Summary
يصف هذا البروتوكول كيفيه تقليد الانتقال من الرضاعة إلى الفطام في المختبر باستخدام الماوس الاخيره الجنينية المعوية الجنين مثقف لمده 30 يوما.
Abstract
في نهاية فتره الرضاعة ، تخضع العديد من أنواع الثدييات لتغيرات كبيره في ظهاره الأمعاء المرتبطة بالقدرة علي هضم الطعام الصلب. وتسمي هذه العملية الانتقال الرضاعة إلى الفطام والنتائج في استبدال ظهاره حديثي الولادة مع ظهاره الكبار التي تسير جنبا إلى جنب مع التعديلات الايضيه والمورفولوجية. هذه التغييرات التنموية المعقدة هي نتيجة لبرنامج الوراثية التي هي متاصله في الخلايا الظهاريه المعوية ولكن يمكن ، إلى حد ما ، ان تكون التضمين من قبل عوامل خارجه. ثقافة لفترات طويلة من الخلايا الظهاريه المعوية الاوليه من الفترة الجنينية المتاخره ، وتلخص الانتقال الرضاعة إلى الفطام في المختبر. هنا ، ونحن وصف بروتوكول مفصل للثقافة organoid الجنين الفئران الأكثر ملاءمة لنمذجة هذه العملية في المختبر. ونحن نقدم العديد من الاختبارات المفيدة المصممة لمراقبه تغير وظائف الأمعاء المرتبطة بانتقال الرضاعة إلى الفطام مع مرور الوقت. بالاضافه إلى ذلك ، فاننا نقدم مثالا لعامل خارجي قادر علي التاثير علي انتقال الرضاعة إلى الفطام في الجسم المجري ، كتمثيل لتحوير توقيت الانتقال من الرضاعة إلى الفطام في المختبر. ويمكن استخدام هذا النهج في المختبر لدراسة أليات الجزيئية للانتقال الرضاعة إلى الفطام ، فضلا عن المغيرين لهذه العملية. الأهم من ذلك ، فيما يتعلق بأخلاقيات الحيوانية في مجال البحوث ، واستبدال نماذج طن فيفو من قبل هذا في نموذج المختبر يساهم في صقل التجارب الحيوانية وربما إلى انخفاض في استخدام الماشية لدراسة عمليات نضوج الأمعاء.
Introduction
في العديد من أنواع الثدييات ، بما في ذلك الفئران والرجال ، والأمعاء الوليد لديها العديد من الميزات التي تختلف عن ظهاره الأمعاء ناضجه تماما. هذه الميزات تسهل الخلايا المعوية حديثي الولادة لهضم وامتصاص الحليب ، والذي يحتوي علي الدهون العالية والكربوهيدرات المنخفضة ، مع اللاكتوز كالكربوهيدرات الرئيسية. الحدود فرشاه الخلايا الظهاريه المعوية حديثي الولادة التعبير عن تكسير اللاكتاز-phlorizin هيدرولاز (lct)1 لهضم اللاكتوز ديساكارد الحليب. بعد فتره الرضاعة ، تتكيف الخلايا المعوية لهضم الطعام الصلب الغني بالكربوهيدرات المعقدة والدهون المنخفضة. ويتجلى هذا من خلال التبديل في التعبير تكسير الحدود فرشاه من اللاكتاز إلى سوكريس-ايزوميتاز (Sis) و trehalase (Treh) ، والتي يمكن هضم الكربوهيدرات أكثر تعقيدا الموجودة في المواد الغذائية الصلبة2. ويرتبط التبديل الأيض آخر إلى تركيز منخفض من ارجينين في الحليب. لتوفير الحاجة إلى ارجينين, المعوية حديثي الولادة التعبير عن معدل الانزيم الحد في التخليق الحيوي ارجينين, أرجينينوسوكسيناتي synthase-1 (Ass1), إلى synthase ارجينين3. في المقابل, المعوية الكبار التعبير عن ارجيناز 2 (Arg2), انزيم قادر علي تقويض ارجينين التي وفيرة في الاطعمه الصلبة. وعلاوة علي ذلك ، فان ظهاره الأمعاء حديثي الولادة تعبر عن مستقبلات Fc الحديثة الولادة للجلوبولين المناعية (FcRn) ، والتي تتوسط امتصاص مفتش الام من الحليب في الدورة الدموية/مجري الدم4. التعبير عن FcRn ينخفض بشكل كبير خلال الانتقال الرضاعة إلى الفطام5. في الفئران ، ونضوج الخلايا paneth يحدث postnatally ، مصادفه مع تشكيل ونضوج الcrypts ، ويتميز التعبير عن الببتيدات المضادة للميكروبات يحلول (lyz) والمدافعين عن6.
كل هذه التغييرات هي جزء من انتقال الرضاعة إلى الفطام ، وهي عمليه تحدث تدريجيا بعد الولادة إلى شهر واحد من العمر في الفئران ، عندما تصل ظهاره الأمعاء إلى حالتها البالغة الناضجة. يتم تنظيم انتقال الرضاعة إلى الفطام بشكل جوهري ووضعها في أنبوب الأمعاء. عامل النسخ B اللمفاوية الناجمة عن نضوج البروتين-1 (المنطاد-1) يلعب دورا رئيسيا في هذه العملية النضج المتاصله7. ويعبر عن المنطاد-1 بشكل كبير في ظهاره حديثي الولادة ، في حين ان التعبير عنه ينخفض ويفقد خلال الانتقال الرضاعة إلى الفطام ، التالي يمكن ان تكون بمثابه علامة موثوق بها من ظهاره الأمعاء حديثي الولادة. وعلي الرغم من كونها عمليه جوهريه ، فان الانتقال من الرضاعة إلى الفطام يمكن ان يتم تضمينه بعوامل خارجيه. علي سبيل المثال ، من المعروف ان التناظرية الاصطناعية من الكورتيزول ، ديكساميثازون ، لتسريع نضوج الأمعاء في الجسم المجري8،9.
الحالية في المختبر النماذج المستخدمة لدراسة نضوج الظهاريه المعوية بما في ذلك الانتقال الرضاعة إلى الفطام, الاستفادة من خطوط الخلايا الظهاريه الكبار و/أو organoids الكبار التي تحمل خصائص ظهاره المعوية الكبار. وقد أظهرنا مؤخرا ان الخلايا الظهاريه المعوية الاوليه المعزولة عن الأمعاء الجنينية المتاخره تنضج وتلخص الانتقال من الرضاعة إلى الفطام عندما تنمو في المختبر كما organoids10. وأظهرنا كذلك ان هذه العملية نضوج الأمعاء في المختبر يحدث بنفس الوتيرة كما هو الحال في الجسم المجري. وأخيرا ، استخدمنا ديكساميثازون لتسريع عمليه النضج بنفس الطريقة الموصوفة في الدراسات المجرية .
هنا ، ونحن الخطوط العريضة لبروتوكول دقيق للعزل وثقافة الماوس الغدد المعوية الجنينية في وقت متاخر. ونحن نقدم وصفا للطريقة المفضلة لجمع العينات للثقافة العضوية المطولة وأساليب لمراقبه انتقال الرضاعة إلى الفطام في المختبر. ويمكن استخدام هذا البروتوكول للدراسات في المختبر من النضج الظهاريه المعوية والمغيرين لهذه العملية والنتائج في الانتاجيه العالية ، وزيادة الجودة والقيمة الانتقالية للبيانات والحد من استخدام الحيوانية.
Protocol
وقد أجريت هذه الدراسة وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية واستخدام المختبرات التي انشاتها اللجنة الاخلاقيه لتجارب الحيوانية في جامعه أمستردام في الامتثال الكامل للتشريعات الوطنية المتعلقة بالبحوث الحيوانية بعد التوجيه الأوروبي 2010/63/EU لاستخدام الماشية لأغراض علميه (ALC312).
1. عزل الجنين العضوي المعوية الصغيرة
- التضحية E18-E20 الاجنه عن طريق قطع الراس مع مقص الجراحية ، وفقا للوائح الاخلاقيه المعتمدة.
- فورا بعد القتل الرحيم ، وقطع بعناية فتح أسفل البطن من الجنين مع مقص الأمعاء وأزاله الأمعاء كله.
ملاحظه: يجب اجراء العزل مع الأمعاء بين E18 و E20 من الحمل من أجل تحقيق الانتقال السليم إلى الفطام والنضج في المختبر. - مع اثنين من ملقط صغير ، وتمتد الأمعاء. باستخدام المعدة والتذييل كادله ، تقطع الجزء القريب والبعيد من الأمعاء الصغيرة.
ملاحظه: إذا تم تشريح بعناية ، فمن الممكن لعزل القولون كذلك. قطع عليه بصرف النظر عن طريق استخدام التذييل كدليل (الشكل 1). - جعل الأمعاء مفتوحة طوليا: إصلاح الأمعاء باستخدام شفره الحلاقة وضعت بالطول وسحب الأمعاء عن طريق انزلاق ملقط (ذراع واحده من ملقط علي كل جانب من شفره الحلاقة) علي طول شفره الحلاقة. في وقت لاحق ، قطع الأمعاء المفتوحة في قطعه 1 سم.
- اعداد أنابيب 2 50 mL مع 10 مل من الجليد الباردة الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني). نقل الجزء القريب والبعيد من الأمعاء الصغيرة (والقولون ان وجدت) بشكل منفصل إلى الأنابيب. الحفاظ علي الأنابيب علي الجليد في حين تشريح الأمعاء من الفئران اضافيه. جمع كل الأجزاء المعوية من القمامة واحد معا في نفس الأنبوب.
ملاحظه: واحده القمامة وعاده ما 6-10 الاجنه. يجب الجمع بين أمعاء جميع الاجنه. وينبغي ان يكون هذا المبلغ كافيا لإنتاج 4-8 الآبار مع organoids ، في لوحه 48 البئر ، في الجزء المعوي. - المضي قدما في العزلة organoid كما هو موضح سابقا11. باختصار ، اغسل القطع المعوية بالثلج البارد ، احتضان مع 2 ملليمتر ايثيل الصوديوم حمض (أدتا) لمده 30 دقيقه في 4 °c ، فك التشفير من الانسجه عن طريق غسل بقسوة القطع مع الجليد الباردة تلفزيوني + 10 ٪ الجنين الساق المصل (FCS) ، فلتر باستخدام 70 μm مصفاه الخلية والطرد المركزي لجمع خبايا في 150 x g لمده 5 دقيقه في 4 ° c.
- لوحه 4 إلى 8 الآبار مع خبايا في هلام مصفوفة خارج الخلية ، اعتمادا علي حجم بيليه ، في لوحه دافئه 48-بئر. استخدام 20 μl من خبايا معلقه في هلام مصفوفة خارج الخلية لكل بئر. دعوانا استخراج مصفوفة الخلية هلام في 37 درجه مئوية حاضنه لمده 10 دقيقه.
ملاحظه: بالنظر إلى ان فقط 40 ٪ إلى 50 ٪ من الكريبتويدات المعزولة شكل organoids ، تهدف إلى كثافة من 250 إلى 300 العضوي في بئر. أولا أضافه هلام مصفوفة اقل خارج الخلية من الحاجة. ننظر تحت المجهر بعد platting أول بئر لتحليل ما إذا كانت كثافة التشفير معزولة مثاليه. إذا لزم الأمر ، أضافه هلام مصفوفة أكثر خارج الخلية. - في هذه الاثناء اعداد ENR المتوسطة: 14 مل من المتقدمة دولبيكو المتوسطة النسر المعدلة/لحم الخنزير F-12 (DMEM/F12) 1:1 + + + (تستكمل مع 4-(2-هيدروكسي ايثيل) حمض -1-بيبيرازينيثانيسولفونيك (HEPES) 1x ، L-الجلوتامين 0.01 M و 0.2 U/mL البنسلين/العقديات) ، 4 مل من وسائل الاعلام المكيفة, 2 مل من وسائل الاعلام المكيفة, 400 μL من B27 الملحق 1x, 200 μL من N2 الملحق 1x, 50 μL من 1.25 mM n-اسيتيل, 20 μL من 0.05 ميكروغرام/مل عامل نمو البشرة (EGF).
ملاحظه: عند زراعه القولون العضوي ، تكمله مع 50% Wnt وسائل الاعلام المكيفة. - أضافه 250 μL من ENR متوسطه لكل بئر.
2. الخياطة من العضوية الجنينية
- تغيير متوسط الثقافات 3 مرات في الأسبوع. يتم تحقيق نضوج العضو العضوي بعد شهر واحد من الثقافة.
- في اليوم الثالث بعد كل مقطع ، عد عدد خزان والأرغن باستخدام المجهر البصري. قياس ما لا يقل عن 3 ابار لكل حاله وجميع العضويات الموجودة في كل بئر.
ملاحظه: عدد خزان يقلل مع الوقت ، في حين ان عدد العضوية يزيد (الشكل 2). - المرور العضوي مره واحده في الأسبوع عن طريق التفكك الميكانيكي كما هو موضح أدناه.
- أزاله المتوسطة وأضافه 1 مل من الجليد الباردة المتقدمة DMEM/F12 1:1 + + +. جمع كل هلام مصفوفة خارج الخلية مع organoids في أنبوب 15 مل. استخدام تلميح 200 μL علي راس الطرف فلتر 1000 μL وماصه صعودا وهبوطا 20 مره لتعطيل العضوية.
- جهاز الطرد المركزي في 150 x g لمده 5 دقائق في 4 °c. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في 20 μl من هلام مصفوفة خارج الخلية في البئر. عاده ، يمكن توسيع organoids الجنينية في نسبه 1:2.
- دعوانا استخراج مصفوفة الخلية هلام لمده 5-10 دقيقه. أضافه 250 μL من ENR المتوسطة في بئر.
3. تحليل النضج في الحمض الريبي النيبالي ومستوي البروتين
- تحليل الثقافة كل 3 أيام بعد كل مقطع ، لمده شهر واحد (اي ، الوقت الذي يتحقق فيه النضج الكامل) (الشكل 3).
ملاحظه: الثقافة العضوية الجنينية ديناميكية (فيلم 1) ولتجنب الاختلاف من التجديد الطبيعي للعضويات بعد التعطيل الميكانيكي ، من الضروري جمع العينات دائما في نفس اليوم بعد المرور. -
[رنا] عزل
- جمع 3 ابار من organoids باستخدام 200 μL من الجيش النيبالي التحلل العازلة لكل تستكمل بشكل جيد مع 2 μL من β-mercaptoethanol. بعد أضافه الجيش النيبالي التحلل العازلة + β-mercaptoethanol إلى البئر ، تاكد من ان يتم نقل كل هلام مصفوفة خارج الخلية مع organoids إلى أنبوب 1.5 mL خاليه من RNase.
- دوامه بقوة والحفاظ علي-80 درجه مئوية لمده لا تزيد عن 1 شهر. عزل الحمض الريبي النيبالي باستخدام المتاحة تجاريا السيليكا العمود مجموعات.
- لزيادة الجودة RNA ، بعد خطوات الغسيل أضافه 500 μL من 80 ٪ EtOH وتخلط بلطف عن طريق عكس العمود. الطرد المركزي لمده 2 دقيقه في 11,000 x g لتجفيف العمود تماما.
ملاحظه: تاكد من غسل داخل غطاء الأنبوب مع etoh 80 ٪ من خلال تحريك الأنبوب راسا علي عقب ثلاثه إلى خمس مرات للتخلص من جميع اثار ثيوسيانات جوانيداين. - لزيادة العائد RNA ، الانتظار 1-2 دقيقه بعد تطبيق RNase خاليه من المياه قبل الطرد المركزي. أعاده elute RNA بتطبيق أول تدفق من خلال التملص إلى العمود مره ثانيه.
ملاحظه: النوعية المعزولة RNA كافيه للاستخدام في تحليل التعبير علي نطاق الجينوم. تحقق ما إذا كان رقم التكامل RNA فوق 8.
-
عزل البروتين
- جمع 5 ابار من organoids باستخدام 250 μL من حل استعاده الخلايا الباردة الجليد في أنبوب 1 15 mL. احتضان لمده 30 دقيقه علي الأقل علي الجليد لأذابه هلام مصفوفة خارج الخلية (وهذا سوف يقلل من مساهمه البروتين من هلام مصفوفة خارج الخلية).
- يغسل مع الجليد الباردة. أضافه 250 μL من الخلية تحلل المخزن المؤقت وتخزين عند-80 درجه مئوية.
ملاحظه: بعد سونيكيشن ، يمكن استخدام عينات للكشف عن نشاط الانزيم أو Blots الغربية.
-
واسطة
- جمع 2 الآبار من organoids باستخدام 250 μL من حل استعاده الخلايا الباردة الجليد في أنبوب 15 مل. احتضان لمده 30 دقيقه علي الأقل علي الجليد لأذابه هلام مصفوفة خارج الخلية (وهذا سوف يقلل من تلطيخ الخلفية). يغسل مع الجليد الباردة.
- إصلاح الهيكل العضوي باستخدام 500 μL من من 4 ٪ بارافورالديجيدي (PFA) ل 1 ح في 4 درجه مئوية. يغسل مع الجليد الباردة. المضي قدما إلى المناعية كامله organoid أو لتضمين البارافين ، وفقا للبروتوكولات المنشورة12.
ملاحظه: استخدام ماصه البلاستيك باستور للتعامل مع العضو العضوي. سيؤدي ذلك إلى تجنب تعطيل هيكلها.
4. تاثير العامل الخارجي (ديكساميثازون كمثال) علي عمليه النضج العضوي
- في اليوم الأول من الثقافة ، أضافه 0.01 M ديكساميثازون إلى الهيكل العضوي. احتضان العضو العضوي مع ديكساميثازون خلال شهر كامل من الثقافة عن طريق أضافه ديكساميثازون الجديد في كل مره يتم تغيير المتوسطة.
- تحليل التعبير الجيني
- عزل RNA كما هو موضح أعلاه. توليف ، في الوقت نفسه ، cDNA من جميع العينات التي يمكن مقارنتها (المعالجة وغير المعالجة). المضي قدما مع أسلوب qRTPCR المفضل.
- استخدام جينورم لتحديد اثنين من الجينات المرجعية الأكثر استقرارا في كل مره يتم استخدام علاج جديد علي organoids الجنين. استخدم المتوسط الهندسي للجينين المرجعيتين المختارتين لحسابات التعبير النسبي.
ملاحظه: اقتراحات من الجينات المرجعية لاختبار العضوية الجنينية الماوس: سيكلوفيكلين ، جابده ، سيكتين ، 36b4 ، Hprt ، Rpl4 ، Rpl32 ، Ppib و Tbp. - للتحقيق في كيفيه تاثير عامل خارجي معين علي نضوج الجنين بعد الولادة ، يجب تقييم كل الجينات التالية.
- تحقق ما إذا كانت علامات الجنين اللاكتاز (Lct) ، أرجينينوسوكسيناتي synthase 1 (Ass1) ، B اللمفاوية الناجمة عن البروتين النضج 1 (المنطاد-1) ومستقبلات Fc الوليد (fcrn) انخفاض في التعبير خلال الأسبوعين الأولين من الثقافة وغائبه للوقت الثقافة المتبقية (الشكل 4c) تحليل ما إذا كان يتم تغيير هذا النمط.
- تحقق ما إذا كانت علامات الكبار سوكريس-ايزوميتاز (Sis) ، ارجيناز 2 (Arg2) ، trehalase (treh) و الليزوزيم (lyz) زيادة في التعبير بعد أسبوعين من الثقافة (الشكل 4d). تحليل ما إذا كان يتم تغيير هذا النمط بواسطة عامل خارجي.
ملاحظه: ديكساميثازون هو عامل خارجي يمكن ان يسرع نضوج الغدد التناسلية الجنينية ويمكن استخدامه كعنصر تحكم إيجابي في جميع التجارب التي تهدف إلى اختبار العوامل الخارجية الأخرى.
- تحليل نشاط الانزيم
- عزل البروتين كما هو موضح أعلاه. الكشف عن النشاط ديساكتشاريداسيس المعوية وفقا للبروتوكولات التي نشرتها دالقفيست و messer13,14.
- اعداد 0.625 M ماليك-العازلة pH 6.0 (الحفاظ علي لمده 3 أشهر في 4 درجه مئوية). باستخدام هذا المخزن المؤقت ، واعداد 0.05 M اللاكتوز (أضافه ف-هيدروكسي زئبقي بنزوات الصوديوم كمثبت لمنع النشاط غالاكتوزيداز المضادة للأسمال) ؛ 0.05 M المالتوز; 0.05 m السكروز و 0.05 M trehalose.
ملاحظه: كل هذه الحلول يمكن الاحتفاظ بها لمده 5 أيام في 4 درجه مئوية. الحفاظ علي الجليد اثناء اعداد الفحص. - اعداد معايير الفحص عن طريق تمييع محلول الجلوكوز 5.56 m مع المياه نقاء للحصول علي حلول مع التركيزات التالية: 0.125 m; 0.1 M; 0.075 M; 0.05 m و 0.025 M.
ملاحظه: حل مستقر لمده 3 أشهر علي الأقل في 4 ° c. - احتضان في لوحه 96-بئر لمده 60 دقيقه في 37 درجه مئوية:
-30 μL من الليمات العضوي مع 30μL من اللاكتوز
-30 μl من محلله العضوي مع 30μl من السكروز
-30 μL من عشر مرات المخفف الليمات العضوي مع 30 μL من المالتوز
-30 μL من خمس مرات المخفف الليمات العضوي مع 30 μL من trehalase
-30 μl من محلله العضوي غير مخفف مع 30 μl من حمض الماليك ، كخلفيه عينه
-30 μL من كل معيار الجلوكوز
-30 μL من الماء فائق النقاء ، كما فارغه
-30 μl من السيطرة الايجابيه (تحسين التخفيف ؛ الانسجه المعوية الجنينية الجذعية يمكن استخدامها كعنصر تحكم للنشاط اللاكتاز في حين يمكن استخدام الانسجه المعوية الكبار التفكيك كعنصر تحكم لسوكريس ، مالتاز و trehalase)
ملاحظه: يجب اجراء التخفيف من العينات مع الخلية تحلل العازلة. الحفاظ علي العينات ولوحه علي الجليد اثناء اعداد الفحص. - لتحديد كميه الجلوكوز التي تنتجها الانزيمات الموجودة في محلله العضوي بعد الحضانة مع ركائز كل منها ، أضافه بسرعة 200 μl من حل اللون pgo وقياس الامتصاص في 450 nm كل 5 دقائق لمده 30 دقيقه في 37 درجه مئوية.
ملاحظه: جعل الحل PGO اللون الطازجة. استخدام 10 U/mL الجلوكوز-اكسيداز ، 2 ش/مل البيروكسيديز و 7.88 ملليمول/L o-diيانسون في 0.5 مول/لتر تريس-HCl العازلة في pH 7.0. يجب ان يكون الحل في درجه حرارة الغرفة عندما تضاف إلى لوحه. - حساب النشاط وفقا لمعيار الجلوكوز والصحيح لكميه إجماليه من البروتين (يحددها فحص حمض bicinchoninic (BCA)). وينبغي التعبير عن نشاط الانزيم كما μM الجلوكوز/ميكروغرامالبروتين · دقيقه-1 (الشكل 5 ب).
ملاحظه: قياس نشاط ارجيناز باستخدام مجموعه فحص نشاط ارجيناز المتاحة تجاريا.
Representative Results
ثقافة لفترات طويلة من الخلايا الظهاريه المعوية الجنينية
يعتمد البروتوكول الخاص بمحاكاة الانتقال من الرضاعة إلى الفطام في المختبر علي المعالجة الصحيحة لعضويات الاجنه اثناء الثقافة الطويلة. يتم فصل الأمعاء الدقيقة والبعيدة المعزولة عن أجنه الفاره E18-E20 كما هو مبين في (الشكل 1). عند العزلة ، يتم البذر الخلايا الظهاريه في القباب هلام مصفوفة خارج الخلية (الشكل 2). وعاده ما يستغرق أربعه مقاطع وحوالي 28-30 أيام من الثقافة لعضويات الجنين لتنضج إلى الدولة البالغة. خلال هذا الوقت ، يمكن جمع الخلايا في مراحل مختلفه من النضج (الشكل 3).
التحليل الامامي التمثيلي لانتقال الرضاعة إلى الفطام في المختبر
للتاكد من ان العضوية الجنينية المعزولة هي القريبة بوضوح أو البعيدة ، مقارنه مستوي التعبير من علامات القريبة واحد قطع المجال عضو الاسره 2 (Onecut2) و GATA ملزمه البروتين 4 (Gata4) وعلامات البعيدة الأحماض الدهنية ملزمه البروتين 6 (Fabp6) و Guanylate سيكلواسي المنشط 2a (Guca2a) بين كل من الثقافات القريبة والبعيدة Organoids (الشكل 4ا ، ب) يمكن مراقبه انتقال الرضاعة إلى الفطام في المختبر من قبل مجموعتين من الجينات: الجنين (الشكل 4 ج) وعلامات البالغين (الشكل 4c). وينبغي ان تنخفض تدريجيا علامات الجنين اثناء الثقافة ، في حين ان التعبير عن علامات الكبار ينبغي ان تزيد تدريجيا (الشكل 4ج ، د).
استخدام العامل الخارجي كمعدل للانتقال إلى الفطام في المختبر
في هذا البروتوكول ديكساميثازون هو جلوكوكورتيكويد الاصطناعية ، واستخدم كمثال علي عامل خارجي قادر علي تعديل الانتقال الرضاعة إلى الفطام في المختبر. وتشير البيانات التمثيلية في الشكل 5 إلى انه من الأفضل تحديد اثار العوامل الخارجة عن طريق اختبارات متعددة ، لأنها لا يجب ان تكون بالضرورة جينيه. علي سبيل المثال ، في حاله سوكريس-ايزوميتاز كل من الحمض الريبي النيبالي والبروتين التعبير هي المستحثة مع ديكساميثازون (الشكل 5A) في حين يتم تغيير التعبير trehalase فقط علي مستوي البروتين. (الشكل 5 ب).
الشكل 1: عزل الأمعاء الجنينية الصغيرة الفاره. (ا) صوره لأمعاء الجنين التي تم تشريحها وتمددها ، بما في ذلك المعدة والأمعاء الصغيرة القريبة والبعيدة والتذييل والقولون. يشير الخط الأسود إلى المكان الذي يجب ان تقطع فيه الأمعاء لتقسيم الأمعاء القريبة والمعوية الصغيرة البعيدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الصور المجهرية التمثيلية للثقافة العضوية الجنينية القريبة والبعيدة في اليوم الثالث واليوم 17 واليوم 28 من الثقافة. وتم الحصول علي جميع الصور في اليوم الثالث بعد المرور وإظهار الانخفاض في عدد ساعات العمل الاضافيه لخزان. شريط المقياس: 500 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الفيلم 1: فيديو تمثيلي يظهر ديناميات الثقافة العضوية الجنينية ، من اليوم 4 إلى 6 من الثقافة. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)
الشكل 3: التمثيل التخطيطي للمجموعة العضوية لتحليل نضج الأمعاء مع مرور الوقت. يجب استزراع الثقافات العضوية الجنينية القريبة والبعيدة لمده شهر واحد والمرور كل أسبوع. وينبغي جمع عينات لتحليل النضج 3 أيام بعد العزلة وكل 3 أيام بعد كل مرور. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: qRTPCRs من علامات نضوج الأمعاء في الغدد العضوية الجنينية القريبة والبعيدة. (ا) العلامات القريبة Onecut2 والGata4 يتم التعبير عنها أساسا في الثقافة العضوية القريبة بينما (ب) العلامات البعيدة Fabp6 و Guca2a يتم التعبير عنها في الغالب في الثقافة العضوية البعيدة. (ج) علامات الجنين lct، Ass1، المنطاد-1 و fcrn النقصان و (د) علامات الكبار Sis، Arg2 ، treh و lyz زيادة مع مرور الوقت في كل من الثقافات القريبة والبعيدة organoid. تمثل أشرطه الخطا SEM. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: العامل الخارجي ديكساميثازون يمكن ان تعدل نضوج العضوية الجنينية. (ا) يتم تقليل التعبير الجيني لعلامة الجنين المنطاد-1 في اليوم 12 من الثقافة في ديكساميثازون المعالجة العضوية بالمقارنة مع التحكم العضوي ، في حين ان كلا من التعبير الجيني (ب) ونشاط الانزيم (C) من علامة الكبار سوكريس-ايزوميتاز (Sis) يتم زيادة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يصف هذا البروتوكول زراعه الغدد المعوية الجنينية المتاخره لفترات طويلة لتقليد انتقال الرضاعة إلى الفطام في المختبر. عمليه النضوج تساوي السرعة في الجسم المجري وتكتمل بعد شهر واحد في الثقافة. تحليل المصب لهذه الثقافة باستخدام الحمض الريبي النيبالي الكمي وتقنيات البروتين مفصله.
في هذا البروتوكول ، يتم استخدام الخلايا المعوية الاوليه من أجنه الفاره E18-E20. المرحلة التنموية من خلايا الماوس الاوليه المستخدمة لتوليد العضوية لهذا البروتوكول مهم بشكل خاص. باستخدام مرحله النمو المبكر سوف يؤدي إلى توليد خزان المعوية التي تحافظ علي التعبير الجينات الجنينية المحددة علي مدي فتره طويلة من الزمن مع الانتقال المحدود إلى العضو العضوي البالغ15,16. فقط في وقت متاخر مرحله الجنين خزان قادره علي المرور العابر إلى العضو العضوي البالغ في المختبر10. لتعظيم نافذه الفرصة فيما يتعلق بتاثير العوامل الخارجة علي نضوج الأمعاء ، ينصح بالأمعاء من مرحله الجنين المتاخر وليس الأمعاء من المواليد الذين تعرضوا للميكروبات وحليب الام. ويقال ان بعض الأيض البكتيرية ومكونات الحليب يمكن ان تعمل كمعدلات لعمليه النضج17.
للحصول علي كميات كافيه من الخلايا للحفاظ علي الثقافة لمده شهر واحد لدراسة نضوج كامل من الولادة حتى سن الرشد ، في حين جمع عينات للتحليلات المصب ، يجب استخدام الأمعاء من 6-8 الاجنه كمواد البداية. ويفضل استخدام الاجنه من نفس المرحلة التنموية لتوليد الثقافة. لا ننصح بتجميع العديد من العوامل المختلفة حيث ان الاختلافات الطفيفة في مرحله النمو يمكن ان تؤثر علي التعبير عن جينات النضوج.
البروتوكول الموصوف هنا يفسر الجيل العضوي من الأمعاء الصغيرة القريبة والبعيدة للحفاظ علي الملامح التنموية لأجزاء مختلفه من الأمعاء. كبديل ، يمكن استخدام الأمعاء الكاملة للتحقيق في النضج الكلي فيما يتعلق بزيادة/نقصان التعبير عن علامات محدده. وفي الحالة الاخيره ، يمكن استخدام عدد اقل من الاجنه لعزل الخلايا المعوية لبدء الاستزراع.
تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام ثقافات organoid ثلاثية الابعاد. كما تخضع العضوية النمو الديناميكي في الثقافة ، فمن المهم لجمع عينات للتحليلات المصب في نفس الوقت بعد المرور. في هذا البروتوكول ، اخترنا يوم 3 بعد مرور ، كما انه يمثل الوقت المتوسط بين اثنين من الانشقاقات التي تحتوي علي العضوية العضوية براعم قويه والقليل إلى اي موت الخلية. يمكن استخدام نقطه زمنيه بديله بعد التمرير ، ولكن يجب ان تكون متناسقة اثناء التجربة بأكملها. نحن لا ننصح تزايد العضوية لأكثر من 7 أيام بعد مرور ، وزيادة خلايا الموت في التجويف organoids يمكن ان تؤثر علي النتائج.
في تجاربنا, وقد استخدمنا ديكساميثازون كمثال علي عامل خارجي الذي يظهر وأفضل درس في الأدب لتسريع نضوج الأمعاء في الجسم المجري9,18. ويمارس ديكساميثازون أثاره عبر الطرق الجينية وغير الجينية. علي سبيل المثال ، علي مستوي تنظيم الجينوم ، ويمكن ملاحظه زيادة مبكرة من مستويات mrna Sis . علي مستوي غير الجينوم ، نلاحظ التغييرات في نشاط الانزيمات الهضمية مثل trehalase. علي حد سواء وفقا لوصف جوانب محدده من ديكساميثازون علي تنشيط الجينات سوكريس وتاثير غير الجينوم تفعيل علي الانزيمات الحدود فرشاه الأمعاء لوحظ في الجسم المجري19. حقيقة ان العوامل خارج الجسم ، مثل السكرية الاصطناعية ، يمكن ان تعدل جوانب معينه من الانتقال الرضاعة إلى الفطام في الثقافة العضوية ، المثل لتلك التي وصفت في المجرية ، وكذلك يؤسس الفئران المعوية الجنينية الجنين كنموذج للتحقيق في نوع مختلف من المغيرين من نضوج الأمعاء.
علي الرغم من اكتمال النضج المورفولوجية من ظهاره الأمعاء البشرية في الرحم في مرحله الحمل من 22 أسبوعا ، وظيفة حاجز الأمعاء ينضج حتى الطفولة في علاقة وثيقة مع نوع من التغذية ، وتطوير الجراثيم الاستجابة المناعية. نظرا لمحدوديه توافر الانسجه البشرية في هذه المراحل التنموية ، تكمن القيمة الانتقالية لنموذج murine في المختبر في امكانيه وجود شاشات عاليه الانتاجيه من العوامل القادرة علي تحوير النضج المعوي ، وهي عمليه حفظت بين الثدييات الرضيعة.
ومن المهم ، فيما يتعلق بأخلاقيات الحيوانية في البحوث ، وهذا النموذج يمكن ان تسهم في صقل التجارب الحيوانية لأنها لا تشمل التدخلات التي أجريت علي الماشية. ويمكن زيادة خفض عدد الماشية عن طريق أعاده تصميم الاسئله البحثية إلى نقطه واحده أو نقطتين من الثقافة التي ستسمح باختبار مكونات متعددة ضمن ثقافة واحده.
Disclosures
="jove_content">This project was financially supported by Danone Nutricia Reserarch. I.B.R. and R.M.v.E are employees of Danone Nutricia Research.
-->ولا يعلن المؤلفون شيئا للكشف عنه.
Acknowledgments
اي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 1:1 | Invitrogen | 12634-028 | |
| Arginase Activity Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK112-1KT | |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 100x |
| BCA protein assay Kit | Fisher | 10741395 | |
| Cell lysis buffer | Cell Signaling Technology | 9803S | |
| Cell Recovery Solution | Corning B.V. | 354253 | |
| Cell strainer 70µM | BD/VWR | 734-0003 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| EDTA | Merck | 10,84,18,250 | EDTA Titriplex III |
| EGF | Invitrogen | PMG8045 | |
| Ethanol | Merck | 1,00,98,31,000 | |
| Glucose solution | Sigma-Aldrich | G6918 | |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-038 | 100x |
| Hepes | Invitrogen | 15630-056 | 1M |
| Isolate II RNA Mini Kit | Bioline | BIO-52073 | |
| Lactose | Sigma-Aldrich | L3625 | a-Lactose monohydrate |
| Maleic Buffer | Sigma-Aldrich | M0375 | Maleic acid |
| Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | D-(+)-Maltose monohydrate >99% |
| Matrigel | Corning B.V. | 356231 | Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix |
| Millipore water | N.A. | ||
| N2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 100x |
| n-Acetylcystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Noggin-conditioned media | Homemade | ||
| o-dianisidine | Sigma-Aldrich | 191248 | |
| PBS | Homemade | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | 0,2 U/mL |
| PGO-enzyme preparation | Sigma-Aldrich | P-7119-10CAP | capsules with Peroxidase/ Glucose Oxidase |
| p-hydroxymercuribenzoate sodium | Sigma-Aldrich | 55540 | |
| Rspondin-conditioned media | Homemade | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | T5251 | D-Trehalose dihydrate |
| Tris-HCl Buffer | Homemade | ||
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 |
References
- Henning, S. J. Postnatal development: coordination of feeding, digestion, and metabolism. American Journal of Physiology. 241 (3), 199-214 (1981).
- Krasinski, S. D., et al. Transcriptional regulation of intestinal hydrolase biosynthesis during postnatal development in rats. American Journal of Physiology. 267 (4), 584-594 (1994).
- Hurwitz, R., Kretchmer, N. Development of arginine-synthesizing enzymes in mouse intestine. American Journal of Physiology. 251 (1), 103-110 (1986).
- Rath, T., et al. The immunologic functions of the neonatal Fc receptor for IgG. Journal of Clinical Immunology. 33, Suppl 1 9-17 (2013).
- Martin, M. G., Wu, S. V., Walsh, J. H. Ontogenetic development and distribution of antibody transport and Fc receptor mRNA expression in rat intestine. Digestive Diseases and Sciences. 42 (5), 1062-1069 (1997).
- Bry, L., et al. Paneth cell differentiation in the developing intestine of normal and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (22), 10335-10339 (1994).
- Muncan, V., et al. Blimp1 regulates the transition of neonatal to adult intestinal epithelium. Nauret Communications. 2, 452 (2011).
- Beaulieu, J. F., Calvert, R. Influences of dexamethasone on the maturation of fetal mouse intestinal mucosa in organ culture. Comparative Biochemistry and Physiology A Comparative Physiology. 82 (1), 91-95 (1985).
- Nanthakumar, N. N., Henning, S. J. Ontogeny of sucrase-isomaltase gene expression in rat intestine: responsiveness to glucocorticoids. American Journal of Physiology. 264 (2), 306-311 (1993).
- Navis, M., et al. Mouse fetal intestinal organoids: new model to study epithelial maturation from suckling to weaning. EMBO Reports. 20 (2), (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Van Lidth de Jeude, J. F., Vermeulen, J. L., Montenegro-Miranda, P. S., Van den Brink, G. R., Heijmans, J. A protocol for lentiviral transduction and downstream analysis of intestinal organoids. Journal of Visualized Experiments. (98), e52531 (2015).
- Dahlqvist, A. Assay of intestinal disaccharidases. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 44 (2), 169-172 (1984).
- Messer, M., Dahlqvist, A. A one-step ultramicro method for the assay of intestinal disaccharidases. Anal Biochemistry. 14 (3), 376-392 (1966).
- Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
- Mustata, R. C., et al. Identification of Lgr5-independent spheroid-generating progenitors of the mouse fetal intestinal epithelium. Cell Reports. 5 (2), 421-432 (2013).
- Holscher, H. D., Bode, L., Tappenden, K. A. Human Milk Oligosaccharides Influence Intestinal Epithelial Cell Maturation In Vitro. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 296-301 (2017).
- Solomon, N. S., Gartner, H., Oesterreicher, T. J., Henning, S. J. Development of glucocorticoid-responsiveness in mouse intestine. Pediatric Research. 49 (6), 782-788 (2001).
- Kedinger, M., Simon, P. M., Raul, F., Grenier, J. F., Haffen, K. The effect of dexamethasone on the development of rat intestinal brush border enzymes in organ culture. Developmental Biology. 74 (1), 9-21 (1980).
