Этот протокол описывает, как имитировать сосание к отлучению перехода в пробирке с помощью мыши позднего плода кишечных органоидов культивируется в течение 30 дней.
В конце периода сосания, многие виды млекопитающих претерпевают значительные изменения в кишечном эпителии, которые связаны с возможностью переваривать твердую пищу. Этот процесс называется сосание к отлучению перехода и приводит к замене неонатального эпителия с эпителием для взрослых, который идет рука об руку с метаболическими и морфологическими корректировками. Эти сложные изменения в развитии являются результатом генетической программы, которая присуща кишечным эпителиальным клеткам, но может, в некоторой степени, быть модулирована нависшие стороны. Длительная культура мыши первичных кишечных эпителиальных клеток от позднего периода плода, резюмирует сосание к отлучению перехода в пробирке. Здесь мы описываем подробный протокол для мыши плода кишечной органоидной культуры лучше всего подходит для моделирования этого процесса в пробирке. Мы описываем несколько полезных анализов, предназначенных для мониторинга изменения функций кишечника, связанных с сосанием к отлучению перехода с течением времени. Кроме того, мы включаем пример экстримового фактора, который способен влиять на сосание к отлучению перехода in vivo, как представление модулирования сроков сосания к отлучению перехода в пробирке. Этот подход in vitro может быть использован для изучения молекулярных механизмов перехода от отлучения от лёгких, а также модуляторов этого процесса. Важно отметить, что в отношении животных этики в исследованиях, замена in vivo моделей этой модели in vitro способствует уточнению экспериментов на животных и, возможно, сокращению использования животных для изучения процессов созревания кишечника.
У многих видов млекопитающих, втом есть мыши и мужчины, неонатальный кишечник имеет несколько особенностей, которые отличаются от полностью зрелого эпителия кишечника. Эти функции облегчают неонатальный энтероцитов для переваривания и поглощения молока, которое содержит высокие жиры и низкие углеводы, с лактозой в качестве основного углевода. Кисть границы неонатальных кишечных эпителиальных клеток выразить disaccharidase лактазы-флоризина гидролазы (Lct)1 переварить молоко дисахарида лактозы. После периода сосания, энтероциты адаптироваться к переваривания твердой пищи, которая богата сложными углеводами и низким содержанием жира. Это проявляется переключатель в кисти границы disaccharidase выражение от лактазасы к sucrase-изомальтазы (Sis) и trehalase (Treh), который может переварить более сложные углеводы, присутствующие в твердой пищи2. Другой метаболический переключатель связан с низкой концентрацией аргинина в молоке. Чтобы обеспечить потребность в аргинине, неонатальные энтероциты выражают скорость ограничения фермента в биосинтезе аргинина, аргиносуцинат синтаза-1 (Ass1), синтезировать аргинин3. В отличие от взрослых энтероцитов экспресс аргиназы 2 (Arg2), фермент, способный катаболизации аргинин, который в изобилии в твердой пищи. Кроме того, неонатальный кишечный эпителий выражает неонатальный рецептор FC для иммуноглобулинов (FcRn), который опосредует поглощение материнской IgG из молока в циркуляцию/ кровоток4. Выражение FcRn значительно снижается во время сосание к отлучению перехода5. У мышей созревание клеток Панета происходит послеродово, совпав с образованием и созреванием склепов, и характеризуется экспрессией антимикробных пептидов лизосомы (Лиз) и дефенсинов6.
Все эти изменения являются частью сосание к отлучению перехода, процесс, происходящий постепенно после рождения до одного месяца возраста у мышей, когда кишечный эпителий достигает своего зрелого взрослого состояния. Сосание к отлучению перехода внутренне регулируется и развития установить в кишечнике трубки. Транскрипционный фактор B лимфоцитов индуцированной созревания белка-1 (Blimp-1) играет ключевую роль в этом процессе внутренней созревания7. Blimp-1 высоко выражен в неонатальном эпителии, в то время как его экспрессия уменьшается и теряется во время сосание к отлучению перехода и, следовательно, может служить надежным маркером неонатального кишечного эпителия. Несмотря на то, что внутренний процесс, сосание к отлучению перехода может быть модулировано внешними факторами. Например, синтетический аналог кортизола, дексаметазон, как известно, ускорить созревание кишечника в vivo8,9.
Текущие модели in vitro, используемые для изучения кишечного эпителиального созревания, включая переход от отлучение от отлучение, используют взрослые эпителиальные клеточные линии и/или взрослые органоиды, которые несут характеристики эпителия кишечника у взрослых. Недавно мы показали, что первичные кишечные эпителиальные клетки, изолированные от позднего кишечника плода созрели и резюмировать сосание к отлучению перехода при выращивании в пробирке, как органоиды10. Мы также показали, что этот процесс созревания кишечника в пробирке происходит в том же темпе, что и in vivo. Наконец, мы использовали дексаметазон для ускорения процесса созревания таким же образом, описанным для исследований in vivo.
Здесь мы наметили точный протокол для изоляции и культуры мыши поздних кишечных органоидов плода. Мы описываем предпочтительный способ сбора образцов для длительной органоидной культуры и методы для мониторинга сосание к отлучению перехода в пробирке. Этот протокол может быть использован для исследования in vitro кишечного эпителиального созревания и модуляторов этого процесса и приводит к более высокой пропускной способностью, повышению качества и трансляционной ценности данных и сокращению использования животных.
Этот протокол описывает культивирование поздних органов кишечника плода в течение длительного времени, чтобы имитировать сосание к отлучению перехода в пробирке. Процесс созревания равен темпам in vivo и завершается через месяц в культуре. Анализ этой культуры ниже по течению подробно описан.
В этом протоколе используются первичные клетки кишечника из эмбрионов мыши E18-E20. Особенно важна стадия развития первичных клеток мыши, используемых для генерации органоидов для этого протокола. Использование более ранней стадии развития приведет к генерации кишечных сфероидов, которые поддерживают их специфическую экспрессию генов плода в течение длительного периода времени с ограниченным переходом к взрослым органоидам15,16. Только поздние сфероиды стадии плода способны в переходе к взрослым органоидам в пробирке10. Для максимального использования возможностей в отношении воздействия экстримовых факторов на созревание кишечника рекомендуется кишечник с поздней стадии плода, а не кишечник а у рожденных щенков, подвергшихся воздействию микробов и материнского молока. Сообщается, что некоторые бактериальные метаболиты и молочные компоненты могут выступать в качестве модификаторов процесса созревания17.
Для получения достаточного количества клеток для поддержания культуры в течение одного месяца для изучения всего созревания от рождения до взрослой жизни, при сборе образцов для анализа вниз по течению, кишечник из 6-8 эмбрионов должны быть использованы в качестве исходного материала. Предпочтительно использовать эмбрионы из той же стадии развития для генерации культуры. Мы не рекомендуем объединять различные пометы, так как небольшие различия в стадии развития могут влиять на экспрессию генов созревания.
Описанный здесь протокол предусматривает органоидное поколение из проксимального и дистального тонкого кишечника для поддержания особенностей развития различных сегментов кишечника. В качестве альтернативы, весь кишечник может быть использован для исследования общего созревания в отношении увеличения / уменьшения экспрессии конкретных маркеров. В последнем случае меньшеэмбрионов может быть использовано для изоляции клеток кишечника для начала культуры.
Этот протокол разработан с использованием трехмерных органоидных культур. Поскольку органоиды проходят динамический рост в культуре, важно собирать образцы для анализа ниже по течению в то же время после прохождения. В этом протоколе, мы выбрали день 3 после прохождения, так как он представляет собой среднее время между двумя расколами, на которых органоиды содержат надежные почки и практически не клеточной смерти. Альтернативная точка времени после прохождения может быть использована, но она должна быть последовательной в течение всего эксперимента. Мы не рекомендуем выращивать органоиды более 7 дней после прохождения, так как увеличение клеток смерти в органоидном просвете может повлиять на результаты.
В наших экспериментах мы использовали дексаметазон в качестве примера восхводного фактора, который показан и лучше всего изучается в литературе для ускорения созревания кишечника в vivo9,18. Дексаметазон оказывает действие как по геномным, так и по негеномическим маршрутам. Например, на уровне геномного регулирования можно наблюдать преждевременное повышение уровня sis mRNA. На негеномическом уровне мы наблюдаем изменения в активности пищеварительных ферментов, таких как трехалаза. Оба находятся в соответствии с описанными специфическими аспектами дексаметазона на активации генов sucrase и негеномического активирования влияние на кишечные ферменты кисти границы наблюдается in vivo19. Тот факт, что экстримальные факторы, такие как синтетические глюкокортикоиды, могут модулировать некоторые аспекты сосание к отлучению перехода в органоидной культуре, подобно описанному в vivo, еще больше устанавливает органоиды кишечного плода в качестве модели для исследования различных видов модуляторов созревания кишечника.
Несмотря на то, что морфологическое созревание эпителия кишечника человека завершается внутриутробно на стадии гестационного заболевания 22 недель, функция кишечного барьера созревает до детства в тесной связи с типом кормления, развитием микробиоты и иммунный ответ. Из-за ограниченной доступности тканей человека на этих стадиях развития, переводное значение модели in vitro murine заключается в возможности высокой пропускной способности экранов факторов, способных модулировать созревание кишечника, процесс, сохраненный среди сосание млекопитающих.
Важно отметить, что в отношении этики животных в исследованиях, эта модель может способствовать уточнению экспериментов на животных, поскольку она не включает в себя вмешательства, выполняемые на животных. Количество животных может быть дополнительно сокращено путем реорганизации научно-исследовательских вопросов в один или два временных точек культуры, которые позволят тестирование нескольких компонентов в рамках одной культуры.
The authors have nothing to disclose.
Ни один.
Advanced DMEM/F12 1:1 | Invitrogen | 12634-028 | |
Arginase Activity Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK112-1KT | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 100x |
BCA protein assay Kit | Fisher | 10741395 | |
Cell lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9803S | |
Cell Recovery Solution | Corning B.V. | 354253 | |
Cell strainer 70µM | BD/VWR | 734-0003 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
EDTA | Merck | 10,84,18,250 | EDTA Titriplex III |
EGF | Invitrogen | PMG8045 | |
Ethanol | Merck | 1,00,98,31,000 | |
Glucose solution | Sigma-Aldrich | G6918 | |
Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | 100x |
Hepes | Invitrogen | 15630-056 | 1M |
Isolate II RNA Mini Kit | Bioline | BIO-52073 | |
Lactose | Sigma-Aldrich | L3625 | a-Lactose monohydrate |
Maleic Buffer | Sigma-Aldrich | M0375 | Maleic acid |
Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | D-(+)-Maltose monohydrate >99% |
Matrigel | Corning B.V. | 356231 | Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix |
Millipore water | N.A. | ||
N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100x |
n-Acetylcystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Noggin-conditioned media | Homemade | ||
o-dianisidine | Sigma-Aldrich | 191248 | |
PBS | Homemade | ||
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 0,2 U/mL |
PGO-enzyme preparation | Sigma-Aldrich | P-7119-10CAP | capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase |
p-hydroxymercuribenzoate sodium | Sigma-Aldrich | 55540 | |
Rspondin-conditioned media | Homemade | ||
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
Trehalose | Sigma-Aldrich | T5251 | D-Trehalose dihydrate |
Tris-HCl Buffer | Homemade | ||
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |