Summary
Här beskriver vi en robust metod för att bestämma immuncellsidentitet och renhet genom epigenetiska signaturer som upptäcks med kvantitativ PCR (qPCR). DNA-demethylation vid en viss locus fungerar som en unik identifierare för en viss celltyp och möjliggör identifiering av CD8+, reglerande eller Th17 T-celler.
Abstract
Immuncell subtyp populationer kan ha en stor effekt på effekten av T cellterapier. Nuvarande metoder, som flödecytometri, har specifika provkrav, hög provingång, är låg genomströmning, och är svåra att standardisera, som alla är skadliga för karakterisering av cellterapi produkter under sin utveckling och Tillverkning.
De analyser som beskrivs häri korrekt identifiera och kvantifiera immuncelltyper i en heterogen blandning av celler med hjälp av isolerade genomiska DNA (gDNA). DNA-metyleringsmönster avslöjas genom bisulfitomvandling, en process där unmetylerade cytosiner omvandlas till uraciler. Unmethylated DNA-regioner upptäcks genom qPCR förstärkning med grundfärger inriktning konverterade områden. En unik locus per analys mäts och fungerar som en korrekt identifierare för en viss celltyp. Analyserna är robusta och identifierar CD8+, reglerande och Th17 T-celler på ett högt genomströmningssätt. Dessa optimerade analyser kan potentiellt användas för process- och produktfrisättningstestning för cellterapiprocess.
Introduction
Användningen av T-celler i cellulär immunterapi har ökat betydligt under det senaste decenniet, särskilt med tillkomsten av chimeric antigenreceptor (CAR) T cellteknik1. Medan T cell-baserade terapier har mötts med stor klinisk framgång, de är heterogena och cell egenskaper och identiteter kan variera avsevärt mellan givare2. Heterogeniteten hos T-cellspopulationer kan ha stora effekter på terapeutisk effekt och komplicera slutsatserna från kliniska prövningar. Av denna anledning är det viktigt att förstå T-cellheterogenitet under produkttillverkning och formulering för att bestämma de optimala formuleringarna av T-cells immunterapier.
I vid bemärkelse kan T-celler delas in i två grupper: CD4+ helper T-celler, som utsöndrar immunmodulerande cytokiner och CD8+ cytototoxiska T-celler, som direkt lysceller presenterar cognate antigen på stora histokompatibilitet komplex (MHC) I molekyler. CD4 + helper T-celler kan skilja sig åt en myriad av specifika undergrupper som producerar en unik uppsättning cytokiner. Vissa föreslår att ett definierat förhållande mellan CD4 + till CD8 + T-celler i slutcellprodukten maximera in vivo effekt och uthållighet, men kan komplicera celltillverkning3. Reglerande T-celler (Tregs), en delmängd av CD4 + T-celler, är immunsuppressiva och minska aktiveringen av immunceller. Reglerande T-celler har varit inblandade i medla tumörtolerans och, om det finns under CAR T cell tillverkning, kan hämma antitumor immunsvar av CAR T-celler4,5,6. Andra CD4 + delmängder såsom T helper 17 (Th17) T-celler främja tumör clearance och kan utnyttjas för att öka effekten av T-cellsterapier. Således ökar Th17 CD4 + T celler är av särskilt intresse i solid akulerade tumör inställningar där ökad produktion av interleukin 17 (IL-17) främjar antitumor immunsvar5,7,8,9. Förstå vikten av Th17 celler i tumör svar har föranlett mer utredning av strategier för att generera dessa celler in vitro7,9. Därför är metoder för att upptäcka dessa T-cellunderuppsättningar avgörande för att optimera T-cellterapier och bör vara robusta, enkla, skalbara och reproducerbara.
Flödecytometri är den vanligaste metoden för att bestämma identiteten på en immuncell. Flödescytometri kräver dock levande, intakta celler som måste analyseras samma dag som de skördas. För intracellulära cytokinfärgning (ICS) krävs proteinutsöndringenför att behålla cytokiner i T-cellerna. Emellertid, olika hämmare föreningar har differentiella effekter på utsöndringen av specifika cytokiner, tvingar användare att skapa specialiserade cocktails för detektion av cytokin av intresse10,11. Dessutom är trohet flödet cytometri beroende av antikroppar kloner som binder specifikt och potent till sitt mål. Användningen av olika antikroppskloner kan orsaka varierande resultat och leda till oprecisa slutsatser, vilket gör metoden svår att standardisera12. Vidare kan analys av data som samlas in via flödecytometri, och därmed slutsatser från uppgifterna, variera kraftigt mellan användare baserat på hur grindar na ärinställda 13,14. Av dessa skäl är flödet cytometri inte idealisk för exakt kvalitetskontroll under cellterapi utveckling.
Bedömningen av genomisk metylering vid specifika genloki är en alternativ metod för att bestämma cellidentitet. Motiven för användning av DNA-metylering för att identifiera specifika celltyper har beskrivits i flera artiklar och bygger på specifika metyleringsmönster som finns i en viss cellpopulation15,16,17. I målceller innehåller vissa platser unmetylerade nukleotider, medan dessa platser i icke-målceller metyleras. Detta mönster kan detekteras genom bisulfitkonvertering, en process som uteslutande omvandlar unmethylated cytosin nukleotider (C) till uracil (U). Primers och sonder kan utformas mot de konverterade platserna, sedan förstärkas och upptäckas genom qPCR16.
Analysen som beskrivs häri mäter frekvensen av immuncellsubtyper inom heterogena populationer genom att kvantifiera antalet specifika unmethylated loci jämfört med en hushållning gen. Kopior av de unmethylated reglerande beståndsdelarna för CD8 B genen mäts i CD8-analysen, FoxP3 i Treg, och IL-17 i Th17 i denna analys. Dessa loki identifierades genom att isolera den specifika cellpopulationen av intresse (t.ex. CD8+ T-celler) och utför bisulfitsekvensering för att identifiera loki som är unmethylated i endast den celltyp15. Primers och sonder utvecklas mot unikt unmethylated loci och prover analyseras via qPCR. En standardkurva med kända kopieringsnummer skapas från utspädningar av en hög kopieringsnummerstandardplasmid, vilket möjliggör konvertering av ett Ct-värde till ett avskriftsnummer.
För att utvärdera analysens prestanda krävs kontrollprover, inklusive en referensgDNA och en kalibratorplasmid. Referensgenomikmaterialet är ett poolat blodprov från flera givare med kända immuncellfrekvenser och används för en kvalitetskontroll (QC) analys prestandakontroll. Kalibratorprovet är en syntetiserad plasmid som innehåller CD8-, FoxP3- och GAPDH-gensekvenserna i ett equimolar-förhållande. Det används som ett mått på bisulfitomvandlingseffektiviteten, eftersom bisulfitomvandlingar inom olika genomiska regioner kommer att variera i effektivitet. Förhållandet mellan målet och GAPDH inom kalibratorn är 1, men på grund av skillnader i bisulfitomvandlingseffektiviteten kan förhållandet variera. Denna kalibreringsfaktor tillämpas på CD8- och Treg-analyserna. FoxP3, genen som används i Treg analysen, ligger på X-kromosomen. Eftersom denna analys åtgärder endast unmetylerade kopior av FoxP3, och endast en kopia av FoxP3 är unmethylated i Tregs, denna analys är kön agnostiker och kan användas med både manliga och kvinnliga prover18. Th17-analysen använder inte ett kalibratorprov eller GAPDH som hushållningsgen. I stället inkluderas en annan primer-uppsättning som riktar sig mot metylerade lokier som finns i icke-Th17-celler och det totala antalet celler återspeglas av summan av de metylerade och unmetylerade kopiorna av IL-17. De data som erhållits från qPCR ingår i en förinställd analysmall som utför kvalitetskontrollkontroller på data och beräknar procentandelen av målcellen i startpopulationen. Detta ger automatiserad och opartisk dataanalys, vilket tar bort användarens subjektivitet och förbättrar standardiseringsfunktionerna.
Denna analys använder gDNA, som kan isoleras av en leukaferes förfarande med odlade eller fasta celler, eller frysta cellpellets. Det låga provkravet, flexibilitet i provutgångsmaterial, hög noggrannhet och standardiserad analys tar itu med de begränsningar som är förknippade med flödescytometri och är idealiska för kvalitetskontroll under utveckling av cellterapiprocessen.
Protocol
Alla mänskliga prover erhölls från en kommersiell källa enligt deras riktlinjer för humanforskningsetik.
1. Genomisk DNA-isolering
OBS: Genomisk DNA-isolering utförs med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit (se Materialtabell)från alla hematopoietiska celler, såsom perifera blodmononukleära celler (PBMC), renade T-celler eller någon annan hematopoietisk celltyp. I detta experiment användes perifera blodmononukleära celler (PBMC) och T-celler från tre olika mänskliga donatorer.
- Placera 1-2 x 106 hematopoietiska celler i ett koniskt rör och centrifugera vid 400 x g i 10 min.
- Aspirera supernatanthelt.
- Tillsätt 350 μl lys/bindningsbuffert till provet och inkubera i 10 min vid 55 °C.
- Tillsätt 50 μl proteinas K (20 mg/ml) till 350 μl cellsuspension och virvel i 30 s.
- Tillsätt 50 μl DNA-bindande paramagnetiska pärlor och 400 μl 100% isopropanol och inkubera i 3 min vid rumstemperatur (RT).
- Placera röret på ett magnetiskt rack i 2 min och ta bort supernatant, var noga med att inte störa pärlorna. DNA:t är bundet till de magnetiska pärlorna i detta steg.
- Tillsätt 950 μl tvättbuffert 1. Virvel för 30 s och upprepa steg 1,6.
- Upprepa steg 1.7.
- Tillsätt 950 μl tvättbuffert 2. Virvel för 30 s och upprepa steg 1,6.
- Tillsätt 100 μl elutionbuffert och virvel i 2 min. Placera röret på ett magnetiskt stativ i 1 min och överför supernatanten som innehåller gDNA till ett nytt rör.
- Använd 1 μL av gDNA som isolerats från hematopoietiska cellerna för att mäta renhet gDNA genom spektrophotometri med hjälp av en fluorimeter genom att erhålla OD vid 260 nm, 280 nm och 230 nm. Se till att förhållandet mellan optisk densitet (OD-förhållande) vid 260 och 280 nm är mellan 1,7-2,0 och OD-förhållandet vid 260 och 230 nm är mellan 1,5-2,4.
2. Provberedning
- Värm en termomixer till 56 °C.
- Etikett 2 mL rör för alla prover, kalibrator och referensmaterial.
- Späd proverna och kalibratorn med elutionbufferten (finns med satsen som används för steg 1) på RT.
- För alla provförsök, späd gDNA till en total volym på 142 μL. Späd till exempel 4 μL gDNA vid 100 ng/μL i 138 μL elutionbuffert.
OBS: 400-1.200 ng gDNA kan användas för analysen. - Späd 75 μL av kalibratorn till en total volym på 142 μL.
- Kontrollera referensgDNA-koncentrationen med en spektrofotometer med TE (pH = 8.0) som ett ämne.
- Späd 1 000-1 200 ng referensgDNA till en total volym på 142 μL. Späd till exempel 10 μL referensgDNA vid 100 ng/μL i 132 μL elutionbuffert.
- För alla provförsök, späd gDNA till en total volym på 142 μL. Späd till exempel 4 μL gDNA vid 100 ng/μL i 138 μL elutionbuffert.
- Inkubera rören vid 56 °C i 5 min vid 900 rpm i en termomixer. Snurra kort ner rören för att samla proverna.
3. Bisulfitkonvertering
OBS: Se till att inkubationstiderna under bisulfitkonverteringen följer de rekommenderade tiderna. Överinkubations- eller underinkubationseffekt kommer att påverka analysresultaten.
- Ställ in en termomixer till 80 °C.
- Tillsätt 270 μl ammoniumbisulfit och 90 μl tetrahydrofurfurylalkohol (THFA) till alla rör. Vortex att blanda helt och kort snurra ner proverna för att samla vätskan längst ner.
- Inkubera rören i en termomixer vid 80 °C i 45 min vid 900 rpm. Om du använder ett värmeblock, virvla rören för 1-2 s var 4,5 min under inkubation.
- Snurra kort ner proverna och låt svalna till RT i 3-5 min innan du fortsätter med steg 4 eller 5. Den slutliga volymen bör vara ~500 μL.
4. CD8 och Treg analyser
- DNA-rening efter bisulfitkonvertering
OBS: Detta steg utförs med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt DNA-reningssats (se Materialtabell)på bisulfitkonverterat DNA. Se till att reagenser värms upp till RT före användning.- Innan reningen påbörjas, skapa en homogen blandning av DNA-isolering paramagnetiska pärlor genom virvlande för 30 s. Tillsätt etanol och isopropanol till tvättbuffertarna, efter de volymer som anges på flaskorna, och ställ in ett värmeblock till 65 °C.
- På RT, tillsätt 870 μl lys/bindningsbuffert och 105 μL DNA-bindande paramagnetiska pärlor till varje rör från steg 3.4. Vortex att blanda helt och kort snurra ner rören.
- Tillsätt 570 μl 2-propanol och virvel för att blanda helt.
- Inkubera rören på RT i 7 min vid 50 rpm i en termomixer eller en vanlig roterande mixer.
- Snurra kort ner rören. Placera rören på magnetstället och inkubera i 5 min.
- Med proverna fortfarande på den magnetiska rack, ta bort supernatant utan att störa pärlorna.
OBS: DNA är bundet till pärlorna. - Ta bort rören från det magnetiska gallret och tillsätt 900 μl tvättbuffert 1. Vortex rören att helt avbryta pärlorna och sedan kort snurra ner rören.
- Sätt tillbaka rören till magnetstället och inkubera i 3 min.
- Med proverna fortfarande på den magnetiska rack, ta bort supernatant utan att störa pärlorna.
- Upprepa tvättar (4.1.7-4.1.9), en gång med tvättbuffert 1, sedan två gånger med tvättbuffert 2.
- Efter att ha tagit bort supernatant, snurra kort ner rören och återgå till det magnetiska racket i 3 min.
- Ta bort all kvarvarande tvättbuffert 2 och ta bort rören från det magnetiska racket.
- Torka pärlorna med rörlocken öppna vid 65 °C i 15 min.
- Tillsätt 60 μl elutionbuffert till varje rör och inkubera på RT i 7 min vid 1 400 varv/min. Alternativt virvlar virvel med måttlig hastighet med hjälp av en skumadapter.
- Snurra kort ner rören och placera på magnetracketen i 2 min.
- Överför 55 μl eluate till ett nytt rör utan att störa pärlorna. Eluaten innehåller det bisulfitkonverterade DNA:t. Det krävs inte att mäta DNA-koncentrationen.
- Konfigurera och köra qPCR
- Slå på qPCR-maskinen och datorn som använder dess programvara.
- På programvaruanvändargränssnittet skapar du ett nytt experiment och väljer vilket block som används för att köra experimentet.
- Välj Standardkurva som typ av experiment.
- Om tillämpligt väljer du vilken detektionskemi du vill använda. Denna analys använder TaqMan reagenser. Annars väljer du ROX som passiv referens.
- Om tillämpligt väljer du instrumentets egenskaper som standard.
- Definiera din experimentella design genom att tilldela mål (t.ex. GAPDH eller CD8 med FAM som reporter) och en icke-fluorescerande släckare.
- Tilldela exempelnamn för standarder, exempel och kontroller.
- Tilldela sedan varje brunnsposition enligt qPCR-plattan. Varje brunn kräver ett mål, till exempel CD8 eller GAPDH, och ett exempelnamn. Varje prov körs i tre exemplar och måste reflekteras på instrumentets skyltlayout.
- Tilldela varje standard aktivitetsstandarden och ange de slutliga kopieringsnumren enligt tabell 1.
- Tilldela exempel, kalibrator och referera till uppgiften Okänd.
- Ange brunnar för ingen mallkontroll som NTC eller N.
- Förbered de seriella utspädningar av lambda DNA (10 ng/μL) som ska användas som standard (se tabell 1).
- Förbered qPCR master mix cocktails, en för målet celltyp och en för GAPDH (se tabell 2). Kör alla prover, standarder och NTC-kontrollen i tre exemplar.
OBS: GAPDH används för att kvantifiera det totala antalet celler och körs parallellt med målförstärkningen. Kopior av unmetylerade regulatoriska element för CD8 B-genen mäts i CD8-analysen, FoxP3 i Treg och IL-17 i Th17. - Använd en 96 brunn tallrik för qPCR. Ladda 3 μL av mall-DNA i brunnarna först. Fyll sedan 7 μL av huvudmixen.
- Försegla plattan med en qPCR-film och snurra kort ner plattan innan du placerar den i qPCR-instrumentet.
- Kör qPCR enligt tabell 3.
- När körningen har slutförts exporterar du qPCR-data som en .txt- eller XLSX-fil.
- Analysera data med hjälp av analysmallarna för CD8-analysen och treg-analysen (se Materialtabell)för att beräkna ct-genomsnittet, ct-standardavvikelsen och kopieringsnumret.
| Inledande plasmid kopieringsnummer/3 μL | Volym | Spädnings-DNA [1] | Slutligt kopieringsnummer per 3 μL | Etikett |
| 31250 | 1000 μL | - | 31250 | STD#1 |
| 31250 | 200 μl | 800 μl | 6250 | STD#2 |
| 6250 | 200 μl | 800 μl | 1250 | STD#3 |
| 1250 | 200 μl | 800 μl | 250 | STD#4 |
| 250 | 200 μl | 800 μl | 50 | STD#5 |
| 1250 | 30 μl | 1200 μl | 30 | STD#6 [2] |
| [1] 10 ng/μL Lambda DNA i TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) | ||||
| [2] Använd STD#3 för att förbereda STD#6 | ||||
Tabell 1: Beredning av standardutspädningar. En utspädningsstandard på 4 stockar som spänner över 31250-30 exemplar bereds enligt bordet med TE/lambda DNA som spädningsmedel. Samma standardutspädningar användes för både CD8 och GAPDH. Normerna förvarades vid -20 °C.
| Reagenser | Belopp |
| Lambda DNA (50 ng/μL i TE, pH8.0) | 1 μL |
| TaqMan analys | 0,5 μl |
| Vatten, Nuclease-fri | 0,5 μl |
| Master Mix | 5 μl |
| Totala | 7 μL |
Tabell 2: Beredning av qPCR cocktail. Förbered qPCR-huvudmixen i två separata rör, en vardera för CD8 och GAPDH, exklusive mall-DNA enligt tabellen.
| Steg | Tid | Temp | Cykler |
| Pre-inkubation | 35 min | 95°C | 1X |
| Förstärkning | 15 sek | 95°C | 50X (50X) |
| 1 min | 61°C | ||
| Cooldown | 5 sek | 42°C | 1X |
Tabell 3: qPCR kör parametrar för CD8 och Treg analys. QPCR kördes enligt de parametrar som anges i tabellen.
5. Th17 analys
- DNA-rening efter bisulfitkonvertering
- Utför reningsstegen enligt beskrivningen i avsnitt 4.1.
- Lägg 25 μL elutionbuffert en elutionbuffert till varje rör och inkubera vid RT i 7 min klockan 1 400 varv/min. Alternativt virvlar virvel med måttlig hastighet med hjälp av en skumadapter.
- Snurra kort ner rören och placera på ett magnetiskt rack i 2 min.
- Överför 20 μl eluate till ett nytt rör utan att störa pärlorna. Eluaten innehåller det bisulfitkonverterade DNA:t.
- DNA-föramplning
OBS: DNA föramplning rekommenderas för låg förekomst mål för korrekt kvantifiering via qPCR19. Den Th17 metylering analys var utformad för att kräva förförstärkning av denna anledning.- Överför 2 μL av bisulfitomvandlat DNA till PCR-bandrören. Skapa ett NTC-rör med 2 μL vatten.
- Skapa föramplningshuvudmixen för alla prover (se tabell 4).
- Tillsätt 23 μl av huvudblandningen till varje rör. Täck rören, virveln och snurra kort ner rören.
- Kör föramplifikationsprotokollet på en termocycler med ett uppvärmt lock. (Tabell 5). När körningen är klar, snurra kort ner rören.
- Överför 2 μL av det förstärkta DNA:t till nya rör och tillsätt 78 μl vatten och späd proverna 1:40.
- qPCR konfigurerad och kör
- Följ avsnitt 4.2 om du vill ställa in och köra qPCR.
- Analysera data med analysmallen för Th17-analysen (se Materialtabell)för att beräkna ct-genomsnittet, ct-standardavvikelsen och kopieringsnumret.
| Reagens | Belopp |
| Vatten, Nuclease-fri | 9,5 μl |
| Snabbstart PCR Master Mix | 12,5 μl |
| Th17 PCR Primer | 1 μL |
| Totala | 23 μl |
Tabell 4: Förförstärka DNA för Th17-analysen. Förförstärkningsreaktionsblandningen förbereddes enligt tabellen.
| Steg | Tid | Temp | Cykler |
| Pre-inkubation | 35 min | 95°C | 1X |
| Denaturering | 1 min | 95°C | 12X (12X) |
| Glödgning | 45 sek | 55°C | |
| Förlängning | 30 sek | 72°C | |
| Slutlig förlängning | 10 min | 72°C | 1X |
| Hålla | Obestämd | 4°C |
Tabell 5: Förförstärkare Th17 DNA. Th17 DNA förförstärktes i 12 cykler före den faktiska qPCR.
Representative Results
Alla tre metyleringanalyser börjar med en inmatning av gDNA och resulterar i en procentandel CD8 + T-celler, Treg eller Th17 celler inom hela cellpopulationen. De data som genereras från qPCR efter bisulfitkonvertering analyserades med hjälp av den medföljande analysmallen. Den här mallen använde standardkurvorna från standardexemplen för att uppskatta kopieringsnumret för mål och totalt antal cellvärden i testproven. Procentcelltypen beräknades sedan med hjälp av formler som integrerades i analysmallarna. Figur 1 visar representativa data från CD8 + analys, som erhållits från att analysera både perifera blod mononukleära celler (PBMCs) och T-celler från tre olika givare med både flöde cytometri och den beskrivna metylering analys. Trenderna mellan de två metoderna för alla givare i båda celltyperna var likartade. Figur 2 visar representativa uppgifter från Treg-analysen. Tre renade Treg-donatorer analyserades med både metyleringsbaserad qPCR och flödescytometri och resultaten ritades på diagrammet som visas. Resultaten för båda metoderna var relativt likartade. I samtliga fall gav dock flödescytometri högre värden. Figur 3 visar jämförelsen av Th17 celler som detekteras via flödecytometri och metylering. I detta diagram finns det stimulerade och ostimulerade förhållanden för de experimentella metoderna. Celler kräver stimulering med PMA och jonomycin och behandling med en proteintransporthämmare för att öka mängden IL-17A som finns i varje cell så att den kan detekteras via flödecytometri20. Metyleringsstatus kan detekteras oavsett stimuleringsstatus. Flödecytometri gav lägre nivåer av Th17 celler jämfört med metylering. Analysens känslighet och specificitet visades av gränsen för tomma (LOB), detektionsgräns (LOD) och gränsen för antalvärden (LOQ) som visas i tabell 6.
Figur 1: Flödes- och metyleringsjämförelse av CD8+ procentsatser för både PBMC och T-celler för tre olika givare. PBMCs och T-celler från tre olika givare var analyseras för andelen CD8 + T-celler i hela befolkningen med antingen flöde cytometri eller metylering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Flödes- och metyleringsjämförelse av Treg-procentsatser för renad Treg för tre olika donatorer. Renade Treg-celler analyserades för procentandelen Treg-celler i hela populationen med antingen flödescytometri eller metylering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Jämförelse av flödes- och metylering av Th17 för stimulerade och ostimulerade experimentella grupper. Stimulerade och ostimulerade T-celler analyserades med både flödescytometri och metylering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Analys | Lob | Lod | Loq |
| CD8 | 0 | 19 | 52 |
| Gapdh (på) | 0 | 7 | 21 |
| FoxP3 (på) | 0 | 3 | 12 |
| Th17 TpG | 0 | 35 | 73 |
| Th17 CpG | 0 | 38 | 73 |
Tabell 6: LoB, LoD, LoQ av kopieringsnummer för metyleringsbaserade analyser. Analysvärdets känslighet och specificitet beskrivs av LoB-, LoD- och LoQ-värden som erhållits genom MIQE:s riktlinjer21,22. I allmänhet kan så få som 40 kopior identifieras korrekt av dessa analyser.
Discussion
Med tillkomsten av nya immunotherapeutics, det finns ett behov av standardiserade metoder för att upptäcka immuncell identitet och renhet. Bedömningsmetoder för process- och utgivningstestning som är robusta, validerade och skalbara återstår att fastställa och utgör en stor utmaning för kommersialiseringen av cellbaserade terapier. Medan flödet cytometri är för närvarande den vanligaste metoden för immuncell fenotypning, hög provkvalitet och krav kvantitet gör det svårt för regelbunden användning. Genomförandet av flödescytometri i en god tillverkningssed särbehandling (GMP) är begränsad av operatörsberoende strategier för att gating strategier och kravet på referensstandarder för varje markör som används13,14. Även automatiserad gating har visat sig förbättra analysen robusthet, är det ännu inte en väletablerad kvalitetskontroll strategi. Medan genuttryckprofilering kan också användas för att karakterisera cellterapi produktidentitet och renhet, data är semikvantitativa och arbetsintensiva. Dessutom är RNA och mikroRNA relativt mindre stabila än DNA och kan bidra till bristen på robusta och reproducerbara resultat. Således, med hjälp av epigenetiska DNA metylering status av en specifik locus ger en stabil, lätt att utföra, robust och skalbar metod för att identifiera och kvantifiera en cell typ av intresse.
Detektion av metyleringsmönster till fenotypceller bygger på tre kritiska steg: För det första kräver analysen användning av gDNA, som isoleras enligt de beskrivna metoderna. Dna av hög kvalitet krävs och om den inte används kan bisulfitkonvertering påverkas23,24. Om DNA av låg kvalitet erhålls rekommenderas ytterligare rening för att säkerställa analysens tillförlitlighet. För det andra krävs framgångsrik bisulfitomvandling av den ometylerade cytosintill uracil. Det mest kritiska steget i bisulfitkonvertering är DNA-denaturering23,25. Hög temperatur denaturering med ammoniumbisulfit, i motsats till natriumbisulfit, ökar omvandlingen effektivitet och konsistens och är den rekommenderade processen för dessa analyser25,26. Användarna måste se till att reaktionen inträffar vid 80 °C och att provblandning sker ofta. Av dessa skäl rekommenderas en digital termomixer (se Materialtabell). För det tredje måste korrekt rörteknik följas under qPCR-preparatet. Tre tekniska replikat krävs under qPCR reaktion för att följa den minsta informationen för publicering av kvantitativa realtid PCR experiment (MIQE) riktlinjer27. Införandet av mer tekniska replikat är acceptabelt men inte nödvändigt. Felaktig rörteknik och/eller inte inklusive tekniska replikat kommer att leda till otillförlitliga qPCR-resultat.
Om de kritiska stegen följs och önskade resultat fortfarande inte erhålls kan flera kontroller inom analysen användas för att identifiera problemet. Korrekt bisulfit konvertering är det viktigaste steget i denna analys. Felaktig bisulfitkonvertering skulle markeras med en misslyckad kalibreringsfaktor och/eller referensvärden som beräknas av analysmallen. Om bisulfitkonverteringen utfördes felaktigt (t.ex. om reaktionen utfördes på RT) skulle det inte bli någon förstärkning under qPCR. Dessutom skulle ingen förstärkning ses om ett fel gjordes under qPCR reaktionsberedningen (t.ex. om qPCR-huvudmixen inte lades till). Dessa två frågor kan separeras genom att undersöka standardproverna. Förstärkning i standardproverna, men inte referens, kalibrator och försöksprover, skulle tyda på att bisulfitkonverteringen inte utfördes korrekt. Ingen förstärkning i något av proverna skulle tyda på att qPCR inte utfördes korrekt.
Även om denna analys tar upp det stränga provkravet och analysvariabilitet en koppling till andra fenotypningsmetoder, flödar cytometri specifikt, finns det begränsningar som måste noteras. Den här analysen riktar sig till en enda locus som används som en unik identifierare för målcellen, som förbjuder den multiplexade analys som ofta utförs med flödescytometri. Detta gör det svårt att identifiera komplexa celltyper som Th17. Användningen av metyleringsmönster vid en enda locus har dock visat sig vara en korrekt fenotypisk markör för flera celler och har använts i flera kliniska prövningar15,16. Detta gäller särskilt i Tregs där bedöma FOXP3 metylering signaturer är en korrekt och entydig metod för att upptäcka sanna Tregs från transiently FOXP3 uttrycker celler28. Förlusten av multiplexiserad analys kompenseras av noggrannheten i loci förhördes. Framtida iterationer av analysen kan omfatta flera qPCR färgämnen och squenchers för att möjliggöra detektion av flera loci i en qPCR reaktion.
Denna analys kan användas som en alternativ metod för flöde cytometri för att bestämma cell fenotyp och identitet. Det bör noteras att denna analys inte ger de exakta värden som flöde cytometri gör (figur 1-3). Detta beror delvis på variationerna i dataanalys i samband med flödecytometri. Beroende på gating strategi, resultat från flödet cytometri kan variera avsevärt. Detta är särskilt fallet när du använder komplexa färgning protokoll för att titta på intracellulära mål, såsom IL-17, där variationskoefficienten (CV) kan vara så hög som 15%14. Mellan flera användare hade analysen som presenterades konsekvent ett CV på <15%, vilket stödde analysens robusthet och förbättrade standardiseringsfunktioner. De största skillnaderna mellan epigenetiska och flöde cytometri-baserade fenotypning ses när cell stimulering krävs(figur 3). Upptäckten av Th17 celler via flöde cytometri utfördes med hjälp av ett gemensamt protokoll för T cell stimulering och intracellulära cytokin färgning29,30,31. Skillnaderna i Th17 fenotypning mellan epigenetisk mätning och flöde cytometri kan bero på kinetik av IL-17 produktion. Medan metylering signaturer är stadig, proteinproduktion tar tid och måste finnas i tillräckliga mängder som skall detekteras av fluorescerande antikroppar20,32. Den 6 h inkubation med protein transporthämmare och cell stimulering cocktail kan behöva förlängas för att se nivån av Th17 celler upptäcks via epigenetiska-baserade fenotypning metoder. Fler studier behövs för att fastställa den exakta orsaken till att värdena inte matchar och bestämmer den mest exakta fenotypningsmetoden.
I detta betänkande beskriver vi hur man identifierar och kvantifierar immuncelltyper i en heterogen blandning av celler på ett enkelt och robust sätt. Analyserna är utformade och optimerade för potentiell användning för process- och frisättningstestning av cellbaserade terapier. De beskrivna assays uppfyller kravet på högkvalificerade råvaror som ska användas i cellterapi applikationer. Genom att ta itu med bristerna i flödet cytometri och andra molekylära metoder såsom stabilitet, provkrav, tidigare stimulering, cellulära permeabilisering för intracellulär färgning och subjektivitet av dataanalys, de beskrivna analyserna är i linje med målen kommersialisering av cellbaserade terapier.
Disclosures
Suman K. Pradhan, Jerry Guzman, Carl Dargitz, Mark Landon och Uma Lakshmipathy är anställda av Thermo Fisher Scientific. Sven Olek, Bjoern Samans och Ulrich Hoffmueller är grundare respektive anställda i företaget Epiontis. Ingen skriftlig hjälp användes vid produktionen av detta manuskript.
Acknowledgments
Projektet finansierades av Thermo Fisher Scientific Intramural grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 ml Eppendorf Safe-Lock Tubes | Eppendorf | 22363344 | |
| Analysis template for CD8 assay | Click Here | ||
| Analysis template for Th17 assay | Click Here | ||
| Analysis template for Treg assay | Click Here | ||
| Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer, blue/red/violet6/yellow | Thermo Fisher Scientific | A29004 | |
| CTS PureQuant CD8+ T-Cell Assay | Thermo Fisher Scientific | A43674 | |
| CTS PureQuant Th17 Assay | Thermo Fisher Scientific | A43676 | |
| CTS PureQuant Treg Assay | Thermo Fisher Scientific | A43675 | |
| Dynabeads SILANE Genomic DNA Kit | Thermo Fisher Scientific | 37012D | Used for genomic DNA isolation and purification after bisulfite conversion. Contains elution buffer to dilute samples. |
| DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Used as a magnetic rack during DNA isolation and purification |
| eBioscience Essential Human T cell Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42923 | |
| eBioscience Essential Human Th1/Th17 Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42927 | |
| eBioscience Essential Human Treg Phenotyping Kit | Thermo Fisher Scientific | A42925 | |
| Eppendorf SmartBlock 2 mL | Eppendorf | 5362000035 | |
| Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | Recommended sample mixer |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND 1000 | |
| Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Applied Biosystems | AM12450 | |
| QuantStudio 12S Flex | Applied Biosystems | 4470661 | |
| TE, pH 8.0, RNase-free | Thermo Fisher Scientific | AM9849 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | H2KT17113 |
References
- Hartmann, J., Schüßler-Lenz, M., Bondanza, A., Buchholz, C. J. Clinical development of CAR T cells-challenges and opportunities in translating innovative treatment concepts. EMBO Molecular Medicine. 9, 1183-1197 (2017).
- Graham, C., Jozwik, A., Pepper, A., Benjamin, R. Allogeneic CAR-T Cells: More than Ease of Access? Cells. 7, E155 (2018).
- Turtle, C. J., et al. CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B cell ALL patients. Journal of Clinical Investigation. 126, 2123-2138 (2016).
- Akalin, I., et al. Effects of Chimeric Antigen Receptor (CAR) Expression on Regulatory T Cells. Molecular Therapy. 17, S25 (2009).
- Knochelmann, H. M., et al. CAR T Cells in Solid Tumors: Blueprints for Building Effective Therapies. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Chen, M. L., et al. Regulatory T cells suppress tumor-specific CD8 T cell cytotoxicity through TGF-β signals in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 419-424 (2005).
- Muranski, P., et al. Tumor-specific Th17-polarized cells eradicate large established melanoma. Blood. 112, 362-373 (2008).
- Majchrzak, K., et al. Exploiting IL-17-producing CD4+ and CD8+ T cells to improve cancer immunotherapy in the clinic. Cancer Immunology, Immunotherapy. 65, 247-259 (2016).
- Guedan, S., et al. ICOS-based chimeric antigen receptors program bipolar TH17/TH1 cells. Blood. 124, 1070-1080 (2014).
- Vicetti Miguel, R. D., Maryak, S. A., Cherpes, T. L. Brefeldin A, but not monensin, enables flow cytometric detection of interleukin-4 within peripheral T cells responding to ex vivo stimulation with Chlamydia trachomatis. Journal of Immunological Methods. 384, 191-195 (2012).
- Lovelace, P., Maecker, H. T. Multiparameter Intracellular Cytokine Staining. Methods in Molecular Biology. 699, 165-178 (2011).
- Presicce, P., Moreno-Fernandez, M. E., Lages, C. S., Orsborn, K. I., Chougnet, C. A. Association of two clones allows for optimal detection of human FOXP3. Cytometry A. 77, 571-579 (2010).
- Pachón, G., Caragol, I., Petriz, J. Subjectivity and flow cytometric variability. Nature Reviews Immunology. 12, 396 (2012).
- Westera, L., et al. Centrally Determined Standardization of Flow Cytometry Methods Reduces Interlaboratory Variation in a Prospective Multicenter Study. Clinical and Translational Gastroenterology. 8, e126 (2017).
- Baron, U., et al. Epigenetic immune cell counting in human blood samples for immunodiagnostics. Science Translational Medicine. 10, (2018).
- Kleen, T. O., Yuan, J. Quantitative real-time PCR assisted cell counting (qPACC) for epigenetic - based immune cell quantification in blood and tissue. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3, 46 (2015).
- Rapko, S., et al. DNA methylation analysis as novel tool for quality control in regenerative medicine. Tissue Engineering. 13, 2271-2280 (2007).
- Wieczorek, G., et al. Quantitative DNA Methylation Analysis of FOXP3 as a New Method for Counting Regulatory T Cells in Peripheral Blood and Solid Tissue. Cancer Research. 69, 599-608 (2009).
- Andersson, D., et al. Properties of targeted preamplification in DNA and cDNA quantification. Expert Review of Molecular Diagnosis. 15, 1085-1100 (2015).
- Jung, T., Schauer, U., Heusser, C., Neumann, C., Rieger, C. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 159, 197-207 (1993).
- Armbruster, D. A., Pry, T. Limit of Blank, Limit of Detection and Limit of Quantitation. Clinical Biochemistry Reviews. 29, S49-S52 (2008).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55, 611-622 (2009).
- Li, Y., Tollefsbol, T. O. DNA methylation detection: Bisulfite genomic sequencing analysis. Methods in Molecular Biology. 791, 11-21 (2011).
- Warnecke, P. M., et al. Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing. Methods. 27, 101-107 (2002).
- Genereux, D. P., Johnson, W. C., Burden, A. F., Stöger, R., Laird, C. D. Errors in the bisulfite conversion of DNA: modulating inappropriate- and failed-conversion frequencies. Nucleic Acids Research. 36, e150 (2008).
- Darst, R. P., Pardo, C. E., Ai, L., Brown, K. D., Kladde, M. P. Bisulfite Sequencing of DNA. Current Protocols in Molecular Biology. 91, 7.9.1-7.9.7 (2010).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50, S1-S5 (2010).
- Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. European Journal of Immunology. 37, 2378-2389 (2007).
- Yao, Z., et al. Human IL-17: a novel cytokine derived from T cells. Journal of Immunology. 155, 5483-5486 (1995).
- Lockhart, E., Green, A. M., Flynn, J. L. IL-17 production is dominated by gammadelta T cells rather than CD4 T cells during Mycobacterium tuberculosis infection. Journal of Immunology. 177, 4662-4669 (2006).
- Liang, S. C., et al. Interleukin (IL)-22 and IL-17 are coexpressed by Th17 cells and cooperatively enhance expression of antimicrobial peptides. Journal of Experimental Medicine. 203, 2271-2279 (2006).
- Olsen, I., Sollid, L. M. Pitfalls in determining the cytokine profile of human T cells. Journal of Immunological Methods. 390, 106-112 (2013).
