Denne protokollen er for upartisk påvisning av vev-assosiert bakterier i pasient biopsier ved 16S rRNA in situ hybridisering og konfokalmikroskopi mikroskopi.
Visualisering av samspillet av bakterier med verten slimhinne overflater og vev kan gi verdifull innsikt i mekanismer for patogenesen. Mens visualisering av bakterielle patogener i dyremodeller av smitte kan stole på bakteriestammer konstruert for å uttrykke fluorescerende proteiner som GFP, visualisering av bakterier i slimhinnen i biopsier eller vev innhentet fra menneskelige pasienter krever en upartisk metode. Her beskriver vi en effektiv metode for påvisning av vev-assosiert bakterier i menneskelige biopsi seksjoner. Denne metoden benytter fluorescerende in situ hybridisering (FISH) med en fluorescensmerkete merket universell oligonukleotid sonde for 16S rRNA å merke vev-tilknyttede bakterier innen blære biopsi seksjoner ervervet fra pasienter som lider av tilbakevendende Urinveisinfeksjon. Gjennom bruk av en universell 16S rRNA sonde, kan bakterier oppdages uten tidligere kjennskap til arter, slekter, eller biokjemiske egenskaper, for eksempel lipopolysakkarid (LPS), som ville være nødvendig for påvisning av immunofluorescence eksperimenter. Vi beskriver en komplett protokoll for 16S rRNA FISH fra biopsi fiksering til avbildning av konfokalmikroskopi mikroskopi. Denne protokollen kan tilpasses for bruk i nesten alle typer vev og representerer et kraftig verktøy for objektiv visualisering av klinisk relevante bakteriell-Host interaksjoner i pasientens vev. Videre, ved hjelp av arter eller slekter-spesifikke sonder, denne protokollen kan tilpasses for påvisning av bestemte bakterielle patogener i pasientens vev.
Urinveiene, bestående av urinrøret, blære, urinlederne og nyrer er stadig eksponert for bakterier som utgjør urin mikrobiomet samt invaderende uropathogens, som uropathogenic E. coli (UPEC), fra mage-tarmkanalen 1,2. Et lag av hydrert mucus bestående av glykosaminoglykaner og en ugjennomtrengelig plakett av glykosylert uroplakin proteiner uttrykt på overflaten av overfladiske celler danner en barriere som rutinemessig beskytter blæren epitel fra invasjon av tilhenger bakterier3,4. Under urinveisinfeksjon (UTI), er disse barrierene forstyrret eller ødelagt, tilrettelegge vedlegg til og invasjon av blæren epitel av uropathogenic bakterier5,6. Arbeid i murine modeller har avdekket at mange uropathogenic bakterier, inkludert UPEC, klebsiella pneumoniae, og Enterococcus faecalis kan danne replicative intracellulære samfunn (IBC) innenfor cytoplasma av overfladiske celler og Quiescent intracellulære reservoarer (QIRs) innen overgangsordning epitelceller7,8,9. Selv om UPEC har blitt identifisert i skur epitelceller fra menneskelige UTI pasienter, samspillet av uropathogens med blæren mucosa hos mennesker hadde ikke vært tidligere visualisere10.
Vi tilpasset en felles teknikk, fluorescens in situ hybridisering (FISH), for å oppdage bakterier innenfor slimhinnen i blæren biopsier innhentet fra postmenopausale pasienter som gjennomgår cystoskopi med electrofulguration av trigonitis (CEFT) for den avanserte forvaltning av antibiotika-ildfaste tilbakevendende UTI11. Ved hjelp av en universell sonde for 16S rRNA, var vi i stand til å objektivt oppdage bakterielle arter knyttet til blæren mucosa av tilbakevendende UTI pasienter og bestemme deres posisjon i blæren veggen12. Den universelle 16S rRNA nukleotid sonden ble tidligere utviklet for å målrette en bevart region av bakteriell 16S rRNA13, som tilsvarer posisjoner 388-355 av E. coli 16S rRNA. Den 16S rRNA og scramble sonde sekvenser har tidligere blitt validert og publisert for bruk i musen mage-tarmkanalen14,15. Sekvensene og egenskapene til sonder er beskrevet i tabell 1. Det er viktig å bruke to sekvensielle seksjoner i denne protokollen, en for 16S rRNA sonde og en for scramble sonde, for å kunne skille mellom sann og bakgrunn signal som blæren epitel, kollagen og elastin utstillingen autofluorescence16 . I denne protokollen, 16S rRNA og scramble sonder ble utformet med fluorescerende Alexa fluor 488 etiketter på både 3 og 5 ‘ Termini via N-hydroxysuccinimide (NHS) Ester sammenhengene for å øke fluorescerende signal.
Selv om denne protokollen ble utviklet for bruk på menneske blære biopsi seksjoner, det kan lett bli tilpasset for bruk på parafin-embedded seksjoner fra alle vev der bakterier antas å ligge. I motsetning til immunhistokjemi eksperimenter som mål bestemte antigener (f. eks lipopolysakkarid) på bakteriell overflate, denne metoden krever ingen forkunnskaper i antigener uttrykt av vevet-assosiert bakterier10,17 . Bruk av den universelle 16S rRNA sonden gjør det upartiske påvisning av alle bakterielle arter i utvalget, men tillater ikke fastsettelse av sin identitet. For å bestemme identifisering av oppdagede bakterier, arter eller slekten-spesifikke 16S eller 23S rRNA sonder må brukes. Denne protokollen vil heller ikke oppdage fungal patogener, som Candida albicans, assosiert med verts vev. For påvisning av sopp patogener, må 28S eller 18S rRNA-sonder brukes18.
Her beskriver vi en protokoll for påvisning av vev-assosiert bakterier i menneskelig blære biopsier av 16S rRNA FlSH. Denne protokollen kan enkelt tilpasses for biopsier tatt fra andre vev, slik som mage-tarmkanalen eller hud, og kan utvides til vev høstes fra en rekke pattedyr modell organismer. Protokollen beskrevet her kan også tilpasses for bruk av flere fiksering (f. eks, formalin, etanol, methacarn) og vev forberedelse teknikker (f. eks, parafin eller harpiks innebygd, og embryo vev). Den doble-merket universell 16S rRNA sonde gjør det mulig for upartisk påvisning av alle bakterielle arter til stede innenfor vev og kan gi verdifull innsikt i hvordan patogener og bakterieflora romlig samhandle med slimhinne flater i sykdom og sunn Stater. Ved hjelp av ressurser som probeBase, PhylOPDb eller PROBE_DESIGN-verktøyet i ARB programvarepakke for valg eller design av arter eller slekter-spesifikke 16S-eller 23S rRNA-sonder, kan denne protokollen tilpasses for påvisning av bestemte bakterielle arter eller slekter innenfor vev15,21,22. En viktig fremtidig retning for denne metoden er multipleksing ved hjelp av arter-eller slekter-spesifikke sonder merket med ulike, diskrete fluorophores for evaluering av mikrobiell mangfold i blæren mucosa.
Den primære begrensningen av denne metoden for bruk på menneskelige eksemplarer er tilgjengeligheten av biopsied vev. Institusjonelle gjennomgang Board godkjenning og informert pasientens samtykke er pålagt å innhente biopsier og direkte samarbeid med legen utføre prosedyren er nødvendig for optimal prøvetaking samling og tilgang til pasientens metadata. Den CEFT prosedyren selv ødelegger blæren epitel så vi var i stand til å rettferdiggjøre biopsi av disse områdene før inngrepet. En avtrekksvifte eller passende montert biosafety kabinett er nødvendig for denne protokollen på grunn av bruk av giftige xylenes i deparaffinization trinn og behovet for å opprettholde et sterilt miljø gjennom hele prosedyren. Et fluorescerende mikroskop, fortrinnsvis konfokalmikroskopi, med en 63x eller en 100-målsetting og passende filter sett for visualisering av Hoechst, Alexa-555, og Alexa-488 er nødvendig for denne protokollen. Representative resultater avbildet i figur 1 ble avbildet ved hjelp av en laserskanning konfokalmikroskopi mikroskop. Lignende laserskanning mikroskop bør produsere sammenlignbare bilder. Denne protokollen er begrenset av dens evne til å bare oppdage vev-tilknyttede bakterier og ikke, for eksempel, sopp. Sonder spesifikke sopp 18S eller 28S rRNA må brukes til å identifisere fungal patogener innen vev18.
Kritiske skritt til denne protokollen inkluderer opprettholde et sterilt miljø gjennom hele prosedyren og sikre at vevet ikke tørker ut mellom hybridisering og flekker trinn. Hvis vevet tørker ut under prosedyren, kan signalet være fuktet eller vevet kan falle ut av raset under en vask trinn. Det er også viktig å alltid bruke to serielle seksjoner for denne protokollen-en for 16S rRNA sonde og en for scramble sonde. Uten denne kontrollen, kan det være svært vanskelig å skille falske positiver og data innhentet kan ikke være nyttig eller informativ. Hvis denne protokollen blir tilpasset for bruk med en annen sonde enn den universelle 16S rRNA-proben, må det utvises forsiktighet for å velge en passende hybridisering temperatur, ca. 5 ° c lavere enn den antatte Smeltetemperaturen til proben. For å opprettholde signal intensiteten må ikke vevet utsettes for lys over lengre tid etter at proben er tilsatt og må ikke overeksponert under mikroskopi. Til slutt, under mikroskopi de samme innstillingene for kanalen tilsvarer fluoroforen bøyd til FISH sonden må holdes konsistent mellom den eksperimentelle (16S rRNA sonde) og kontroll (scramble probe) lysbilder. Visualisere romlige forholdet mellom bakterier innenfor slimhinne overflater av pasient-avledet vev er avgjørende for å forstå og bygge klinisk relevante hypoteser om verten-patogen interaksjoner underliggende smittsomme sykdommer.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Kim orth og Marcela de Souza Santos for protokollen råd og Amanda Arute for teknisk støtte. Dette arbeidet ble delvis støttet av Cecil H. og Ida Green Chair i Systems Biology Science holdt av K.P.
Alexa-555 Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Staining Actin |
Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Invitrogen | W32464 | Staining Mucin |
Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-741-07 | Sterilization |
Coplin Jar | Simport | M900-12W | Deparaffinization/washing |
Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | Microscopy |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-224 | Rehydration |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311-500 | TE |
Frosted Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-343 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen | H21492 | Staining Nucleus |
Hydrophobic marker | Vector Laboratories | H-4000 | Hydrophobic barrier |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11 | |
Oil Immersol 518 F | Fisher Scientific | 12-624-66A | Microscopy |
Paraformaldehyde (16%) | Thermo Scientific | TJ274997 | Fixation |
ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Mounting medium |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | Hybridization buffer/PBS |
Sodium Dodecyl Sulphate | Fisher Scientific | BP166-500 | Hybridization buffer |
Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | PBS |
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher Scientific | S369-500 | PBS |
Syringe | VWR | 75486-756 | Sterilization |
Tris-HCl | Fisher Scientific | BP152-5 | TE/Hybridization buffer |
Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL | Deparaffinization |
0.22 micron syringe filter | Fisher Scientific | 09-754-29 | Sterilization |