该协议描述了如何使用小鼠晚期胎儿肠道器官在体外模拟吸吮到发乳过渡,培养30天。
在吸吮期结束时,许多哺乳动物物种在肠道上皮发生重大变化,与消化固体食物的能力有关。这个过程被称为吸吮到脱异的过渡,导致新生儿上皮与成人上皮的替换,这与代谢和形态调整齐头并进。这些复杂的发育变化是肠道上皮细胞固有的遗传程序的结果,但在某种程度上,可以由外在因素调节。小鼠原发性肠道上皮细胞从胎儿期晚期延长培养,在体外重述吸乳到脱脂过渡。在这里,我们描述了小鼠胎儿肠道器官培养的详细方案,最适合在体外模拟这一过程。我们描述了几种有用的检测,旨在监测与吸吮到乳化过渡相关的肠道功能随时间的变化。此外,我们还包括一个能够影响体内吸乳到切除过渡的外在因子的例子,作为调节吸吮到切除体转换时间的表示。这种体外方法可用于研究吸乳到乳除过渡的分子机制以及这一过程的调制器。重要的是,在研究中,用这种体外模型取代in活体模型有助于改进动物实验,并可能减少使用动物来研究肠道成熟过程。
在许多哺乳动物物种,包括小鼠和男性,新生儿肠道有几个特征,不同于完全成熟的肠道上皮。这些功能有助于新生儿肠细胞消化和吸收含有高脂肪和低碳水化合物的牛奶,以乳糖为主要碳水化合物。新生儿肠道上皮细胞的刷边界表示脱酸酶乳酸酶-氟辛水酶(Lct)1,以消化乳糖脱糖乳糖。吸吮期后,肠细胞适应消化富含复合碳水化合物和低脂肪的固体食物。这表现在刷边界脱乳酶表达从乳糖酶到苏克拉塞-异化酶(Sis)和特雷哈拉塞(Treh),它可以消化更复杂的碳水化合物存在于固体食物2。另一种代谢开关与牛奶中精氨酸的低浓度有关。为了提供精氨酸的需要,新生儿肠细胞表达在精氨酸生物合成,精氨酸辛酸合成酶-1(Ass1),合成精氨酸3的速率限制酶。相反,成人肠细胞表达精氨酸酶2(Arg2),一种能够催化精氨酸的酶,富含固体食物。此外,新生儿肠道上皮表达免疫球蛋白(FcRn)的新生儿Fc受体,该受体介导母体IgG从牛奶吸收到循环/血流4。FcRn的表达在吸吮到退尼过渡5期间显著下降。在小鼠中,Paneth细胞的成熟发生产后,与密码的形成和成熟重合,其特点是抗菌肽裂解体(Lyz)和德芬素6的表达。
所有这些变化都是吸吮到脱产过渡的一部分,当肠道上皮达到成熟成年状态时,在小鼠出生后逐渐到一个月大时,这个过程会逐渐发生。吸乳到结-去-从-从肠管中受到内在调节和发育设置。转录因子B淋巴细胞诱导的成熟蛋白-1(Blimp-1)在这个内在成熟过程7中起着关键作用。Blimp-1在新生儿上皮中高度表达,而其表达在吸乳至脱发过程中减少和丢失,因此可以作为新生儿肠道上皮的可靠标记。尽管是一个内在的过程,但吸乳到脱胶的过渡可以通过外部因素来调节。例如,皮质醇的合成模拟物,地塞米松,已知能加速体内肠道成熟8,9。
用于研究肠道上皮成熟(包括吸吮到脱衣过渡)的体外模型,利用具有成人肠道上皮特征的成人上皮细胞系和/或成人器官。我们最近已经证明,从晚期胎儿肠道分离的原肠上皮细胞成熟,并在体外生长为有机体10时重述吸吮至脱衣的过渡。我们进一步表明,这种肠道在体外成熟的过程以与体内相同的速度发生。最后,我们使用地塞米松以与体内研究相同的方式加速成熟过程。
在这里,我们概述了小鼠晚期胎儿肠道器官的分离和培养的精确方案。我们描述了收集长期有机体培养样本的首选方法,以及监测吸吮到乳胶体过渡的方法。该协议可用于该工艺的肠道上皮成熟和调制器的体外研究,并带来更高的吞吐量、更高的数据质量和转化价值以及减少动物使用。
该协议描述了对晚期胎儿肠道器官的培养,以模拟吸吮到发乳的过渡体外。成熟过程等于体内的速度,在一个月的文化后完成。使用定量RNA和蛋白质技术对这种培养的下游分析是详细的。
在此协议中,使用E18-E20小鼠胚胎的原肠细胞。用于为该协议生成有机物的原原小鼠细胞的发育阶段尤为重要。使用早期发育阶段将导致产生肠道球体,在很长一段时间内保持其特定的胎儿基因表达,有限地过渡到成人器官15,16。只有晚期胎儿阶段球体才能在体外转成成人器官。为了最大限度地利用外在因素对肠道成熟的影响的机会之窗,建议从胎儿晚期的肠道,而不是从出生到接触微生物和母奶的小狗的肠道。据悉,某些细菌代谢物和牛奶成分可作为成熟过程的修饰剂17。
为了获得足够的细胞来维持一个月的培养,研究从出生到成年的整个成熟过程,同时收集样本进行下游分析,应使用6-8个胚胎的肠道作为起始材料。最好使用来自同一发育阶段的胚胎来产生培养。我们不建议汇集不同的垃圾,因为发育阶段的细微差异会影响成熟基因的表达。
此处描述的协议考虑从近端和远端小肠生成有机体,以保持肠道不同部分的发展特征。作为替代方案,全肠可用于研究特定标记物的增减表达的整体成熟情况。在后一种情况下,更少的胚胎可用于分离肠道细胞,以开始培养。
该协议是利用三维有机体培养物开发的。由于有机物在培养物中经历动态生长,在通过后同时收集样品进行下游分析非常重要。在这个协议中,我们选择了通过后的第3天,因为它代表两个分裂之间的中等时间,其中有机体含有强健的芽,很少或没有细胞死亡。可以使用过用后的替代时间点,但在整个实验中应保持一致。我们不建议在通过后7天以上生长有机体,因为器官流明中死亡细胞的增加会影响结果。
在我们的实验中,我们用地塞米松作为外在因子的例子,在文献中展示和最好地研究,以加速体内肠道成熟9,18。地塞米松通过基因组和非基因组途径发挥其作用。例如,在基因组调控水平上,可以观察到Sis mRNA水平的早熟增加。在非基因组水平上,我们观察到消化酶(如沙沙酶)活性的变化。两者都符合所述的具体方面,在苏克拉塞基因活化和非基因组激活作用的肠道刷边界酶观察到在体内19。事实上,外在因子,如合成糖皮质激素,可以调节吸吮到发退过渡的某些方面,类似于在体内描述,进一步确立了小鼠胎儿肠道器官作为研究不同种类的肠道成熟调节剂的模型。
尽管人类肠道上皮的形态成熟在妊娠期22周时完成,但肠道屏障功能在儿童期前成熟,与喂养类型、微生物群和免疫反应。由于这些发育阶段的人体组织有限,体外鼠的转化价值在于,能够调节肠道成熟的因素的高通量屏幕是可能的,这个过程在吸吮哺乳动物。
重要的是,在研究中的动物伦理方面,这种模式有助于改进动物实验,因为它不包括对动物进行的干预。通过将研究问题重新设计到一个或两个文化时间点,从而允许在一种培养中测试多个组件,可以进一步减少动物的数量。
The authors have nothing to disclose.
没有。
Advanced DMEM/F12 1:1 | Invitrogen | 12634-028 | |
Arginase Activity Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK112-1KT | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 100x |
BCA protein assay Kit | Fisher | 10741395 | |
Cell lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9803S | |
Cell Recovery Solution | Corning B.V. | 354253 | |
Cell strainer 70µM | BD/VWR | 734-0003 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
EDTA | Merck | 10,84,18,250 | EDTA Titriplex III |
EGF | Invitrogen | PMG8045 | |
Ethanol | Merck | 1,00,98,31,000 | |
Glucose solution | Sigma-Aldrich | G6918 | |
Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | 100x |
Hepes | Invitrogen | 15630-056 | 1M |
Isolate II RNA Mini Kit | Bioline | BIO-52073 | |
Lactose | Sigma-Aldrich | L3625 | a-Lactose monohydrate |
Maleic Buffer | Sigma-Aldrich | M0375 | Maleic acid |
Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | D-(+)-Maltose monohydrate >99% |
Matrigel | Corning B.V. | 356231 | Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix |
Millipore water | N.A. | ||
N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100x |
n-Acetylcystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Noggin-conditioned media | Homemade | ||
o-dianisidine | Sigma-Aldrich | 191248 | |
PBS | Homemade | ||
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 0,2 U/mL |
PGO-enzyme preparation | Sigma-Aldrich | P-7119-10CAP | capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase |
p-hydroxymercuribenzoate sodium | Sigma-Aldrich | 55540 | |
Rspondin-conditioned media | Homemade | ||
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T5251 | D-Trehalose dihydrate |
Tris-HCl Buffer | Homemade | ||
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |