Detta protokoll är för opartisk detektion av vävnads-associerade bakterier i patientbiopsier av 16S rRNA in situ hybridisering och konfokal mikroskopi.
Visualisering av samspelet mellan bakterier med värd slemhinnor ytor och vävnader kan ge värdefull insikt i mekanismerna för patogenes. Medan visualisering av bakteriella patogener i djurmodeller av infektion kan förlita sig på bakteriestammar konstruerade för att uttrycka fluorescerande proteiner som GFP, visualisering av bakterier i slemhinnan i biopsier eller vävnad som erhållits från mänskliga patienter kräver en opartisk metod. Här beskriver vi en effektiv metod för detektion av vävnads-associerade bakterier i human biopsi sektioner. Denna metod utnyttjar fluorescerande in situ hybridisering (fisk) med en fluorescerande märkt Universal oligonukleotide sond för 16s rRNA till etikett vävnads-associerade bakterier inom urinblåsan biopsi sektioner förvärvade från patienter som lider av återkommande urinvägsinfektion. Genom användning av en universell 16S rRNA sond, bakterier kan upptäckas utan tidigare kunskap om arter, släkten, eller biokemiska egenskaper, såsom lipopolysackarid (LPS), som skulle krävas för detektion genom immunofluorescensexperiment. Vi beskriver ett komplett protokoll för 16S rRNA fisk från biopsi fixering till avbildning av konfokalmikroskopi. Detta protokoll kan anpassas för användning i nästan alla typer av vävnad och utgör ett kraftfullt verktyg för opartisk visualisering av kliniskt relevanta bakteriella-värd interaktioner i patientens vävnad. Med hjälp av arter eller släkspecifika sonder kan detta protokoll dessutom anpassas för detektion av specifika bakteriella patogener inom patient vävnad.
Urinvägarna, bestående av urinröret, urinblåsan, urinvägarna och njurarna utsätts ständigt för bakterier som utgör urinvägarna mikrobiomet samt invaderande uropatogener, som uropatogena E. coli (upec), från mag-tarmkanalen 1,2. Ett skikt av hydrerat slem bestående av glykosaminoglykaner och en ogenomtränglig plack av glykosylerat uroplakin proteiner uttrycks på ytan av de ytliga cellerna bildar en barriär som rutinmässigt skyddar blåsan epitel från invasion av anhängare bakterier3,4. Under urinvägsinfektion (uti), dessa hinder störs eller förstörs, underlätta fastsättning till och invasion av urinblåsan epitel av uropatogena bakterier5,6. Arbete i murina modeller har visat att många uropatogena bakterier inklusive UPEC, Klebsiella pneumoniae, och Enterococcus faecalis kan bilda replikativa intracellulära samhällen (IBCs) inom cytoplasman i ytliga celler och quiescent intracellulära reservoarer (qirs) inom övergångs epitelceller7,8,9. Även om UPEC har identifierats inom Shed epitelceller från Human UTI patienter, interaktionen mellan uropatogener med urinblåsan slemhinnan hos människor hade inte tidigare visualiserats10.
Vi anpassade en gemensam teknik, fluorescens i situ hybridisering (fisk), att upptäcka bakterier i slemhinnan i urinblåsan biopsier erhållits från postmenopausala patienter som genomgår cystoskopi med elektrofulguration av uretrit (Ceft) för den avancerade hantering av återkommande antibiotika refraktära UTI11. Med hjälp av en universell sond för 16S rRNA, vi kunde objektivt upptäcka bakteriearter i samband med urinblåsan slemhinnan av återkommande UVI patienter och bestämma deras position inom urinblåsan väggen12. Universal 16s rRNA nukleotid PROBE har tidigare utformats för att rikta en bevarad region av bakterien 16s rRNA13, vilket motsvarar positionerna 388-355 i E. coli 16s rRNA. 16s rRNA och rusning sond sekvenser har tidigare validerats och publicerats för användning i mus mag-tarmkanalen14,15. Avsonens sekvenser och egenskaper beskrivs i tabell 1. Det är viktigt att använda två sekventiella avsnitt i detta protokoll, en för 16s rRNA sonden och en för rusning sonden, för att kunna skilja mellan sann och bakgrunds signal som urinblåsan epitel, kollagen och elastin uppvisar autofluorescence16 . I detta protokoll, 16s rRNA och rusning sonder utformades med fluorescerande Alexa fluor 488 etiketter på både 3 ‘ och 5 ‘ Termini via N-hydroxysuccinimide (NHS) Ester kopplingar för att öka fluorescerande signal.
Även om detta protokoll har utvecklats för användning på human urinblåsan biopsi sektioner, det kan lätt anpassas för användning på paraffin-inbäddade sektioner från någon vävnad där bakterier tros vistas. Till skillnad från immunohistokemiska experiment som riktar sig mot specifika antigener (t. ex. lipopolysackarid) på bakteriens yta, kräver denna metod inga förkunskaper om antigener som uttrycks av de vävnadsassocierade bakterierna10,17 . Användning av Universal 16S rRNA sond möjliggör opartisk detektion av alla bakteriearter i provet men tillåter inte bestämning av deras identitet. För att bestämma identifiera identifierade bakterier, arter eller släkte-specifika 16S eller 23S rRNA sonder måste användas. Detta protokoll kommer inte heller att upptäcka svamp patogener, såsom Candida albicans, i samband med värd vävnad. För detektion av svamppatogener, 28S eller 18S rRNA sonder måste användas18.
Här beskriver vi ett protokoll för detektion av vävnads-associerade bakterier i human urinblåsan biopsier av 16S rRNA FlSH. Detta protokoll kan lätt anpassas för biopsier tagna från andra vävnader, såsom mag-tarmkanalen eller huden, och kan utvidgas till vävnader som skördats från en mängd olika däggdjurs modell organismer. Det protokoll som beskrivs här kan också anpassas till användningen av multipla fixeringsmedel (t. ex. Formalin, etanol, methacarn) och vävnads beredningstekniker (t. ex. paraffin eller harts inbäddade och kryopreserverade vävnader). Den dubbel-märkt Universal 16S rRNA sond möjliggör opartisk detektion av alla bakteriearter som finns inom vävnad och kan ge värdefull insikt i hur patogener och bakterieflora rumsligt interagerar med slemhinnor ytor i sjukdom och friska Stater. Med hjälp av resurser som probeBase, PhylOPDb eller PROBE_DESIGN verktyget för ARB programpaket för urval eller utformning av arter eller släkten-specifika 16S eller 23S rRNA sonder, detta protokoll kan anpassas för detektion av specifika bakteriearter eller släkten inom vävnaden15,21,22. En viktig framtida riktning för denna metod är multiplexering med hjälp av art-eller släkspecifika sonder märkta med olika, diskreta fluoroforer för utvärdering av mikrobiell mångfald i urinblåsan slemhinnan.
Den primära begränsningen av denna metod för användning på mänskliga exemplar är tillgången på biopsier vävnad. Institutionellt granskningsnämnd godkännande och informerat samtycke från patienten krävs för att erhålla biopsier och direkt samarbete med den kliniker som utför ingreppet är nödvändigt för optimal provinsamling och tillgång till patientens metadata. CEFT-förfarandet i sig förstör blåsan epitel så vi kunde motivera biopsi av dessa områden innan förfarandet. En draghuv eller ett lämpligt monterat biosäkerhetsskåp krävs för detta protokoll på grund av användning av giftiga xylener i avparaffinering steg och behovet av att upprätthålla en steril miljö under hela förfarandet. Ett fluorescerande Mikroskop, helst konfokala, med en 63x eller en 100x mål och lämpliga filteruppsättningar för visualisering av Hoechst, Alexa-555, och Alexa-488 krävs för detta protokoll. De representativa resultat som skildras i figur 1 avbildades med hjälp av ett konfokalmikroskop med laserskanning. Liknande laserscanning Mikroskop bör producera jämförbara bilder. Detta protokoll begränsas av dess förmåga att endast upptäcka vävnads-associerade bakterier och inte, till exempel, svampar. Sonder specifika svampen 18S eller 28S rRNA måste användas för att identifiera svamppatogener inom vävnad18.
Kritiska steg till detta protokoll inkluderar att upprätthålla en steril miljö under hela förfarandet och se till att vävnaden inte torkar ut mellan hybridisering och färgning steg. Om vävnaden torkar ut under ingreppet, kan signalen dämpas eller vävnaden kan falla av i bilden under ett tvättsteg. Det är också viktigt att alltid använda två seriella sektioner för detta protokoll-en för 16s rRNA sond och en för rusning sonden. Utan denna kontroll kan det vara mycket svårt att urskilja falska positiva identifieringar och de data som erhålls kanske inte är användbara eller informativa. Om detta protokoll anpassas för användning med en annan sond än den universella 16S rRNA-sonden, måste försiktighet iakttas för att välja en lämplig hybridiseringstemperatur, cirka 5 ° c lägre än sondens beräknade smälttemperatur. För att bibehålla signalintensiteten får vävnaden inte utsättas för ljus under långa tidsperioder efter det att sonden har tillsatts och får inte överexponeras under mikroskopi. Slutligen, under mikroskopi samma inställningar för den kanal som motsvarar fluorophore konjugerat till fisk sonden måste hållas konsekvent mellan den experimentella (16S rRNA sond) och kontroll (Scramble sond) diabilder. Visualisera den rumsliga relationen mellan bakterier inom slemhinnor ytor av patient-härledda vävnader är avgörande för att förstå och bygga kliniskt relevanta hypoteser om värd-patogenen interaktioner underliggande infektionssjukdom.
The authors have nothing to disclose.
Vi skulle vilja tacka Kim Orth och Marcela de Souza Santos för protokoll råd och Amanda Arute för teknisk support. Detta arbete stöddes delvis av Cecil H. och Ida Green Chair i systembiologi Science som innehas av K.P.
Alexa-555 Phalloidin | Invitrogen | A34055 | Staining Actin |
Alexa-555 Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Invitrogen | W32464 | Staining Mucin |
Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-741-07 | Sterilization |
Coplin Jar | Simport | M900-12W | Deparaffinization/washing |
Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | Microscopy |
Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-224 | Rehydration |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311-500 | TE |
Frosted Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-550-343 | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen | H21492 | Staining Nucleus |
Hydrophobic marker | Vector Laboratories | H-4000 | Hydrophobic barrier |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11 | |
Oil Immersol 518 F | Fisher Scientific | 12-624-66A | Microscopy |
Paraformaldehyde (16%) | Thermo Scientific | TJ274997 | Fixation |
ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P36934 | Mounting medium |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | Hybridization buffer/PBS |
Sodium Dodecyl Sulphate | Fisher Scientific | BP166-500 | Hybridization buffer |
Sodium Phosphate Dibasic Hepahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | PBS |
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate | Fisher Scientific | S369-500 | PBS |
Syringe | VWR | 75486-756 | Sterilization |
Tris-HCl | Fisher Scientific | BP152-5 | TE/Hybridization buffer |
Xylene | Fisher Chemical | X3P-1GAL | Deparaffinization |
0.22 micron syringe filter | Fisher Scientific | 09-754-29 | Sterilization |