, как зонд был добавлен и не должны быть переэкспонированы во время микроскопии. Наконец, во время микроскопии те же настройки для канала, соответствующие флюорофору, спряженному с зондом FISH, должны быть согласованы между экспериментальным (16S rRNA зонд) и контролем (скремб-зонд) слайдами. Визуализация пространственной связи бактерий в слизистых поверхностях тканей, полученных из пациента, имеет решающее значение для понимания и построения клинически значимых гипотез о взаимодействии хозяина-патогена, лежащих в основе инфекционных заболеваний.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Ким Орт и Марсела де Соуза Сантос за консультацию по протоколу и Аманда Аруте за техническую поддержку. Эта работа была частично поддержана Сесил Х. и Ида Грин кафедры системной биологии науки провел К.П.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa-555 Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Staining Actin |
| Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Invitrogen | W32464 | Staining Mucin |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-741-07 | Sterilization |
| Coplin Jar | Simport | M900-12W | Deparaffinization/washing |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | Microscopy |
| Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-224 | Rehydration |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311-500 | TE |
| Frosted Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-343 | |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen | H21492 | Staining Nucleus |
| Hydrophobic marker | Vector Laboratories | H-4000 | Hydrophobic barrier |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11 | |
| Oil Immersol 518 F | Fisher Scientific | 12-624-66A | Microscopy |
| Paraformaldehyde (16%) | Thermo Scientific | TJ274997 | Fixation |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Mounting medium |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | Hybridization buffer/PBS |
| Sodium Dodecyl Sulphate | Fisher Scientific | BP166-500 | Hybridization buffer |
| Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | PBS |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher Scientific | S369-500 | PBS |
| Syringe | VWR | 75486-756 | Sterilization |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP152-5 | TE/Hybridization buffer |
| Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL | Deparaffinization |
| 0.22 μm syringe filter | Fisher Scientific | 09-754-29 | Sterilization |
References
- Abraham, S. N., Miao, Y. The nature of immune responses to urinary tract infections. Nature Reviews Immunology. 15 (10), 655-663 (2015).
- Wolfe, A. J., et al. Evidence of uncultivated bacteria in the adult female bladder. Journal of Clinical Microbiology. 50 (4), 1376-1383 (2012).
- Grist, M., Chakraborty, J. Identification of a mucin layer in the urinary bladder. Urology. 44 (1), 26-33 (1994).
- Wu, X. R., Kong, X. P., Pellicer, A., Kreibich, G., Sun, T. T. Uroplakins in urothelial biology, function, and disease. Kidney International. 75 (11), 1153-1165 (2009).
- Ingersoll, M. A., Albert, M. L. From infection to immunotherapy: host immune responses to bacteria at the bladder mucosa. Mucosal Immunology. 6 (6), 1041-1053 (2013).
- Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options. Nature Reviews Microbiology. 13 (5), 269-284 (2015).
- Lewis, A. J., Richards, A. C., Mulvey, M. A. Invasion of Host Cells and Tissues by Uropathogenic Bacteria. Microbiology Spectrum. 4 (6), (2016).
- Horsley, H., et al. Enterococcus faecalis subverts and invades the host urothelium in patients with chronic urinary tract infection. PLoS One. 8 (12), (2013).
- Rosen, D. A., et al. Utilization of an intracellular bacterial community pathway in Klebsiella pneumoniae urinary tract infection and the effects of FimK on type 1 pilus expression. Infection and Immunity. 76 (7), 3337-3345 (2008).
- Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), e329 (2007).
- Hussain, S. A., Alhalabi, F., Zimmern, P. E. Long-term efficacy of fulguration of trigonitis for recurrent urinary tract infections in women. Urological Science. 26 (3), 197-201 (2015).
- De Nisco, N. J., et al. Direct Detection of Tissue-Resident Bacteria and Chronic Inflammation in the Bladder Wall of Postmenopausal Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Journal of Molecular Biology. , (2019).
- Amann, R. I., et al. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Applied and Environmental Microbiology. 56 (6), 1919-1925 (1990).
- Vaishnava, S., et al. The antibacterial lectin RegIIIgamma promotes the spatial segregation of microbiota and host in the intestine. Science. 334 (6053), 255-258 (2011).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44 (D1), D586-D589 (2016).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14170-14175 (2006).
- Frickmann, H., Lakner, A., Essig, A., Poppert, S. Rapid identification of yeast by fluorescence in situ hybridisation from broth and blood cultures. Mycoses. 55 (6), 521-531 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
- Sun, Y., et al. Sudan black B reduces autofluorescence in murine renal tissue. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 135 (10), 1335-1342 (2011).
- Ludwig, W., et al. ARB: a software environment for sequence data. Nucleic Acids Research. 32 (4), 1363-1371 (2004).
- Jaziri, F., et al. PhylOPDb: a 16S rRNA oligonucleotide probe database for prokaryotic identification. Database (Oxford). , (2014).
